王 慧, 卓書洪, 高 雨

(海南省藥物研究所, ?？?570314)

胡椒根提取物對(duì)大鼠骨關(guān)節(jié)炎模型的治療作用

王 慧, 卓書洪, 高 雨

(海南省藥物研究所, 海口 570314)

目的 對(duì)比研究胡椒根兩種提取物對(duì)大鼠骨關(guān)節(jié)炎模型的治療作用。方法 建立關(guān)節(jié)內(nèi)注射木瓜蛋白酶誘發(fā)骨關(guān)節(jié)炎模型, 分別通過(guò)設(shè)立高、低劑量組、模型組及陽(yáng)性對(duì)照組等多個(gè)組別, 研究造模4周中兩種提取物各個(gè)劑量組對(duì)大鼠體質(zhì)量、膝關(guān)節(jié)直徑、關(guān)節(jié)腔表面狀態(tài)、及血清中腫瘤壞死因子α(TNF-α), 白細(xì)胞介素1β(IL-1β)、白細(xì)胞介素6(IL-6)的影響。結(jié)果 所有造模動(dòng)物在實(shí)驗(yàn)2周時(shí)體質(zhì)量增長(zhǎng)較空白對(duì)照組有較大程度減輕(P＜0.05)。除醇提物低劑量組外, 膝關(guān)節(jié)直徑變化量與模型組比較, 差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。在血清TNF-α、IL-1β、IL-6炎癥因子測(cè)定中, 揮發(fā)油高劑量組、醇提物高劑量組與空白對(duì)照組比較, 差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05), 但醇提物高劑量組數(shù)值多顯示出邊緣顯著現(xiàn)象(P接近0.05)。結(jié)論 胡椒根兩種提取物在本次試驗(yàn)中所用劑量對(duì)骨關(guān)節(jié)炎模型均有一定程度改善作用, 但揮發(fā)油提取物高劑量組效果較好。

胡椒根提取物; 骨關(guān)節(jié)炎模型; 木瓜蛋白酶; 腫瘤壞死因子α(TNF-α）;

胡椒根為胡椒科攀援性藤本植物胡椒的根部，含有豐富的活性物質(zhì)胡椒堿，此活性物質(zhì)在鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、抗炎、抗驚厥等多方面具有一定的功效。研究表明[1]，胡椒根乙醇提取物口服給藥具有顯著的鎮(zhèn)痛、抗炎、鎮(zhèn)靜及抗驚厥作用，胡椒根揮發(fā)油具有明顯的抗炎、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜作用。臨床數(shù)據(jù)亦證明[2], 胡椒根具有抗炎鎮(zhèn)痛作用, 以胡椒根為主要原料藥制成的制劑口服對(duì)軟組織損傷等關(guān)節(jié)炎、骨損傷、坐骨神經(jīng)痛等癥具有一定的治療功效[3]。

為充分研究胡椒根對(duì)骨關(guān)節(jié)炎的治療作用，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)關(guān)節(jié)內(nèi)注射木瓜蛋白酶誘發(fā)骨關(guān)節(jié)炎模型的藥效學(xué)作用，對(duì)胡椒根治療骨關(guān)節(jié)炎的功效做一綜合評(píng)價(jià)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)SD大鼠，45～55日齡，體質(zhì)量200～ 250 g，購(gòu)于廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SCXK(粵) 2013-0002]。飼養(yǎng)于海南省藥物研究所內(nèi)[SYXK(瓊) 2014-0025]。動(dòng)物飼料由長(zhǎng)沙市天勤生物技術(shù)有限公司 [SCXK(湘)2014-0011)]提供, 自由飲食。

