韓 琳, 謝建云, 楊 斐, 胡 櫻, 田立立, 鮑世民

(1. 上海斯萊克實驗動物有限責任公司, 上海201615; 2. 上海實驗動物研究中心, 上海201203 3. 復旦大學實驗動物科學部, 上海 200032)

上海地區(qū)常用近交系小鼠品系的單核苷酸多態(tài)性分型研究

韓 琳1, 謝建云2, 楊 斐3, 胡 櫻3, 田立立2, 鮑世民1

(1. 上海斯萊克實驗動物有限責任公司, 上海201615; 2. 上海實驗動物研究中心, 上海201203 3. 復旦大學實驗動物科學部, 上海 200032)

目的 比較上海地區(qū)常用近交系小鼠單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點分型情況。方法 采用多重PCR-LDR檢測技術(shù)，選取上海地區(qū)2家單位的10個近交系小鼠，對21條染色體上的44個SNP位點進行分型檢測，同時，隨機選取上海地區(qū)2個近交系品系作為雙盲樣本，對分型方案進行驗證，差異位點利用測序法進行驗證。結(jié)果 同一來源的10個近交系小鼠，同品系間SNP分型結(jié)果完全一致；不同種群來源6個品系SNP分型結(jié)果提示， BALB/c，F(xiàn)VB， DBA/2和C3H/He在44個位點上分型結(jié)果均相同，CBA和C57BL/6分別在7個和2個位點存在差異; 差異位點經(jīng)測序驗證結(jié)果與SNP分型方案一致。結(jié)論 上海地區(qū)常用近交系小鼠中，同一來源的品系中SNP遺傳質(zhì)量具有良好穩(wěn)定性和一致性，不同種群來源的相同品系間SNP分型存在差異。

近交系小鼠; 遺傳監(jiān)測; 單核苷酸多態(tài)性(SNP)分型

實驗動物的遺傳背景和反應特性是影響實驗結(jié)果的重要因素，遺傳的變異，或者不同亞系之間的差異，都會造成實驗結(jié)果的差異，甚至出現(xiàn)錯誤結(jié)果。隨著生物醫(yī)學的發(fā)展，對實驗動物質(zhì)量的要求越來越高，因而對實驗動物質(zhì)量的遺傳監(jiān)測方法也提出了更高的要求。單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)作為新一代的分子標記，具有分布廣泛，遺傳穩(wěn)定，易于自動化技術(shù)篩選等特性[1]，多應用于人類基因鑒定，細菌病毒鑒定等，許多國外實驗動物科研機構(gòu)和實驗室亦將SNP檢測技術(shù)運用于近交系小鼠遺傳質(zhì)量檢測和易混淆品系或不同亞系間的鑒定[2-4], 并在相應網(wǎng)站(如Pubmed等)提供了大量的位點信息數(shù)據(jù)庫[5]。然而國內(nèi)實驗動物生產(chǎn)或使用單位在采用分子生物學標記檢測時，檢測位點信息較少，檢測技術(shù)操作繁瑣，工作量較大[6,7]，常常不能進行全面和大規(guī)模的實驗動物遺傳特性分析監(jiān)測。本文采用靈敏度和檢測效率較高的PCR-LDR技術(shù)[8-12]，檢測上海地區(qū)常用近交系小鼠44個SNP位點，以提供全面準確的近交系小鼠遺傳特性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 6周齡雄性C57BL/6，BALB/c，F(xiàn)VB，DBA/1，DBA/2，C3H/He，CBA，NOD，SJL/J小鼠，各品系3只，來自上海斯萊克實驗動物有限責任公司(以下簡稱SLAC)[SCXK(滬) 2012-0002]; 6周齡雄性C57BL/6, BALB/c, FVB, DBA/2，C3H/He，CBA，129S1小鼠，各品系3只，來自上海西普爾-必凱實驗動物有限責任公司(以下簡稱BK)[SCXK(滬)2013-0016]6周齡雄性C57BL/6，BALB/c，各4只，來自上海靈暢生物科技有限公司[SCXK(滬)2013-0018]，作為雙盲樣本。所有動物均為SPF級。鼠尾取材在上海斯萊克實驗動物有限責任公司綜合實驗室進行[SYXK(滬)2012-0002]，對所使用的實驗動物按3R原則給予人道關懷。

