潘淼 孫立潔 陳祥松 袁麗霞 吳金勇 凌瑞 姚建銘

摘要[目的]對高山被孢霉利用合成培養(yǎng)基液體發(fā)酵產(chǎn)花生四烯酸（ARA）的發(fā)酵液組分進行優(yōu)化。[方法]對培養(yǎng)基中的碳源進行了優(yōu)化，對單一碳源、復合碳源進行篩選，并優(yōu)化了它們的起始濃度。

利用單因素試驗對多種無機氮源進行了篩選。對具有顯著效應的葡萄糖、甘油、酵母粉和氨基酸混合物4個因素進行最陡爬坡試驗后，利用響應面中心組合設計對顯著因素進行了優(yōu)化。[結(jié)果]最佳碳源組合為葡萄糖80 g/L+甘油20 g/L。以酵母粉為氮源，以氨基酸混合物為生長因子添加到培養(yǎng)基中，可促進高山被孢霉發(fā)酵液中ARA的積累。最佳合成培養(yǎng)基組分為：葡萄糖80 g/L，甘油12 g/L，酵母粉20 g/L，氨基酸混合物0.3 g/L。對優(yōu)化后的合成培養(yǎng)基進行了驗證，搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)7 d后檢測其產(chǎn)量，測得平均產(chǎn)量為7.084 1 g/L，與預測值接近。[結(jié)論]該研究結(jié)果可為進一步提高ARA在工業(yè)化生產(chǎn)中的得率提供研究基礎。

關鍵詞花生四烯酸；高山被孢霉；合成培養(yǎng)基；響應面法

中圖分類號TQ921文獻標識碼A文章編號0517-6611（2017）09-0001-04

Study on the Optimization of Synthetic Culture Medium for Producing Arachidonic Acid with Mortierella alpina by Using Response Surface Methodology

PAN Miao，SUN Lijie*，CHEN Xiangsong，YAO Jianming* et al

（Institute of Plasma Physics，Hefei Institutes of Physical Science， Chinese Academy of Sciences， Hefei，Anhui 230031）

Abstract[Objective] To study and optimize the ingredients of fermented liquid for synthetic culture medium for producing arachidonic acid with Mortierella alpine and increase the yield of ARA. [Method] The carbon sources in the culture medium were optimized，single carbon source and composite carbon source were screened and their initial concentrations were optimized. Many kinds of inorganic nitrogen sources were screened out by using single factor test. After steepest ascent test on four significant factors（glucose， glycerol， yeast powder and amino acid mixture）with significant effects，significant factors were optimized by using response surface center combination design. [Result] The optimum carbon source combination was 80 g/L glucose + 20 g/L glycerol. Taking yeast powder as nitrogen source，amino acid mixture added in the culture medium as a growth factor could promote the accumulation of ARA in the fermentation liquid of M. alpine. The optimized synthetic medium was composed of 80 g/L glucose， 12 g/L glycerol， 20 g/L yeast powder and 0.3 g/L amino acid mixture. The optimized synthetic medium was verified and the yield was detected after shake flask fermentation culture 7 days. The average yield of ARA was 7.084 1 g/L，which was close to the predicted value. [Conclusion] The research results can provide research basis for improving the yield of ARA in the industrial production of ARA further.

Key wordsArachidonic acid；Mortierella alpina；Synthetic culture medium；Response surface methodology

花生四烯酸（Arachidonic acid，簡稱 ARA或AA），系統(tǒng)命名為全順△- 5，8，11，14-二十碳四烯酸，屬于ω-6系列的多不飽和脂肪酸。它是人體前列腺素合成的重要前體物質(zhì)，具有酯化膽固醇、 抑制血小板聚集、 增加血管彈性、 降低血液黏度、 調(diào)節(jié)白細胞功能和提高免疫力等一系列生理功能，已經(jīng)在保健食品、 醫(yī)藥、 化妝品等領域得到廣泛應用[1-2]。天然來源中ARA含量低，不適宜大規(guī)模提取。近年來，利用高山被孢霉發(fā)酵法生產(chǎn)ARA因其產(chǎn)品中ARA含量高、且油脂組成合理等特點，一直作為工業(yè)生產(chǎn)的主要方式[3]。

