周衛(wèi)民, 朱科燕, 陳方明, 蔡月琴, 方明筍, 齊月寒, 陳民利

(浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心/比較醫(yī)學(xué)研究中心, 杭州 310053)

Tamoxifen誘導(dǎo)敲除多囊腎小鼠Pkd1基因后的腎臟病理變化

周衛(wèi)民, 朱科燕, 陳方明, 蔡月琴, 方明筍, 齊月寒, 陳民利

(浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心/比較醫(yī)學(xué)研究中心, 杭州 310053)

目的 探討Tamoxifen誘導(dǎo)下敲除Pkd1f/f:Cre轉(zhuǎn)基因小鼠多囊腎病1(Pkd1)基因前后的腎功能變化情況。方法 選用出生11 d的Pkd1f/f:Cre轉(zhuǎn)基因小鼠和Pkd1f/f野生型小鼠用Tamoxifen進(jìn)行誘導(dǎo), 分別于誘導(dǎo)后7 d、14 d、21 d檢測(cè)血清肌酐與尿素氮含量, 檢測(cè)21 d時(shí)體質(zhì)量、腎臟重量及其臟器系數(shù)。結(jié)果 誘導(dǎo)敲除后7 d小鼠血清肌酐與尿素氮含量開(kāi)始升高, 14 d、21 d小鼠血清肌酐與尿素氮含量明顯升高(P＜0.01)。21 d時(shí)誘導(dǎo)敲除小鼠腎臟系數(shù)明顯高于未敲除小鼠。 結(jié)論 Tamoxifen能使條件誘導(dǎo)敲除pkd1基因的小鼠腎功能產(chǎn)生明顯改變, 腎組織出現(xiàn)大量囊泡癥狀。

多囊腎(PKD); 轉(zhuǎn)基因小鼠; 腎功能; Tamoxifen; 誘導(dǎo)

隨著醫(yī)藥衛(wèi)生事業(yè)的發(fā)展，轉(zhuǎn)基因小鼠已成為生命科學(xué)研究中不可缺少的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。多囊腎(polycystic kidney disease，PKD)是一種常染色體顯性遺傳并以雙腎出現(xiàn)無(wú)數(shù)圓形液性囊泡為主要特征疾病。Pkd1f/f:Cre轉(zhuǎn)基因小鼠是條件敲除小鼠，在條件誘導(dǎo)敲除后，除了腎臟外，其他器官組織不會(huì)發(fā)生囊泡樣病理組織變化。為了探討在本實(shí)驗(yàn)室情況下經(jīng)Tamoxifen誘導(dǎo)后多囊腎Pkd1f/f:Cre轉(zhuǎn)基因小鼠在不同時(shí)間段腎功能的變化，本研究分別在誘導(dǎo)前后各時(shí)間點(diǎn)對(duì)Pkd1f/f:Cre轉(zhuǎn)基因小鼠和Pkd1f/f野生型小鼠進(jìn)行腎臟病理及血清肌酐(以下簡(jiǎn)稱CREA)和血清尿素氮(以下簡(jiǎn)稱BUN)進(jìn)行檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

由瑞士蘇黎世大學(xué)贈(zèng)送的Pkd1f/f:Cre轉(zhuǎn)基因小鼠，在本中心得到穩(wěn)定的保種及傳代[SCXK(浙) 2013-0054]，每只小鼠都經(jīng)PCR進(jìn)行DNA基因型鑒定。以上實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用3R原則給予人道關(guān)懷。小鼠均飼養(yǎng)于屏障系統(tǒng)的IVC籠具中，相對(duì)濕度50%～70%，溫度: 22±1℃，15～20次/h的換風(fēng)次數(shù)，12 h明暗交替，噪音小于50 dB，由電腦自動(dòng)控制溫度、濕度、光照、壓力梯度等指標(biāo)[SYXK(浙)2013-0184]。