1.1.2 試劑 基因組DNA抽提試劑盒(Cat.No:69504), HotStar Taq Plus DNA 聚合酶(Cat.No: 203603)，dNTP Mix (Cat.No:201900)，均購自德國Qiagen公司, Taq DNA 連接酶(M0208)購自英國New England Biolab公司; 所有引物, 序列見附表1, 由上海生工生物工程有限公司合成; 所有探針, 序列見附表2，由英濰捷基(Invitrogen, 上海)貿(mào)易有限公司合成; 所有測序儀檢測均由上海捷瑞生物科技有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 鼠尾基因組DNA提取 小心剪取小鼠尾尖約0.5 cm，按照Qiagen基因組DNA提取試劑盒說明操作，所抽提小鼠基因組DNA，-20 ℃保存。微量紫外分光光度計測定DNA濃度，將濃度調(diào)整至50 ng/μL待用; 測定吸光度值A260/280。

1.2.2 多重PCR反應 PCR反應體系10 μL，10× PCR 緩沖液1 μL，25 mmol/L Mg2+1.2 μL，DNTPs (各10 mmol) ，多重引物終濃度各 0.025 μmol/L，HotStar Taq DNA聚合酶(5U/μL)0.05 μL，模板DNA (50 ng/μL)2 μL。按順序加入上述成份，輕微振蕩，瞬時離心。反應程序為: 95 ℃預變性15 min; 94 ℃變性30 s，56 ℃退火1 min 30 s，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán); 72 ℃10 min。

1.2.3 多重LDR反應 LDR反應體系7 μL，10× LDR 緩沖液0.7 μL, 多重探針(各0.05 μmol) 0.7 μL，Taq DNA連接酶(1U/反應)0.0375 μL，PCR產(chǎn)物(10 ng/μL) 4.6μL，ddH2O1μL; 96孔板反應，程序如下: 94 ℃ 2 min; 94 ℃ 30 s，50 ℃，30個循環(huán); 20℃ 保溫。

1.2.4 PCR-LDR產(chǎn)物的檢測 將PCR-LDR產(chǎn)物短暫離心，1 000 r/m，10 s; 取1 μL LDR產(chǎn)物，加入1 μL ROX500分子量標準和8 μL甲酰胺，混勻，95 ℃變性3 min，冰浴10 min; 使用ABI 3730自動測序儀進行檢測，收集數(shù)據(jù)。

1.2.5 部分SNP位點測序驗證 對需測序驗證的位點進行PCR擴增反應, 反應體系, 反應程序同1.2.2。將PCR產(chǎn)物送上海捷瑞生物工程有限公司進行純化和測序反應。測序采用雙脫氧末端終止法，單向測序引物選取PCR擴增引物中的一條。

1.2.6 結(jié)果分析 每組測序儀電泳結(jié)果中，每個峰對應一個SNP位點。通過對照已知的分子量標準，確定每個峰對應的分子量大小，對比附表3中各位點LDR連接產(chǎn)物片段大小，以此判斷SNP位點的基因分型。

2 結(jié)果

2.1 SNP位點分型情況

SNP分型結(jié)果(表1，表2)顯示，同一單位來源的同品系3只小鼠，分型結(jié)果完全一致，而同一品系在不同單位間分型結(jié)果存在差異，差異較明顯的主要是CBA和C57BL/6兩品系。SLAC來源的CBA小鼠在a10, a11, b5, b9, b10, c1, c11位點的分型依次為G, T, A, C, A, G, A, 而BK來源的依次為C, G, G, A, G, A, G; SLAC來源的C57BL/6在c6, c9位點分型為G, G, BK來源的則為C, A; 兩單位來源其他品系的各位點SNP分型結(jié)果均相同。

