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        三種常見殺菌劑對(duì)白僵菌純化以及生產(chǎn)中作用研究

        2017-05-28 21:32:11王雪馬軍蘭瑩趙東鵬張躍華趙晨晨
        農(nóng)業(yè)與技術(shù) 2017年9期
        關(guān)鍵詞:白僵菌雜菌殺菌劑

        王雪+馬軍+蘭瑩+趙東鵬+張躍華+趙晨晨

        摘 要:為篩選出適合白僵菌生產(chǎn)中使用的高效殺菌劑。以3種常見的殺菌劑作為試劑,采用抑菌圈法和生長(zhǎng)速率法,研究3種殺菌劑對(duì)白僵菌生產(chǎn)中常見雜菌的抑制效果及其對(duì)白僵菌菌絲生長(zhǎng)的影響。結(jié)果表明:在最高稀釋濃度條件下,脫氫乙酸鈉抑制3種雜菌效果最好的同時(shí),對(duì)白僵菌的抑制率也為最大。二氯異氰尿酸鈉對(duì)大腸桿菌及金黃色葡萄球菌的抑制效果優(yōu)于富馬酸二甲酯,但對(duì)枯草芽胞桿菌的抑制效果較差,且對(duì)白僵菌影響較小,可作為白僵菌殺菌劑。

        關(guān)鍵詞:白僵菌;殺菌劑;雜菌;抑制試驗(yàn)

        中圖分類號(hào):S482.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A DOI:10.11974/nyyjs.20170532001

        白僵菌屬蟲草菌科(Cordycip-itaceae),蟲草屬(Cordyceps)[1],是一類重要的昆蟲致病真菌,被廣泛應(yīng)用于農(nóng)林害蟲防治[2]。其菌落初期多呈現(xiàn)為白色,而后變?yōu)榈S色或淡紅色,背面無色、淡黃至粉紅色[3]。在分生孢子?;蚓z上聚合成在低倍鏡下即可看到的球形、卵形的孢子頭[4]。在白僵菌生物農(nóng)藥與傳統(tǒng)化學(xué)農(nóng)藥相比中,白僵菌生物農(nóng)藥具有不產(chǎn)生抗性、專一性強(qiáng)無化學(xué)農(nóng)藥殘留、和使用安全等無可比擬的優(yōu)勢(shì)[5]。但因生產(chǎn)由于大量細(xì)菌及放線菌,如大腸桿菌(Escherichia coli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus 金葡菌)、枯草芽孢桿菌(bacillus subtilis)等與白僵菌的生長(zhǎng)條件相近,常導(dǎo)致白僵菌生產(chǎn)過程中嚴(yán)重污染,影響生產(chǎn)效率。在白僵菌生產(chǎn)過程中,需要即能有效分離又不抑制白僵菌生長(zhǎng)的分離培養(yǎng)基,并能保證分離和培養(yǎng)過程中白僵菌的生長(zhǎng)不受非目標(biāo)菌的影響。該研究通過抑菌圈與生長(zhǎng)速率法,測(cè)試了3種常見殺菌劑對(duì)白僵菌生產(chǎn)中常見雜菌大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的抑制效果,同時(shí)結(jié)合3種殺菌劑對(duì)白僵菌菌絲的影響結(jié)果,篩選出抑制效果較好的藥物,以期為解決白僵菌生產(chǎn)中的實(shí)際問題提供理論基礎(chǔ)。

        1 材料與方法

        1.1 實(shí)驗(yàn)材料

        1.1.1 供試藥劑

        脫氫乙酸鈉(DHA-S)、富馬酸二甲酯(DMF)、二氯異氰尿酸鈉(SDIC)。

        1.1.2 供試菌株

        卵孢白僵菌(鹽城市神微生物菌種科技有限公司提供)。

        1.1.3 供試試劑

        依據(jù)藥劑推薦的最佳濃度范圍進(jìn)行不同濃度梯度的設(shè)置,調(diào)整至3種藥劑的稀釋倍數(shù)相同。DHA-S、DMF、SDIC配比稀釋濃度均分別為0.2mg/mL、0.4 mg/mL、