在微生物發(fā)酵過程中，微生物的生長和代謝主要依靠碳源、氮源及生長因子，微生物一般可利用多種碳源和氮源，但其利用率差異較大[4]。高山被孢霉生物量的積累需消耗大量的碳源和氮源[5-6]，而油脂的積累主要依賴于消耗碳源[7]。氮源在微生物的生長及發(fā)酵過程中發(fā)揮著重要作用，通常分為快速氮源和遲效氮源[8]。研究發(fā)現(xiàn)，氮源在高山被孢霉發(fā)酵路徑中，參與多種酶的調(diào)控過程，如葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、ATP檸檬酸裂解酶、脂肪酸合成酶、6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶[9]等，當?shù)春谋M而碳源仍然存在時，高山被孢霉的生長受到限制[10]，此時脂肪開始積累作為儲存能量[11]；另外，不同氮源對發(fā)酵培養(yǎng)基pH的影響較大，同樣會影響到油脂的積累及ARA合成[12]。筆者采用響應面法對高山被孢霉產(chǎn)花生四烯酸的合成培養(yǎng)基進行了優(yōu)化，旨在為提高ARA工業(yè)化生產(chǎn)水平提供研究基礎。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌種。高山被孢霉高產(chǎn)菌G10，由中國科學院生物技術(shù)工程平臺分離獲得；菌種保存于甘油管中，置于-80 ℃冰箱內(nèi)，每6個月轉(zhuǎn)存1次。

1.1.2

原培養(yǎng)基（CK）。種子培養(yǎng)基及發(fā)酵培養(yǎng)基均為葡萄糖80 g/L，酵母粉20 g/L，pH自然。

1.2方法

1.2.1

發(fā)酵培養(yǎng)。將斜面上的孢子刮下，制備孢子懸液，取5 mL孢子懸液接種于裝有100 mL種子培養(yǎng)基的三角瓶中，于28 ℃、濕度40%～60%、搖床轉(zhuǎn)速220 r/min 條件下培養(yǎng)2 d，將生長好的種子以10%的接種量接入500 mL 裝有100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中，與種瓶培養(yǎng)條件相同，發(fā)酵7～11 d。

1.2.2測定項目與方法。

1.2.2.1

發(fā)酵菌體生物量。

搖瓶發(fā)酵結(jié)束后，使用布氏漏斗對發(fā)酵液進行抽慮；

抽干得到的菌體放入烘箱105 ℃烘干，計算干重W即為生物量。

1.2.2.2

菌體油脂產(chǎn)量。

①使用研缽將烘干的菌體進行研磨至細小的粉末，稱取上述研磨的粉末1～2 g，取精確值W0，用濾紙包住并系上棉繩，放入烘箱105 ℃烘至恒重，稱得濾紙包重量W1。

②將上述的濾紙包放入索氏提取器內(nèi)，用石油醚進行索氏提取8～10 h后取出，105 ℃烘干，稱紙包重量W2。按照以下公式計算菌體油脂百分含量：

菌體油脂百分含量（%）=（W1-W2）/ W0×100%。

③按照以下公式計算油脂產(chǎn)量：油脂產(chǎn)量（g/L）=生物量（g/L）×油脂百分含量（%）。

1.2.2.3

油脂中ARA產(chǎn)量。

①樣品處理（甲酯化）。

稱取研磨菌渣約0.1 g，加入1 mL 0.5%氫氧化鉀甲醇溶液，于60 ℃條件下水浴30 min，每5 min搖勻1次，然后加入1 mL三氟化硼甲醇溶液，置于60 ℃條件下水浴30 min，每5 min搖勻1次，此后加入2 mL正己烷混勻后再加入1 mL飽和氯化鈉溶液搖勻，反應完畢后將反應液以4 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心5 min，取上層液體進行氣相檢測。

②氣相色譜檢測條件。

DB-23ms（30.0 m×0.25 mm×0.25 μm）石英毛細管色譜柱。柱溫程序如下：90 ℃保持1 min，此后以9 ℃/min升至240 ℃，保持5 min；載氣為氮氣；流速為2.0 mL/min；進樣口溫度為250 ℃；進樣模式為分流進樣（分流比1∶10）；進樣量為1 μL；檢測器溫度為280 ℃。

③ARA百分含量的計算。

ARA百分含量的計算采用面積歸一法，即ARA在氣相檢測圖譜中的峰面積占總峰面積的百分比，用以評估ARA在總油脂含量中所占百分含量。④ARA產(chǎn)量的計算。按照以下公式計算ARA產(chǎn)量：ARA產(chǎn)量（g/L）=生物量（g/L）×油脂百分含量（%）×ARA百分含量（%）。

2結(jié)果與分析

2.1碳源優(yōu)化試驗

2.1.1單一碳源對高山被孢霉生長及發(fā)酵的影響。

選擇甘油、蔗糖、乳糖、麥芽糖、葡萄糖為單一碳源，濃度為80 g/L，培養(yǎng)基其余成分及含量不變。發(fā)酵培養(yǎng)7 d后檢測其生物量、油脂產(chǎn)量和ARA產(chǎn)量，結(jié)果表明在所有培養(yǎng)基的條件下高山被孢霉均可正常生長，但添加不同種碳源其ARA產(chǎn)量不同，結(jié)果如圖1所示。在試驗所用的5種碳源中，葡萄糖作為碳源進行發(fā)酵所得ARA產(chǎn)量最高，為6.12 g/L，其次是乳糖作為碳源發(fā)酵所得ARA產(chǎn)量（5.65 g/L），而蔗糖作為唯一碳源發(fā)酵所得ARA產(chǎn)量最低，僅為5.19 g/L。