1.2 藥品、試劑與儀器

吲哚美辛腸溶片, 25 mg/片, 廣東華南藥液集團(tuán)有限公司生產(chǎn), 批號(hào)20150107; 胡椒根醇提物及胡椒根揮發(fā)油, 海南省藥物研究所自行提取; 腫瘤壞死因子α(TNF-α), 白細(xì)胞介素1β(IL-1β)、白細(xì)胞介素6(IL-6)試劑盒均購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司, 產(chǎn)品編號(hào)分別為m1003549、m1002828、ml002859; L-半胱氨酸, 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司, 批號(hào)20150210;木瓜蛋白酶, 東恒華道生物科技有限公司提供, 批號(hào)20150405。酶標(biāo)儀(KHB-ST360, 上?？迫A儀器廠);離心機(jī)(DT5-2, 時(shí)代北利); 電子天平(AUW220D, 日本島津公司)。脫水機(jī)(TP1020)、石蠟包埋機(jī)(EG1150H)、輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)(RM2245)和攤片機(jī)(HI1210,均為德萊卡公司); 立式顯微鏡(日本索尼公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 骨關(guān)節(jié)炎模型的建立 質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%木瓜蛋白酶溶液與0.03 moL/L L-半胱氨酸按1∶1混合后靜置0.5 h配制混合液備用。分別在實(shí)驗(yàn)1 d、4 d、7 d于大鼠右膝關(guān)節(jié)腔注射該混合液20 μL，4周后完成實(shí)驗(yàn)造模[4]。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)分組及給藥劑量 造模大鼠48只，雌雄各半, 將其隨機(jī)分為模型組、陽(yáng)性對(duì)照組(吲哚美辛腸溶片)及實(shí)驗(yàn)組(揮發(fā)油高、中劑量組, 醇提物高、中劑量組), 每組8只。揮發(fā)油高、低劑量組劑量分別為2.5 g/kg、1.3 g/kg, 醇提物、低劑量組劑量分別為 3.6 g/kg、1.8 g/kg。揮發(fā)油及醇提物劑量組的劑量設(shè)置來(lái)源于胡椒根揮發(fā)油及醇提物急性毒性試驗(yàn)中LD50的計(jì)算, 各提取物的高、低劑量組劑量分別為對(duì)應(yīng)提取物的LD50的1/10、1/20。陽(yáng)性對(duì)照組：將吲哚美辛腸溶片用蒸餾水溶解，按其說(shuō)明書指示及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與人按體表面積折算的等效劑量比值計(jì)算，給藥劑量為0.016 g/kg(按人一日最大給藥量150 mg)計(jì)。另取8只正常大鼠作為空白對(duì)照組。各組予以受試藥物, 2 mL/只，每日一次，自造模后第一日起連續(xù)灌胃給藥4周。模型組及空白對(duì)照組予以蒸餾水。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 動(dòng)物狀態(tài)及體質(zhì)量變化 觀察記錄整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中動(dòng)物的活動(dòng)及死亡情況, 分別于實(shí)驗(yàn)前(0 d)、實(shí)驗(yàn)2周與實(shí)驗(yàn)4周(結(jié)束)測(cè)定大鼠的體質(zhì)量，比較各組大鼠兩個(gè)階段給藥后體質(zhì)量增長(zhǎng)的變化。體質(zhì)量增長(zhǎng)量=檢測(cè)當(dāng)日動(dòng)物體質(zhì)量-試驗(yàn)前(0 d)動(dòng)物體質(zhì)量。

1.4.2 大體觀察 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后處死全部動(dòng)物，肉眼觀察給藥部位軟骨及滑膜表面情況。

1.4.3 膝關(guān)節(jié)直徑的測(cè)定[5]分別于試驗(yàn)前(0 d)與實(shí)驗(yàn)結(jié)束測(cè)定大鼠給藥部位的膝關(guān)節(jié)直徑，觀察比較各組大鼠給藥前后膝關(guān)節(jié)直徑的變化，膝關(guān)節(jié)直徑變化量=實(shí)驗(yàn)結(jié)束(4周)膝關(guān)節(jié)直徑-試驗(yàn)前(0 d)膝關(guān)節(jié)直徑。

1.4.4 生化指標(biāo)測(cè)定[4]麻醉后大鼠下腔動(dòng)脈取血,使用一次性人體靜脈血樣采集容器收集血液，分離血清，于-20 ℃保存。酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法測(cè)定TNF-α、IL-1β、IL-6，水平。操作按照試劑盒操作說(shuō)明要求進(jìn)行。

1.4.5 病理學(xué)觀察 大體觀察結(jié)束后，各組隨機(jī)取2～3只動(dòng)物，打開關(guān)節(jié)腔后，取關(guān)節(jié)面軟骨片，常規(guī)甲醛固定，石蠟包埋切片，HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察關(guān)節(jié)滑膜及軟骨的情況。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析, Dunnett-t(方差齊)或Dunnett-T3(方差不齊)進(jìn)行正態(tài)分布檢驗(yàn)，檢驗(yàn)各組差異性, 多組間比較進(jìn)行單因素方差分析，所得數(shù)據(jù)以表示, P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 動(dòng)物狀態(tài)、體質(zhì)量的影響