        0.6 mg/mL、0.8 mg/mL、1.0 mg/mL、1.2 mg/mL。

        1.1.4 培養(yǎng)基的配方

        PDA培養(yǎng)基瓊脂20.0g/L、馬鈴薯200g/L、葡萄糖20.0g/L;牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基:牛肉膏3.0g/L、蛋白胨5.0g/L、氯化鈉10.0 g/L。

        1.2 實(shí)驗(yàn)方法

        1.2.1 制備卵孢白僵菌懸液

        稱取0.5g卵孢白僵菌粉劑,在無菌工作條件下,放入裝有100mL無菌水的錐形瓶中,封口并震蕩3~5min,使其均勻分散,制成菌懸液。

        1.2.2 白僵菌的分離與純化

        無菌移液管移取0.1mL制好的白僵菌菌懸液,取無菌三角玻棒,把上述菌懸液在PDA平板表面涂抹均勻。將制備的帶菌平板倒置于28℃恒溫箱中培養(yǎng)2d。無菌條件下取培養(yǎng)的菌株,用接種環(huán)挑取少量菌絲于PDA培養(yǎng)皿,于28℃培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)2d。在無菌工作條件下,接種于PDA試管斜面培養(yǎng)基,置于28℃培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)2d。后置于4℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

        1.2.3 抑菌圈法測(cè)3種殺菌劑對(duì)白僵菌有害雜菌的抑制效果

        取4℃冰箱保存的3種斜面雜菌菌株,在無菌條件下,分別加入20mL無菌水,充分振搖稀釋后分別置于已滅菌的50mL三角瓶?jī)?nèi),得到3種菌懸液,涂布培養(yǎng),用滅菌鑷子夾取直徑為6mm消毒濾紙片投入不同藥液中浸藥3min,對(duì)照組將濾紙片放于無菌水中浸泡3min,每組3次重復(fù);然后將帶不同濃度藥的濾紙片分別放置牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)皿中央,并做好標(biāo)記。置于28℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),24h后采用十字劃線法測(cè)量抑制圈直徑并記錄。

        1.2.4 生長(zhǎng)速率法測(cè)3種殺菌劑對(duì)白僵菌的抑制效果

        取4℃冰箱保存的斜面白僵菌菌株,在無菌工作條件下,轉(zhuǎn)接到含有不同濃度梯度的3種殺菌劑的固體培養(yǎng)基上。以不含藥劑的PDA培養(yǎng)皿作為對(duì)照,每組3次重復(fù);觀察菌絲生長(zhǎng)情況,采用十字交叉法進(jìn)行各組菌絲直徑的確定。按以下公式計(jì)算菌絲生長(zhǎng)抑制率[6]:

        (1)

        2 結(jié)果分析

        2.1 3種殺菌劑對(duì)白僵菌有害雜菌大腸桿菌的抑制效果

        對(duì)白僵菌有害雜菌大腸桿菌的抑制試驗(yàn)結(jié)果表明:對(duì)大腸桿菌抑制效果最佳的為DHA-S,在其測(cè)試濃度范圍內(nèi),6組處理濃度的效果都很明顯,抑菌圈直徑范圍在21.7~42.0mm內(nèi);SDIC的效果次之,抑菌圈直徑變化范圍為13.1~34.2mm;而DMF效果最低,抑菌圈直徑在7.57~ 17.8mm范圍內(nèi)。且不同濃度藥品間差異較大(見圖1)。