1.2 試劑和儀器

日立7020全自動(dòng)生物化學(xué)分析儀, 日本日立公司; HM 335E型輪轉(zhuǎn)切片，德國(guó)Microm公司; Leica ST501染色機(jī)，德國(guó)Leica公司; AP280組織包埋機(jī)、全自動(dòng)脫水機(jī)，德國(guó)Microm公司; AG204-電子分析天平，瑞士METTLER公司。BUN試劑盒: 07248/00002221, CREA試劑盒:171036/50003007, 生產(chǎn)廠家:德賽診斷系統(tǒng)(上海)有限公司，Tamoxifen和棉籽油由美國(guó)Sigma公司提供。

1.3 Tamoxifen誘導(dǎo)

出生11 d的Pkd1f/f:Cre轉(zhuǎn)基因小鼠和Pkd1f/f野生型小鼠經(jīng)腹腔注射Tamoxifen 10 mg/kg, (Tamoxifen用棉籽油溶解)。

1.4 CREA和BUN測(cè)定

各組小鼠在Tamoxifen誘導(dǎo)后7 d、14 d、21 d,在小鼠頜下靜脈處用采血針采血, 經(jīng)3 000 r/min離心10 min，分離上清血清，用日立7020全自動(dòng)生物化學(xué)分析儀對(duì)CREA和BUN測(cè)定。

1.5 腎組織的臟器系數(shù)

Tamoxifen誘導(dǎo)后21 d，各組小鼠進(jìn)行稱重、采用CO2施行安死術(shù), 解剖取腎臟組織, 稱重, 并計(jì)算臟器系數(shù)(=臟器重量/體質(zhì)量)。

1.6 組織病理學(xué)觀察

取腎臟組織用體積分?jǐn)?shù)10%中性甲醛溶液固定24 h后, 乙醇脫水, 石蠟包埋, 切片, 進(jìn)行HE染色和PAS染色, 光學(xué)顯微鏡下觀察腎組織病理學(xué)變化。

1.7 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果

2.1 血清CREA變化

Tamoxifen誘導(dǎo)后7 d, Pkd1f/f:Cre誘導(dǎo)組CREA與Pkd1f/f:Cre未誘導(dǎo)組及Pkd1f/f野生型組比較有升高趨勢(shì)(P＞0.05); 誘導(dǎo)后14 d、21 d, Pkd1f/f:Cre誘導(dǎo)組CREA與Pkd1f/f:Cre未誘導(dǎo)組及Pkd1f/f野生型組比較，有極顯著升高(P＜0.01); 各時(shí)間點(diǎn)CREA在Pkd1f/f:Cre未誘導(dǎo)組與Pkd1f/f野生型誘導(dǎo)組和未誘導(dǎo)組間比較無(wú)明顯差異, Pkd1f/f野生型誘導(dǎo)組與Pkd1f/f未誘導(dǎo)組比較無(wú)明顯差異(表1)。

2.2 血清BUN變化

Tamoxifen誘導(dǎo)后7 d, Pkd1f/f:Cre誘導(dǎo)組BUN與Pkd1f/f:Cre未誘導(dǎo)組及Pkd1f/f野生型組比較有升高趨勢(shì)(P＞0.05), 與Pkd1f/f野生型未誘導(dǎo)組比較有顯著差異(P＜0.05)。誘導(dǎo)后14 d、21 d, Pkd1f/f:Cre誘導(dǎo)組BUN與Pkd1f/f:Cre未誘導(dǎo)組及Pkd1f/f野生型組比較有極顯著升高(P＜0.01); 其他三組間比較無(wú)明顯差異(表2)。

2.3 體質(zhì)量、腎臟重量及系數(shù)

Tamoxifen誘導(dǎo)后21 d, Pkd1f/f:Cre誘導(dǎo)組體質(zhì)量與Pkd1f/f:Cre未誘導(dǎo)組、Pkd1f/f野生型誘導(dǎo)組、Pkd1f/f野生型未誘導(dǎo)組比較有極顯著減輕(P＜0.01); Pkd1f/f:Cre誘導(dǎo)組腎臟重、腎臟系數(shù)與Pkd1f/f:Cre未誘導(dǎo)組、Pkd1f/f野生型誘導(dǎo)組、Pkd1f/f野生型未誘導(dǎo)組比較有極顯著增加(P＜0.01); 體質(zhì)量、腎臟重量及系數(shù)在其余三組間比較無(wú)差異(表3)。

