梁瑞峰 李開(kāi)言 王曉麗 張雪俠 王 軍

(河南省中醫(yī)藥研究院中藥研究所，河南 鄭州 450004)

降壓寶藍(lán)片含藥血清對(duì)大鼠血管成纖維細(xì)胞增殖及表型轉(zhuǎn)化的影響

梁瑞峰 李開(kāi)言 王曉麗 張雪俠 王 軍

(河南省中醫(yī)藥研究院中藥研究所，河南 鄭州 450004)

目的 觀察降壓寶藍(lán)片含藥血清對(duì)大鼠血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)化的影響。方法 原代培養(yǎng)大鼠胸主動(dòng)脈外膜成纖維細(xì)胞，分為空白組、模型組、降壓寶藍(lán)片含藥血清低、中、高濃度組(體積分?jǐn)?shù)為5%、10%、15%)。用噻唑藍(lán)(MTT)法測(cè)定細(xì)胞增殖活性，羥脯氨酸法檢測(cè)膠原含量，酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法檢測(cè)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β1含量，免疫組化法檢測(cè)α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)表達(dá)情況。結(jié)果 與模型組相比，降壓寶藍(lán)片含藥血清高濃度組細(xì)胞增殖、膠原、TGF-β1分泌、α-SMA表達(dá)顯著降低(P<0.05或P<0.01)，中濃度組細(xì)胞增殖、TGF-β1含量顯著降低(P<0.05)。結(jié)論 降壓寶藍(lán)片含藥血清可抑制成纖維細(xì)胞增殖和表型轉(zhuǎn)化。

含藥血清；成纖維細(xì)胞；增殖；表型轉(zhuǎn)化

血管重構(gòu)是高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化等心血管疾病的共同病理生理過(guò)程，對(duì)其研究以往主要集中于內(nèi)膜內(nèi)皮細(xì)胞和中膜平滑肌細(xì)胞，近年來(lái)研究表明，血管重構(gòu)主要是基于外膜的病理過(guò)程〔1〕，血管損傷后血管成纖維細(xì)胞(AFs)向肌成纖維細(xì)胞(MFs)的轉(zhuǎn)化是這一過(guò)程的關(guān)鍵事件〔2〕。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β1是病理性血管重構(gòu)過(guò)程中重要的因子，其能夠促進(jìn)AFs過(guò)度增殖，誘導(dǎo)AFs向MFs轉(zhuǎn)化，上調(diào)α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)及膠原的表達(dá)〔3〕。AFs的增殖及表型轉(zhuǎn)化在血管重構(gòu)的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要角色，抑制AFs增殖和表型轉(zhuǎn)化對(duì)改善病理性血管重構(gòu)具有重要意義。降壓寶藍(lán)片主要用于肝火亢盛型高血壓的治療，臨床療效確切，動(dòng)物試驗(yàn)表明降壓寶藍(lán)片可以改善自發(fā)性高血壓大鼠的血管重構(gòu)〔4〕。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察降壓寶藍(lán)片含藥血清對(duì)血管緊張素(Ang)Ⅱ誘導(dǎo)的AFS增殖及表型轉(zhuǎn)化的影響。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 SPF級(jí)SD大鼠，雄性，體重180～200 g，購(gòu)自河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)SCXK(豫)2010-0002。

1.2 藥物與試劑 降壓寶藍(lán)片，河南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院制劑室提供，批準(zhǔn)文號(hào)：豫藥制字Z20121056，批號(hào)20130404；胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶均購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；噻唑藍(lán)(MTT)購(gòu)自Amresco公司；AngⅡ購(gòu)自Sigma公司；羥脯氨酸試劑盒購(gòu)自南京建成生物公司；TGF-β1試劑盒、α-SMA單克隆抗體、SABC試劑盒均購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。

1.3 主要儀器 全功能酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Tek公司)；細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國(guó)Forma Scientific公司)；2K15型冷凍離心機(jī)(Sigma公司)；倒置相差顯微鏡(重慶光學(xué)儀器廠)。

1.4 方法

1.4.1 含藥血清制備 20只SD大鼠隨機(jī)分為空白組和降壓寶藍(lán)片組，每組10只。按體表面積法換算動(dòng)物的等效劑量，降壓寶藍(lán)片組給予降壓寶藍(lán)片0.9 g·kg-1·d-1(等效劑量的5倍)，空白組給予相同體積的蒸餾水，灌胃給藥，每天1次，連續(xù)7 d，末次給藥后2 h，麻醉腹主動(dòng)脈取血，3 000 r/min離心10 min分離血清，56℃水浴滅活30 min，0.22 μm過(guò)濾除菌，-20℃保存?zhèn)溆谩?〕。