        2.2 3種殺菌劑對(duì)白僵菌有害雜菌金黃色葡萄球菌的抑制效果

        對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制試驗(yàn)結(jié)果表明:DHA-S對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制效果最好,抑菌圈直徑范圍為27.2~41.6mm;DMF抑菌圈直徑最小為17.0 mm,1.0 mg/mL濃度的抑菌圈直徑為29.9mm,而在1.2mg/mL濃度的抑菌圈直徑為24.5mm,抑制效果與1.0mg/mL濃度液比抑制效果較差;而SDIC對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制效果較差,抑菌圈直徑范圍在8.5~22.7mm內(nèi)。每種殺菌劑6組處理濃度的抑菌圈直徑形成較大差異(見圖2)。

        2.3 3種殺菌劑對(duì)白僵菌有害雜菌枯草芽孢桿菌的抑制效果

        對(duì)枯草芽孢桿菌的抑制試驗(yàn)結(jié)果表明:3種殺菌劑的6組處理濃度的效果都很明顯,其中對(duì)枯草芽孢桿菌抑制效果最佳的為DHA-S,其抑菌圈直徑范圍為21.7~ 42.5mm;SDIC效果次之,抑菌圈直徑范圍在7.9~20.3mm,且0.6mg/ml濃度與0.8mg/mL濃度形成較大差異;而DMF效果最低,抑菌圈直徑范圍為7.6~16.2mm(見圖3)。

        2.4 3種殺菌劑對(duì)白僵菌菌絲生長(zhǎng)的抑制效果

        對(duì)白僵菌菌絲生長(zhǎng)的影響試驗(yàn)結(jié)果表明:3種殺菌劑對(duì)白僵菌菌絲生長(zhǎng)有明顯的抑制,就其抑制效果而言,在1.2mg/ml濃度條件下,DHA-S對(duì)白僵菌菌絲生長(zhǎng)的抑制效果最強(qiáng),高到100%,DMF對(duì)白僵菌菌絲生長(zhǎng)的抑制效果最弱為53.56%,SDIC可達(dá)到62.45%(見圖4)。

        圖4 對(duì)白僵菌菌絲的生長(zhǎng)抑制率

        3 結(jié)論分析

        實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:DHA-S抑制效果最好,但DHA-S對(duì)白僵菌菌落的生長(zhǎng)有較大的影響,不符合在生產(chǎn)中即能抑制雜菌生長(zhǎng)又對(duì)白僵菌菌絲生長(zhǎng)無抑制效果或抑制效果較弱的要求。SDIC和DMF對(duì)有害雜菌有一定的抑制作用,且不會(huì)對(duì)白僵菌生長(zhǎng)產(chǎn)生不良影響,都可以作為白僵菌生產(chǎn)中的抑菌劑。同時(shí)SDIC和DMF對(duì)雜菌的抑制效果不同,因此可以根據(jù)生產(chǎn)中雜菌污染情況選擇性地使用符合要求的藥劑。

        參考文獻(xiàn)

        [1]呂思行,劉吉平,湯歷,等.兩廣地區(qū)家蠶白僵菌的SSRs遺傳多樣性[J]. 昆蟲學(xué)報(bào), 2012,55(10).

        [2]Feng MG. Production, formulation and application of the entomopathogenic fungus Beauveria bassiana for insect control: current status[J]. Biocontrol Science & Technology, 1994, 4(1):3-34.

        [3]許壽濤.殺蚜球孢白僵菌孢子乳懸劑的改進(jìn)、中試及田間應(yīng)用效果評(píng)價(jià)[D]. 浙江大學(xué), 2002.

        [4]赫英偉.白僵菌的研究概況[J].黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué), 2010(4):

        145-147.

        [5]張英財(cái),農(nóng)向群,張澤華,等. 18種化學(xué)農(nóng)藥與綠僵菌相容性研究[J].中國生物防治學(xué)報(bào).2012,28(2).

        [6]楊華,徐金柱,秦長(zhǎng)生,等.3種真菌抗生素對(duì)綠僵菌和6種非目標(biāo)真菌的生長(zhǎng)影響分析[J].廣東林業(yè)科技, 2014,30(6):34-39.

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