楊 華, 趙亞娟, 歐 強(qiáng)

(1. 上海市公共衛(wèi)生臨床中心, 上海 201508; 2. 上海市第八人民醫(yī)院, 上海 200235)

非酒精性脂肪性肝纖維化小鼠模型的建立及炎癥因子的表達(dá)

楊 華1, 趙亞娟2, 歐 強(qiáng)2

(1. 上海市公共衛(wèi)生臨床中心, 上海 201508; 2. 上海市第八人民醫(yī)院, 上海 200235)

目的 建立非酒精性脂肪性肝纖維化小鼠模型，觀察其病變及炎癥因子的表達(dá)情況。方法 20只雄性C57BL/6J小鼠隨機(jī)分成對(duì)照組、非酒精性脂肪性肝纖維化模型組。對(duì)照組小鼠予以蛋氨酸-膽堿充足(MCS)飼料喂養(yǎng)，模型組小鼠予以蛋氨酸-膽堿缺乏(MCD)飼料喂養(yǎng)造模。于造模8周末處死小鼠。觀察肝臟組織病理學(xué)變化，檢測(cè)小鼠血清草氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)水平。結(jié)果 造模8周末，模型組小鼠體質(zhì)量顯著下降。肝組織病理學(xué)觀察顯示嚴(yán)重肝脂肪變，肝細(xì)胞水腫，可見點(diǎn)灶狀壞死及淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，局灶見界面肝炎，匯管區(qū)擴(kuò)大，纖維組織增生。模型組小鼠肝臟炎癥活動(dòng)度得分和纖維化得分均顯著高于對(duì)照組(P＜0.01)。模型組小鼠血清ALT、AST、TNF-α、IL-6與對(duì)照組比較顯著升高，而TG和TC水平顯著下降(P＜0.01)。結(jié)論 小鼠經(jīng)MCD飼料喂養(yǎng)8周出現(xiàn)嚴(yán)重肝脂肪變、肝纖維化和炎癥因子高表達(dá)，表明成功誘導(dǎo)小鼠非酒精性脂肪性肝纖維化模型。該方法造模簡(jiǎn)單，成?？?，存活率高，適合用于非酒精性脂肪性肝纖維化發(fā)病機(jī)制和藥物干預(yù)等方面的研究。

非酒精性脂肪性肝纖維化; 蛋氨酸-膽堿缺乏(MCD); C57BL/6J小鼠; 炎癥因子

隨著肥胖、糖尿病和代謝綜合癥的全球化流行，非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD)的發(fā)病率也逐漸升高，已成為慢性肝病的重要病因之一[1]。研究表明，非酒精性脂肪性肝纖維化的發(fā)生和嚴(yán)重程度與NAFLD患者死亡率密切相關(guān)，采取積極有效的治療手段阻斷非酒精性脂肪性肝纖維化進(jìn)展是防治NAFLD的關(guān)鍵[2]。建立理想的非酒精性脂肪性肝纖維化動(dòng)物模型，對(duì)于深入研究非酒精性脂肪性肝纖維化的發(fā)病機(jī)制，篩選有效治療藥物，具有非常重要的意義。

C57BL/6小鼠是第一個(gè)完成基因組測(cè)序的小鼠品系，以C57BL/6J小鼠為遺傳背景的基因工程小鼠在探討疾病的分子機(jī)制方面發(fā)揮了關(guān)鍵作用[3-5]。國(guó)外已有采用C57BL/6J小鼠制備NAFLD動(dòng)物模型的文獻(xiàn)報(bào)道[6]。本實(shí)驗(yàn)采用蛋氨酸-膽堿缺乏(Methionine and choline-deficient, MCD)飼料喂養(yǎng)C57BL/6小鼠造模，觀察肝組織病理學(xué)變化，并檢測(cè)血清生化指標(biāo)和炎癥因子表達(dá)情況，為該模型在非酒精性脂肪性肝纖維化發(fā)病機(jī)制、藥物評(píng)價(jià)等方面的應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雄性C57BL/6J小鼠20只, 6～8周齡, 體質(zhì)量22±2 g, 由上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供[SCXK(滬)2013-0016]。小鼠飼養(yǎng)于上海市公共衛(wèi)生臨床中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SYXK(滬)2015-0008]。明12 h∶暗12 h，室溫保持22～25 ℃，相對(duì)濕度40%～60%，實(shí)驗(yàn)期間小鼠自由飲食。