1.4.2 細(xì)胞培養(yǎng) SD大鼠麻醉，取胸主動(dòng)脈，無(wú)菌磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗2次，眼科剪縱向剪開(kāi)血管，血管內(nèi)膜面朝上鋪于培養(yǎng)皿上，用眼科彎鑷輕輕刮去內(nèi)膜，然后固定血管一端，用眼科彎鑷剝離中膜，余下外膜，PBS漂洗1次，將外膜置于含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，剪成1 mm2組織塊，平鋪于25 ml培養(yǎng)瓶底，翻轉(zhuǎn)使瓶底在上，貼壁培養(yǎng)4 h，添加含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液3 ml，小心翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶使組織塊浸于DMEM 培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)。5～7 d后待細(xì)胞達(dá)70%融合時(shí)胰酶消化傳代，第3～6代細(xì)胞用于試驗(yàn)。

1.4.3 實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)設(shè)空白組(體積分?jǐn)?shù)為15%的空白血清)、模型組(15%空白血清+10-6mol/L AngⅡ)、降壓寶藍(lán)片低濃度組(5%降壓寶藍(lán)片血清+10%空白血清+10-6mol/L AngⅡ)、中濃度組(10%降壓寶藍(lán)片含藥血清+5%空白血清+10-6mol/L AngⅡ)及高濃度組(15%降壓寶藍(lán)片含藥血清+10-6mol/L AngⅡ)，每組均設(shè)6個(gè)復(fù)孔。

1.4.4 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性 以1×105個(gè)/ml的AFs接種于96孔板中，另設(shè)6孔為陰性組(無(wú)細(xì)胞)，培養(yǎng)24 h后，分組處理20 h后，每孔加入5 g/L的MTT 20 μl，繼續(xù)孵育4 h，小心吸棄培養(yǎng)液，然后每孔加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)，避光震蕩10 min，用酶標(biāo)儀于570 nm處測(cè)定各孔的吸光度(OD)。

1.4.5 測(cè)定細(xì)胞膠原含量 細(xì)胞以1×105個(gè)/ml接種于48孔板培養(yǎng)24 h后，吸取0.5 ml上清液，按羥脯氨酸測(cè)試盒說(shuō)明進(jìn)行操作，測(cè)定細(xì)胞內(nèi)膠原含量。

1.4.6 ELISA檢測(cè)TGF-β1含量 細(xì)胞以1×105個(gè)/ml接種于接種于24孔板，藥物作用24 h后吸取0.5 ml上清液，采用ELISA法檢測(cè)細(xì)胞液中TGF-β1 含量。

1.4.7 免疫組化檢測(cè)α-SMA表達(dá) 將細(xì)胞爬片置于6孔板中，按照每孔1×104個(gè)的密度接種細(xì)胞，24 h后，每組加入相應(yīng)藥物，培養(yǎng)24 h后，PBS沖洗3次，4%多聚甲醛固定，PBS沖洗3次， 3%過(guò)氧化氫滅活10 min，山羊血清封閉10 min，加α-SMA單抗(濃度1∶100)，4℃過(guò)夜，PBS沖洗，加生物素標(biāo)記的二抗，室溫孵育60 min；PBS沖洗，過(guò)氧化物酶孵育60 min，PBS沖洗，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片，鏡下觀察，陽(yáng)性細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色，于鏡下隨機(jī)取6個(gè)非重疊視野，計(jì)算α-SMA陽(yáng)性細(xì)胞百分率。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析，兩兩比較用LSD檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 AFs的培養(yǎng)及形態(tài) 組織塊貼壁培養(yǎng)7 d后，開(kāi)始有細(xì)胞從組織塊邊緣爬出(圖1a)，細(xì)胞形狀不規(guī)則，多呈梭形、多角形或不規(guī)則形狀。原代細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后回縮、變圓，傳代后生長(zhǎng)較均勻，傳至3～8代后的細(xì)胞生長(zhǎng)最為旺盛(圖1b)，5～7 d后可見(jiàn)細(xì)胞呈80%融合狀態(tài)。

圖1 AFs形態(tài)觀察

2.2 降壓寶藍(lán)片含藥血清對(duì)細(xì)胞活力的影響 空白組細(xì)胞活力(0.352±0.058)與模型組(0.504±0.060)相比顯著增加(P<0.01)；與模型組相比，降壓寶藍(lán)片含藥血清中、高濃度組(0.463±0.068，0.392±0.073)細(xì)胞增殖顯著降低(P<0.05或P<0.01)，低濃度組(0.522±0.078)細(xì)胞增殖無(wú)明顯變化(P>0.05)。