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，未見動(dòng)物死亡，但在首次注射木瓜蛋白酶后2周內(nèi)均出現(xiàn)不同程度的進(jìn)食量變少、活動(dòng)量減少的情況，實(shí)驗(yàn)最后兩周有所緩解。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，造模大鼠注射關(guān)節(jié)部位出現(xiàn)一定程度的腫脹，造模的腿部部分動(dòng)物出現(xiàn)嚴(yán)重瘸行等狀態(tài)，但揮發(fā)油高劑量組及陽(yáng)性對(duì)照組大鼠尚能正常站立，在籠內(nèi)走動(dòng)，飲食、活動(dòng)狀態(tài)優(yōu)于其它的組別，模型組大鼠全體動(dòng)物均出現(xiàn)瘸行狀態(tài)。所有造模動(dòng)物在實(shí)驗(yàn)初期始重與空白對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，實(shí)驗(yàn)2周時(shí)體質(zhì)量增長(zhǎng)明顯低于空白對(duì)照組(P＜0.05)，實(shí)驗(yàn)后期體質(zhì)量增長(zhǎng)量逐漸恢復(fù)(表1)。

2.2 關(guān)節(jié)腔大體肉眼觀察及病理學(xué)觀察

動(dòng)物麻醉處死后打開關(guān)節(jié)腔，肉眼觀察可見空白對(duì)照組關(guān)節(jié)軟骨表面光滑，透明，呈極淡藍(lán)色; 模型組膝骨軟骨無(wú)光澤，破壞較嚴(yán)重，部分軟骨充血，出現(xiàn)局部糜爛，裂紋等癥狀; 陽(yáng)性對(duì)照組、揮發(fā)油高劑量組、醇提物高劑量大部分軟骨顏色淡白，部分關(guān)節(jié)軟骨光滑，透明; 揮發(fā)油低劑量組、醇提物低劑量組軟骨表面略粗糙，大多呈淡白至淡黃色，透明度較低。取部分切片進(jìn)行病理學(xué)檢查，光學(xué)顯微鏡下觀察可見空白對(duì)照組大鼠關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)完整, 軟骨表面光滑(圖1A), 模型組表面有纖維結(jié)締組織增生，細(xì)胞排列無(wú)序，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)(圖1B); 陽(yáng)性對(duì)照組軟骨變薄, 接近正常關(guān)節(jié)組織(圖1C); 揮發(fā)油高劑量組細(xì)胞纖維化，少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)(圖1D); 揮發(fā)油低劑量組、醇提物高劑量組及低劑量組均出現(xiàn)纖維結(jié)締組織增生，不等細(xì)胞排列無(wú)規(guī)則，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)(圖1E、圖1F及圖1G)。

表 1 胡椒根提取物對(duì)大鼠體質(zhì)量的影響

2.3 提取物對(duì)膝關(guān)節(jié)直徑的影響

實(shí)驗(yàn)顯示，空白對(duì)照組實(shí)驗(yàn)前后膝關(guān)節(jié)直徑無(wú)變化。各組造模大鼠給藥部位的膝關(guān)節(jié)直徑實(shí)驗(yàn)前后均有一定變化，除醇提物低劑量組外，膝關(guān)節(jié)直徑變化量與模型組比較，差異均顯著(P＜0.01);除揮發(fā)油高劑量組及醇提物高劑量組外，其他各組與陽(yáng)性對(duì)照組比較，差異均顯著(P＜0.01)(表2)。

2.4 提取物對(duì)關(guān)節(jié)炎致炎因子的影響

模型組TNF-α，IL-1β，IL-6含量均遠(yuǎn)超空白對(duì)照組(P＜0.01)(表3)。除醇提物低劑量組外，其他各組TNF-α與模型組比較，差異具有極顯著意義(P＜0.01)，醇提物低劑量組數(shù)值顯示出邊緣顯著現(xiàn)象(P=0.057); 醇提物低劑量組及模型組與陽(yáng)性對(duì)照組比較，差異均顯著(P＜0.01)。 揮發(fā)油高劑量組、醇提物高劑量組IL-β與空白組比較，差異不顯著(P＞0.05), 但醇提物高劑量組數(shù)值亦顯示出邊緣顯著現(xiàn)象(P=0.061); 各組與模型組比較, 差異顯著(P＜0.01或P＜0.05); 醇提物低劑量組及模型組與陽(yáng)性對(duì)照組比較，差異均顯著(P＜0.01)。各組IL-6與模型組比較，差異均顯著(P＜0.01或P＜0.05); 醇提物低劑量組及模型組與陽(yáng)性對(duì)照組比較，差異均有顯著(P＜0.01)(表3)。