2.2 對同一品系小鼠分型差異位點的驗證

差異位點測序結(jié)果提示，不同來源的CBA小鼠在a10, a11, b5, b9, b10, c1, c11位點與本實驗中PCR-LDR法分型結(jié)果(表1，表2)一致。圖1為CBA在a10, a11位點的測序圖，其結(jié)果顯示，SLAC來源CBA小鼠a10位點為G，而BK來源的則為C，與實驗分型結(jié)果一致，進一步驗證PCR-LDR分型方法的準確性。

2.3 雙盲樣本驗證

隨機選取上海靈暢生物科技有限公司2個近交系品系小鼠，每品系4只，采用本文中的分型方案進行雙盲實驗，44個SNP位點分型結(jié)果見表3。該2個品系分型結(jié)果與的SLAC公司C57BL/6和BALB/c各位點分型結(jié)果完全一致，且靈暢公司近交系品系種群來自SLAC公司，據(jù)此，可推斷出品系1為C57BL/6，品系2為BALB/c。同時，品系1在c6, c9位點分型為G, G, 與BK公司C57BL/6品系分型不同，其余位點均相同。

表1 SLAC來源9品系小鼠SNP基因分型Table 1 The SNP genotyping of 9 inbred strains from SLAC

表 2 BK來源7品系小鼠SNP基因分型Table 2 The SNP genotyping of 7 inbred strains from BK

圖 1 SLAC及BK來源CBA小鼠在a10和a11位點測序圖Figure 1 The sequencing of the a10 and a11 in CBA from SLAC and BK

表 3 隨機選取2品系近交系SNP分型結(jié)果Table 3 The SNP genotyping of 2 inbred strains as double blind

3 討論

實驗動物的遺傳質(zhì)量對實驗結(jié)果的可比性、可重復性和準確性起著決定性作用。由于實驗動物飼育過程中的遺傳變異，不同亞系之間的差異，或者管理操作失誤，均會對實驗結(jié)果造成影響。本研究選取的44個SNP位點分布于21條染色體上，能較全面地在基因水平概括近交系小鼠遺傳特性。每個位點的PCR產(chǎn)物經(jīng)檢驗具有良好特異性，且各位點均100%純合，適宜于作為一套SNP分型方案對常用近交系小鼠進行遺傳質(zhì)量的監(jiān)測。研究所采用的多重PCR-LDR分型方案，常應用于微生物、寄生蟲的檢測[8,9]，腫瘤基因診斷[10]，人類疾病診斷分型[11]，小鼠染色體的替換系等[12]領域，因其特異性強，檢測效率和靈敏性高，操作簡單，成本容易控制，非常適宜于作為實驗動物日常遺傳質(zhì)量監(jiān)測的標準化分型方案。

實驗選取上海地區(qū)規(guī)模較大的2家實驗動物生產(chǎn)單位的常用近交系小鼠，其檢測結(jié)果提示，同一單位來源同品系小鼠在44個SNP位點分型結(jié)果均一致，表明上海地區(qū)常用近交系小鼠的遺傳質(zhì)量穩(wěn)定性較高; 不同單位來源的同一品系分型結(jié)果存在差異，主要是CBA和C57BL/6。對于同品系中出現(xiàn)差異的位點，采用雙脫氧末端終止法進行測序驗證，測序結(jié)果與本實驗中結(jié)果一致，進一步證實了本分型方案的準確性。倪麗菊等[13]采用多重熒光STR技術(shù)，對上海地區(qū)的常用近交系小鼠微衛(wèi)星位點進行檢測, 結(jié)果表明, 同品系小鼠在不同種群之間部分微衛(wèi)星位點存在差異，主要集中在CBA/CaBkl和CBA/JSlac，C57BL/6Bkl和 C57BL/6 JSlac之間，這與本研究的SNP分型結(jié)果較為一致，該文作者認為，出現(xiàn)這一差異的原因，一是由不同亞系導致，二是由于不同種群來源，在長期培育過程中出現(xiàn)遺傳分化導致。Mekada等[4]檢測不同種群來源C57BL/6N 和C57BL/6J小鼠1-X染色體上的100個SNP位點，分型結(jié)果顯示有較大差異，C57BL/6N的不同亞系亦顯示出明顯SNP分型差異。本實驗同時選取的2品系近交系小鼠作為雙盲實驗樣本，實驗結(jié)果提示，利用SNP分型技術(shù)，能夠用于區(qū)分和確定近交系小鼠品系，且所測樣品的SNP分型結(jié)果與其引種單位的完全一致，進一步表明本研究中所選取SNP位點在近交系小鼠品系中具有良好的遺傳穩(wěn)定性。