2.3 降壓寶藍(lán)片含藥血清對(duì)各組細(xì)胞上清液中膠原、TGF-β1的影響 與空白組相比，模型組細(xì)胞培養(yǎng)上清液膠原、TGF-β1含量顯著升高；與模型組相比，降壓寶藍(lán)片含藥血清中濃度組(體積分?jǐn)?shù)10%)上清液中TGF-β1含量降低(P<0.05)，降壓寶藍(lán)片含藥血清高濃度組(體積分?jǐn)?shù)15%)上清液膠原、TGF-β1含量顯著升高(P<0.01)，見(jiàn)表1。

表1 降壓寶藍(lán)片含藥血清對(duì)上清液中膠原、TGF-β1含量的影響

與模型組比較:1)P<0.05,2)P<0.01

2.4 免疫組化檢測(cè)AFs中α-SMA蛋白的表達(dá) 空白組細(xì)胞α-SMA陽(yáng)性表達(dá)為陰性，模型組陽(yáng)性細(xì)胞率(18.16%)明顯升高(P<0.01)。與模型組相比，降壓寶藍(lán)片含藥血清低、中、高濃度組細(xì)胞陽(yáng)性率(15.28%，14.02%，11.12%)顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)圖2。

圖2 AFs中α-SMA蛋白的表達(dá)(DAB，×250)

3 討 論

血管主要由內(nèi)膜的內(nèi)皮細(xì)胞、中膜的平滑肌細(xì)胞、外膜的AFs以及細(xì)胞外基質(zhì)組成。血管重構(gòu)是高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化、血管內(nèi)膜損傷后再狹窄等多種心血管疾病發(fā)病的共同病理基礎(chǔ)。傳統(tǒng)的觀點(diǎn)認(rèn)為，處于血管最外層的血管外膜只對(duì)血管起支持和營(yíng)養(yǎng)作用，近年研究表明，外膜的AFs在高血壓等刺激下表型轉(zhuǎn)化為MFs，其標(biāo)志性蛋白是α-SMA〔6〕，細(xì)胞進(jìn)而發(fā)生增殖、遷移、分泌大量細(xì)胞外基質(zhì)，參與血管新生內(nèi)膜的形成〔7〕。外膜AFs是血管重構(gòu)的重要部位，并成為血管重構(gòu)防治的新靶點(diǎn)〔8〕。正常的AFs缺少TGF-β1基因的表達(dá)，血管損傷后，細(xì)胞分泌TGF-β1增加，并刺激細(xì)胞增殖〔9〕。α-SMA 是MFs的標(biāo)志蛋白，其表達(dá)的增加能反映靜止型組織細(xì)胞向活躍型MFs的轉(zhuǎn)化，通過(guò)這種轉(zhuǎn)化，細(xì)胞將獲得過(guò)表達(dá)細(xì)胞外基質(zhì)的能力〔10,11〕。本實(shí)驗(yàn)顯示，AngⅡ刺激后，AFs分泌的TGF-β1和膠原增加，細(xì)胞增殖明顯增強(qiáng)，α-SMA表達(dá)，而經(jīng)過(guò)降壓寶藍(lán)片含藥血清干預(yù)，AFs的增殖能力下降，TGF-β1和膠原分泌減少，α-SMA表達(dá)受到抑制。

綜上所述，本研究提示降壓寶藍(lán)片含藥血清可能通過(guò)抑制AFs的增殖和表型轉(zhuǎn)化從而改善血管重構(gòu),在防治血管重構(gòu)方面發(fā)揮積極作用，但具體的分子機(jī)制尚有待進(jìn)一步研究。

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〔2015-12-10修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢(mèng)園)

國(guó)家中醫(yī)藥管理局重點(diǎn)學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目(國(guó)中醫(yī)藥發(fā)〔2009〕30號(hào))；國(guó)家中醫(yī)藥管理局中醫(yī)心病學(xué)重點(diǎn)學(xué)科基礎(chǔ)研究課題(No.1304483)

王 軍(1961-)，男，博士，研究員，碩士生導(dǎo)師，主要從事中藥心血管藥理學(xué)研究。

梁瑞峰(1983-)，男，碩士，助理研究員，主要從事中藥藥理及中藥藥性研究。

R285.5

A

1005-9202(2017)09-2103-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.09.009