2.1.2復合碳源對高山被孢霉生長及發(fā)酵的影響。

試驗結(jié)果表明，葡萄糖為最佳單一碳源，而麥芽糖、蔗糖、甘油作為單一碳源時ARA也可積累，但產(chǎn)量較低。以葡萄糖為主要碳源，在此基礎上分別添加其他3種碳源作為復合碳源，發(fā)酵培養(yǎng)基中氮源成分均為酵母粉20 g/L，碳源成分為：A.60 g/L葡萄糖 + 20 g/L麥芽糖；B.80 g/L葡萄糖 + 20 g/L麥芽糖；C.60 g/L葡萄糖+20 g/L蔗糖；D.80 g/L葡萄糖+20 g/L蔗糖；E.60 g/L葡萄糖+20 g/L甘油；F.80 g/L葡萄糖+20 g/L甘油。發(fā)酵培養(yǎng)7 d后檢測其生物量、油脂產(chǎn)量和ARA產(chǎn)量。從圖2可以看出，利用60 g/L葡萄糖+20 g/L蔗糖為復合碳源進行發(fā)酵時，ARA產(chǎn)量最低（5.13 g/L）。80 g/L葡萄糖 + 20 g/L甘油為高山被孢霉提供碳源，最有利于其生長及ARA積累，ARA產(chǎn)量達6.21 g/L。

2.2氮源優(yōu)化

在高山被孢霉的發(fā)酵培養(yǎng)基中，普遍使用酵母粉作為氮源，但因其成分復雜，且穩(wěn)定性差，不同生產(chǎn)批次也會略有不同，導致產(chǎn)量波動，并會對基礎理論的研究產(chǎn)生一定的影響，因此選擇合適的無機氮源至關重要。氮源主要包括NH4OH、硫酸氨（生理酸性物質(zhì)）、硝酸鉀（生理堿性物質(zhì)）、維生素、核苷混合物和氨基酸混合物。其中，核苷酸和氨基酸混合物的濃度主要參考文獻[13]并做適當調(diào)整，具體試驗組成分如下：

A.酵母粉20.0 g/L；

B.氨基酸混合物（蛋氨酸184 mg/L、胱氨酸184 mg/L、絲氨酸92 mg/L、蘇氨酸92 mg/L）；

C.硝酸鉀5.0 g/L；

D.NH4OH 2.5 g/L；

E.硫酸氨3.0 g/L；

F.維生素混合物（VB6 2 mg/L、煙酸2 mg/L、泛酸鈣2 mg/L、生物素2 mg/L、葉酸2 mg/L）。

利用上述各組組分制備的發(fā)酵液培養(yǎng)高山被孢霉7 d后進行檢測。從圖3可以看出，以無機氮源硝酸鉀、NH4OH等替代有機氮源酵母粉會明顯影響ARA產(chǎn)量，約為正常發(fā)酵（A組）ARA產(chǎn)量的30%。但是，以氨基酸混合物為氮源時，ARA產(chǎn)量達2.82 g/L，略高于其他無機氮源組，推測這是由于氨基酸混合物除了能為高山被孢霉發(fā)酵提供氮源外，還可作為生長因子參與到高山被孢霉生長及代謝過程中，因此推測在酵母粉提供氮源的基礎上，氨基酸混合物作為生長因子，可促進高山被孢霉發(fā)酵中ARA的積累。

45卷9期潘 淼等響應面法優(yōu)化高山被孢霉產(chǎn)花生四烯酸的合成培養(yǎng)基研究

2.3響應面法分析多因素發(fā)酵液組分對高山被孢霉生長和ARA積累的影響

響應面法（Response surface methodology）是利用合理的試驗設計方案，采用多元二次回歸方程擬合因素與響應值之間的函數(shù)關系，通過對回歸方程的分析優(yōu)化工藝參數(shù)，預測響應值的一種統(tǒng)計方法[14]。隨著統(tǒng)計學在各個領域的發(fā)展和應用，響應面法已經(jīng)被廣泛應用于食品學、工程學、生態(tài)學等多個領域[15]。

通過中心組合設計（Central composite design，CCD），取4因素5水平[± α（軸向點）、± 1（因素點）和中心點]，對α值進行設定，試驗取α=2采用中心組合設計對最陡爬坡試驗確定的中心區(qū)域進行考察，使用Minitab 17軟件對試驗數(shù)據(jù)進行處理分析。對響應面試驗優(yōu)化結(jié)果確定的各顯著影響因素的最佳取值及預測結(jié)果進行試驗驗證和可靠性分析，得到最終的優(yōu)化結(jié)果。