圖 1 大鼠關(guān)節(jié)軟骨組織病理學(xué)觀察(HE×100)

表 2 胡椒根提取物對(duì)大鼠膝關(guān)節(jié)直徑的影響

3 討論

目前用于誘導(dǎo)大鼠膝骨性關(guān)節(jié)炎(OA)的主要方式包括手術(shù)及化學(xué)藥物注射法，其中膝關(guān)節(jié)腔注射藥物被譽(yù)為建立OA動(dòng)物模型的經(jīng)典方法[6]，而注射木瓜蛋白酶為常見藥物之一，模型成功率高，造模時(shí)間短，重復(fù)性好，且具有與人類骨關(guān)節(jié)炎類似的特點(diǎn)[7]。在本次實(shí)驗(yàn)方案中選用此模型，模型組發(fā)生了嚴(yán)重的炎癥反應(yīng), 證明造模具有可靠性。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，胡椒根提取物給藥后期，與空白組比較，各給藥組體質(zhì)量增長(zhǎng)基本恢復(fù)正常(P＞0.05)。在大體肉眼觀察與病理觀察中，各組均顯示不同程度的軟骨顏色變異、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)等病變。與模型組比較，胡椒根兩種提取物在按劑量給藥后，均可不同程度地降低OA模型對(duì)大鼠體質(zhì)量、膝關(guān)節(jié)直徑及血清TNF-α、IL-1β、IL-6炎癥因子的影響, 其中揮發(fā)油高劑量組、醇提物高劑量組在膝關(guān)節(jié)直徑測(cè)定及血清TNF-α、IL-1β、IL-6炎癥因子測(cè)定中，與陽(yáng)性對(duì)照組比較，差異均不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，提示兩種提取物在高劑量給藥與陽(yáng)性對(duì)照組比較，療效相當(dāng)。血清TNF-α、IL-1β、IL-6炎癥因子測(cè)定中，與空白組比較，揮發(fā)油高劑量組差異均不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05), 而醇提物高劑量組在血清IL-1β、IL-6炎癥因子測(cè)定，數(shù)值多顯示出邊緣顯著現(xiàn)象(分別為P=0.061及P=0.048), 提示醇提物高劑量與空白組比較, 差異均有不確定性, 療效與揮發(fā)油高劑量組具有一定的差異性。本項(xiàng)研究中, 兩種提取物在降低大鼠OA動(dòng)物模型膝關(guān)節(jié)直徑及血清TNF-α、IL-1β、IL-6炎癥因子方面具有一定劑量依賴關(guān)系，即高劑量?jī)?yōu)于低劑量, 且揮發(fā)油提取物療效優(yōu)于醇提取物。

表 3 胡椒根提取物對(duì)大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6表達(dá)的影響

本研究表明，胡椒根在高劑量使用上具有一定的抑制骨關(guān)節(jié)炎作用，因此，該植物藥在抑制骨關(guān)節(jié)炎研究方面有可續(xù)持性研究意義。但本研究中提取物只選取了常用藥效劑量(各提取物L(fēng)D50的1/10及1/20)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，提高劑量是否可以達(dá)到更佳治療效果未進(jìn)行探討。另外，本次試驗(yàn)中動(dòng)物模型樣本數(shù)量偏少、治療周期較短，兩種提取物的劑量設(shè)置在療效上的差異有待于進(jìn)一步研究。

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Q95-33

B

1674-5817(2017)01-0064-04

10.3969/j.issn.1674-5817.2017.01.014

2016-07-08

海南省自然科學(xué)基金(20158302)

王 慧(1984-), 女, 助理研究員, 研究方向: 藥理學(xué)。42321346@qq.com

白細(xì)胞介素1β(IL-1β）; 白細(xì)胞介素6(IL-6)