2.4 腎臟組織病理學(xué)觀察

Pkd1f/f:Cre小鼠經(jīng)Tamoxifen誘導(dǎo)后產(chǎn)生多嚢腎，腎體積比沒(méi)有囊腫的腎大1倍左右，包膜緊張，顏色變淡，呈現(xiàn)水腫的病理變化，并見(jiàn)腎表面粗糙坑洼(圖1 A1、A2); 多嚢腎腎皮質(zhì)層充滿圓形囊腫, 其大小不一, 圓囊內(nèi)充滿液體，在光學(xué)顯微鏡下，可見(jiàn)多嚢腎僅在各圓形囊腫間存在少量的完整腎結(jié)構(gòu)，呈現(xiàn)腎小球硬化，腎小管萎縮、腎間質(zhì)纖維化，氣球樣變性, 白細(xì)胞浸潤(rùn)等(圖1B1、C1)。無(wú)囊腫腎臟表面光滑，色澤紅潤(rùn)，腎組織結(jié)構(gòu)完整，腎小球、腎小管排例有序，清晰可見(jiàn)(圖1B2、C2)。

表 1 小鼠血清CREA變化Table 1 Serum CREA changes of mice μmol/L

表 2 小鼠血清BUN變化Table 2 Serum BUN changes of mice mmol/L

表 3 誘導(dǎo)21 d小鼠體質(zhì)量、腎臟重量及系數(shù)變化Table 3 Body weight, kidney weight and organ coefficients of mice after 21 days induction

3 討論

多囊腎是一種常染色體顯性遺傳腎病, 其兩側(cè)腎臟均可發(fā)生囊腫, 還會(huì)影響其他器官, 可發(fā)生肝、脾、胰囊腫，還會(huì)形成顱內(nèi)動(dòng)脈瘤、發(fā)生二尖瓣脫垂的心臟疾病，是一種全身性系統(tǒng)性疾病[1-3]。與PKD發(fā)病有關(guān)基因已發(fā)現(xiàn)2個(gè)，其中PKD1基因定位于染色體16p13-3，其突變約占PKD的85%; PKD2基因定位于4q21～23，其突變約占15%[4]。

血清BUN測(cè)定是檢查腎功能的主要指標(biāo)之一，BUN是體內(nèi)蛋白質(zhì)代謝和氨基酸分解的終產(chǎn)物，主要經(jīng)腎小球過(guò)濾隨尿液排出體外，BUN的高低會(huì)受諸多因素的影響，如高蛋白飲食等，BUN的產(chǎn)生均明顯增加而使血清中BUN增高。常用檢測(cè)血清CREA的含量方法來(lái)了解腎功能的情況，血清中CREA濃度主要由腎小球?yàn)V過(guò)功能決定的, 腎小球?yàn)V過(guò)功能減退時(shí), 血清中CREA可升高。

圖 1 Tamoxifen誘導(dǎo)后21 d小鼠腎臟病理變化Figure 1 The pathological changes of kidney in mice after 21 days Tamoxifen induction