目前國內(nèi)實驗動物生產(chǎn)或使用單位，仍多采用國家標準中推薦的生化標記檢測，或雖采用分子生物學標記檢測，但檢測位點信息較少，檢測技術(shù)復雜多樣，且工作量較大, 常常不能全面準確地反映實驗動物的遺傳特性。胡培麗等[6]選用16個SNP位點，對4個近交系品系進行分型檢測, 作者希望進一步檢測更多的SNP位點, 同時增加更多近交系小鼠品系, 以備建立比較完善的SNP數(shù)據(jù)庫。SNP位點具有遺傳穩(wěn)定，檢測通量高，可自動化操作，適用于實驗動物飼育過程中的日常遺傳質(zhì)量控制，品系鑒定，遺傳特性檢測等[14,15]。崔淑芳等[7]應用雙色熒光雜交芯片技術(shù)對4個近交系小鼠的6個SNP位點進行檢測，結(jié)果表明該技術(shù)的分型準確率較高，且能高通量操作, 適合進行少量品系大樣本量的遺傳檢測和品系鑒定。本研究采用多重PCR-LDR檢測手段, 對上海地區(qū)常用10個近交系小鼠，44個SNP位點進行分型檢測, 操作簡便, 結(jié)果準確率高。今后還需在國內(nèi)多家單位采集雙盲樣本，對SNP分型方案進行進一步驗證，同時希望能夠收集國外著名實驗動物公司的近交系小鼠SNP位點信息, 建立完善而準確的SNP數(shù)據(jù)庫，以期為實驗動物遺傳質(zhì)量控制提供更為全面可靠的信息。

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The Single Nucleotide Polymorphism Genotyping of Inbred Mice from Shanghai

HAN Lin1, XIE Jian-yun2, YANG Fei3, HU Ying3, TIAN Li-li2, BAO Shi-min1
(1. Shanghai SLAC Laboratory Animal Ltd.Co., Shanghai, 201615; 2. Shanghai Laboratory Animal Center, Shanghai, 201203; 3. Fu Dan University, Shanghai, 200433)

Objective To analyze the single nucleotide polymorphism (SNP) genotyping of inbred mice from Shanghai. Methods 44 SNP loci on 21 chromosomes of 10 inbred mice strains from 2 laboratory animal companies of Shanghai were detected by the PCR-LDR genotyping panels, and the other 2 inbred mice strains were selected as the double blind samples for verification. And discrepancy locus were verified by sequencing. Results The SNP genotyping results of all the samples from the same inbred mice strains were homomorphism, but 6 inbred mice strains from different populations (BALB/c, FVB, DBA/2 and C3H/He) were polymorphism with 7 and 2 discrepancy locus respectively. The sequencing results to verify the discrepancy locus were the same as the SNP genotyping results. Conclusions The SNP genotyping was very stable and consistent in inbred mice strains from the same population in Shanghai, and the SNP genotyping of the same inbred mice strains from different populations was polymorphism.

Inbred mice; Genetic monitoring; Single nucleotide polymorphism (SNP) genotyping

Q95-33

A

1674-5817(2017)01-0025-07

10.3969/j.issn.1674-5817.2017.01.006

2016-09-30

上海市科學技術(shù)委員會科研計劃項目(14140900800)

韓 琳(1982-), 女, 碩士, 實驗師, 研究方向: 實驗動物遺傳質(zhì)量控制, PDX腫瘤模型。

E-mail: hanlin594@126.com

鮑世民, 男, 副研究員, 研究方向: 實驗動物遺傳育種和質(zhì)量控制。E-mail: baoshimin@sibs.ac.cn