2.3.1中心試驗點的確定。

通過上述試驗得到對高山被孢霉發(fā)酵產(chǎn)量具有顯著影響的4個因素：葡萄糖（A）、甘油（B）、酵母粉（C）、氨基酸混合物（D），其中氨基酸混合物為蛋氨酸∶胱氨酸∶絲氨酸∶蘇氨酸=2∶2∶1∶1。

針對這4種因素的濃度進行最陡爬坡試驗，顯著因素的變化方向、步長和試驗結(jié)果見表1，將4種顯著因素采用擬合的回歸方程模型的系數(shù)符號及大小來確定顯著因素的步長及變化方向，使響應值快速地逼近最大響應區(qū)間。由表1可知，

利用發(fā)酵成分組合（葡萄糖80.0 g/L，甘油12.0 g/L，酵母粉20.0 g/L和氨基酸混合物0.3 g/L）進行發(fā)酵，ARA產(chǎn)量最高，因此以第4組的試驗水平作為中心組合設計試驗的中心點。

2.3.2中心組合設計以及響應面分析。

根據(jù)最陡爬坡試驗確定的響應面試驗的中心點，運用Minitab 17軟件中的組合試驗設計4因素5水平的響應面試驗，具體設計方案及試驗結(jié)果見表2和3。利用Minitab 17軟件對試驗結(jié)果進行多元回歸分析，經(jīng)過擬合得到二次回歸方程模型。

ARA產(chǎn)量（g/L）=7.076+0.191 0A-0.172 9B+0.256 6C-0.087 2D-0.355 7A2

-0.404 5B2-0.433 7C2-0.594 4D2+0.025 9AB+0111 3AC+0.295 0AD+0.092 7BC +0235 0BD -0.097 2CD

根據(jù)響應面分析三維圖，可得出碳源葡萄糖（A）、甘油（B）、氮源酵母粉（C）和生長因子氨基酸混合物（D）4因素對ARA產(chǎn)量的影響，具體如圖4所示。

通過回歸方程得到以下優(yōu)化結(jié)果：A=99.390 g/L、B=9090 g/L、C=25.495 g/L、D=0.459 6 g/L，預測最大響應值為7.166 4 g/L。從圖4可以看出，兩兩因素間的交互作用較明顯，最佳預測值在試驗考察范圍內(nèi)，因此可采用此方法所得的各因素最佳值進行試驗發(fā)酵效果驗證。

2.4驗證試驗

根據(jù)最優(yōu)化的4因素成分配制發(fā)酵培養(yǎng)基，進行3批次試驗驗證，每批次設5個平行瓶，搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)7 d后檢測ARA產(chǎn)量，結(jié)果表明平均ARA產(chǎn)量為7.084 1 g/L，與預測值（7.166 4 g/L）接近。搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)11 d后檢測ARA產(chǎn)量，平均ARA產(chǎn)量達8.031 4 g/L。

3結(jié)論

筆者對高山被孢霉發(fā)酵培養(yǎng)基進行了優(yōu)化，分別對碳源、有機氮源、無機氮源及多種生長因子的添加量進行了研究。在碳源優(yōu)化研究中，考察多種單一碳源和復合碳源對高山被孢霉產(chǎn)ARA的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)搖瓶發(fā)酵時葡萄糖是最佳的單一碳源，而80 g/L葡萄糖 + 20 g/L甘油混合則是最佳的復合碳源，使用復合碳源發(fā)酵測得ARA產(chǎn)量比使用單一葡萄糖碳源提高了18.6%。在用無機鹽及多種生長因子代替酵母粉提供氮源的研究中發(fā)現(xiàn)，酵母粉作為遲效氮源，最有利于高山被孢霉的生長及油脂積累，并能獲得較高的ARA產(chǎn)量。以無機鹽及生長因子作為氮源，雖然目前尚不能滿足工業(yè)發(fā)酵的需求，但其優(yōu)勢是成分簡單及含量穩(wěn)定，可避免工業(yè)生產(chǎn)中因酵母粉生產(chǎn)批次不同而導致ARA產(chǎn)量的不穩(wěn)定現(xiàn)象，該研究結(jié)果可為今后合成培養(yǎng)基代替?zhèn)鹘y(tǒng)培養(yǎng)基的研究奠定基礎。筆者通過響應面分析法確定了發(fā)酵培養(yǎng)基中多因素間的交互作用，得出最優(yōu)培養(yǎng)基組成，為高山被孢霉在工業(yè)生產(chǎn)中的發(fā)酵應用研究提供了理論依據(jù)。

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