多囊腎Pkd1f/f:Cre轉(zhuǎn)基因小鼠是有條件目標(biāo)PKD1等位基因[5]敲除小鼠，并結(jié)合有選擇性的Cre重組酶，當(dāng)重組酶Cre被Tamoxifen誘導(dǎo)之后，Cre表達(dá)，介導(dǎo)兩個(gè)LoxP位點(diǎn)序列的重組，從而把目標(biāo)PKD1等位基因(LoxP-Pkd1-LoxP)敲除，在條件誘導(dǎo)敲除后，除了腎臟外，其他器官組織不會(huì)發(fā)生囊泡樣病理組織變化[6]。研究表明[7]，在小鼠10～12日齡進(jìn)行誘導(dǎo)，誘導(dǎo)后，PKD1等位基因(LoxP-Pkd1-LoxP)敲除的小鼠一般實(shí)驗(yàn)都可做到35～38日齡，本實(shí)驗(yàn)在小鼠11日齡，用棉子油溶解的Tamoxifen(10 mg/kg)按體質(zhì)量對(duì)小鼠進(jìn)行腹腔注射誘導(dǎo)敲除，隨著小鼠的生長(zhǎng)，小鼠狀態(tài)越來(lái)越差，在32日齡開(kāi)始死亡，比研究資料[7]顯示的存活時(shí)間要短。由誘導(dǎo)后7 d、14 d、21 d的BUN和CREA測(cè)定結(jié)果表明，在誘導(dǎo)敲除后7 d的BUN和CREA已開(kāi)始上升，表明腎小球?yàn)V過(guò)功能已受到影響。在誘導(dǎo)敲除后14 d、21 d的BUN和CREA明顯高于未敲除的小鼠，21 d時(shí)BUN升高3倍多，CREA升高2倍多(均P＜0.01)，在21 d時(shí)敲除小鼠的腎臟重量是沒(méi)有敲除小鼠的2倍，腎臟器系數(shù)3～4倍，體質(zhì)量下降明顯，表明誘導(dǎo)敲除后，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，小鼠腎功發(fā)生了進(jìn)行性惡化，腎中囊泡增多，逐漸擠壓正常的腎小球和組織，影響血液循環(huán)，使腎小球硬化，腎小管萎縮、腎間質(zhì)纖維化, 并出現(xiàn)腎衰癥狀, 采食量減少, 體質(zhì)量下降。此轉(zhuǎn)基因小鼠的發(fā)病特點(diǎn)與人類常染色體顯性遺傳引起的多囊腎發(fā)病進(jìn)程較一致，此研究為該轉(zhuǎn)基因小鼠的推廣利用提供數(shù)據(jù)，為研究多囊腎病分子發(fā)病機(jī)理、研發(fā)多囊腎病新藥提供有用的模型。

[1] 梅長(zhǎng)林, 李 林. 常染色體顯性遺傳性多囊腎病分子遺傳、發(fā)病機(jī)制及治療進(jìn)展[J]. 腎臟病與透析腎移植雜志, 2001, 10(5):454-460.

[2] Omori S, Hida M, Fujita H, et al. Extracellular signa l-regulated kinase inhibition slows disease progression in mice with polycystic kidney disease[J]. J Am Soc Nephrol, 2006,17 (6):1604-1614.

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Pathological Change of Kidney in Pkd1 Knock-out Mice with Polycystic Kidney Induced by Tamoxifen

ZHOU Wei-min, ZHU Ke-yan, CHEN Fang-ming, CAI Yue-qing, FANG Ming-sun, Qi Yue-han, CHEN min-li
(Laboratory Animal Research Center, Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou 310053, China)

Objective To explore the change of kidney function of polycystic kidney disease (PKD) mice before and after the knockout Pkd1f/f: Cre gene induced by Tamoxifen induction. Methods The Pkd1f/f:Cre transgenic mice, Pkd1f/f:Cre wild type mice aged on 11 days were induced by Tamoxifen, the contents of serum creatinine and urea nitrogen were detected at 7 days, 14 days and 21days after induction. The body weight, kidney weight and the kidney viscera coefficient were detected after 21 day. Result After 7 days induction, the contents of serum creatinine and urea nitrogen began to rise after 14 days and 21 days induction, the parameters were significantly increased (P＜0.01) After 21 days induction, the kidney coefficient of knocked out transgenic mice kidney coefficient was higher than that of wild type mice. Conclusion The renal function of Pkd1f/f:Cre transgenic mice were obviously changed by Tamoxifen induction, the kidney of transgenic mice showed symptoms of a large number of vesicles.

Polycystic kidney disease (PKD); Transgenic mice; Kidney function; Induction

Q95-33

A

1674-5817(2017)01-0011-04

10.3969/j.issn.1674-5817.2017.01.003

2016-10-27

浙江省公益性技術(shù)應(yīng)用研究計(jì)劃項(xiàng)目(2014C37009),浙江中醫(yī)藥大學(xué)比較醫(yī)學(xué)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)(XTD201301)

周衛(wèi)民(1979-), 男, 研究方向: 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。E-mail: zwm@zcmu.edu.cn

陳民利(1963-), 女, 教授, 研究方向: 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與比較醫(yī)學(xué)。E-mail: cmli991@aliyun.com