1.2 飼料和試劑

蛋氨酸-膽堿缺乏(MCD)飼料和蛋氨酸-膽堿充足(MCS)飼料，即在MCD 飼料配方基礎(chǔ)上，加上膽堿2 g/kg、蛋氨酸3 g/kg，均購(gòu)自南通特洛菲飼料科技有限公司[蘇飼證(2014)06092]; 腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)ELISA試劑盒購(gòu)自上?？迫A生物科技股份有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后隨機(jī)分為2組: (1)對(duì)照組10只，予MCS飼料飼喂; (2)非酒精性脂肪性肝纖維化模型組(簡(jiǎn)稱模型組)10只，給予MCD飼料飼喂。實(shí)驗(yàn)期間觀察小鼠一般情況，包括精神狀態(tài)、活動(dòng)情況、皮毛光澤度、食量等。

造模第8周末處死模型組和對(duì)照組小鼠。小鼠處死前禁食過夜，稱重，用戊巴比妥鈉(35 mg/kg)麻醉后，眼眶靜脈叢采血，制備血清，檢測(cè)天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(A S T)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、TNF-α、IL-6指標(biāo)。肝臟稱重后作大體觀察, 再取肝右葉, 部分用體積分?jǐn)?shù)10%中性甲醛固定, 肝組織石蠟包埋切片, 行HE及Masson染色，部分冰凍制片行油紅染色, 光學(xué)顯微鏡下行組織形態(tài)學(xué)觀察。采用Ishaki評(píng)分系統(tǒng)評(píng)價(jià)肝組織炎癥活動(dòng)度和肝纖維化程度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 19.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以表示, 比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。兩組間肝臟炎癥活動(dòng)度得分和纖維化得分比較采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

兩組小鼠均未見死亡。對(duì)照組小鼠靈活度好，毛發(fā)光澤，飲食、糞便正常，體質(zhì)量持續(xù)增加(圖1A)。模型組小鼠行動(dòng)遲緩、精神萎靡、毛發(fā)紊亂，光澤度差，小鼠攝入MCD飼料后，攝食量大幅度減少(圖1B)。

2.2 體質(zhì)量和血清生化指標(biāo)

從造模開始，模型組小鼠體質(zhì)量持續(xù)下降。第8周末模型組小鼠體質(zhì)量與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。第8周末，模型組小鼠血清ALT和AST明顯高于對(duì)照組(P＜0.01)，而TG、TC水平低于對(duì)照組(P＜0.01)(表1)。

2.3 肝臟外觀變化

造模第8周，對(duì)照組小鼠肝表面光滑，外觀紅褐色，質(zhì)地軟，肝緣銳利(圖2A)。模型組小鼠肝臟色澤暗淡，泛黃，體積變小，質(zhì)地尚軟，邊緣較鈍，觸之有明顯顆粒感(圖2B)。

圖 1 小鼠第8周活體外觀

表 1 對(duì)照組和模型組小鼠體質(zhì)量和血清生化指標(biāo)比較

2.4 小鼠肝組織病理學(xué)變化

圖 2 小鼠第8周肝臟大體外觀

第8周末，HE染色光學(xué)顯微鏡下可見對(duì)照組小鼠肝細(xì)胞大小形態(tài)正常，肝細(xì)胞索排列整齊，肝竇清晰可見，肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞內(nèi)局灶見微泡脂滴沉積，無(wú)炎癥改變, 無(wú)纖維化(圖3A1)，模型組小鼠肝細(xì)胞大泡狀脂肪變，肝細(xì)胞水腫，可見點(diǎn)灶狀壞死及淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，局灶見界面肝炎，匯管區(qū)擴(kuò)大，淋巴細(xì)胞及少量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，纖維組織增生(圖3B1)。Masson染色光學(xué)顯微鏡下可見對(duì)照組小鼠肝臟無(wú)明顯染色，沒有膠原沉積(圖3A2)，模型組淺藍(lán)染顯示肝細(xì)胞點(diǎn)灶狀壞死，深藍(lán)染顯示大部分匯管區(qū)及匯管區(qū)周圍竇周纖維化(圖3B2)。油紅染色可見對(duì)照組紅色微泡脂滴(圖3A3)，模型組可見肝細(xì)胞內(nèi)大量紅色大脂滴，提示嚴(yán)重肝脂肪變(圖3B3)。

2.5 肝臟炎癥活動(dòng)度和纖維化評(píng)分

肝臟炎癥活動(dòng)度得分和纖維化得分組間比較差異顯著(P＜0.01)(圖4)。

2.6 炎癥因子的表達(dá)

模型組小鼠血清TNF-α和IL-6水平明顯高于對(duì)照組(P＜0.01)(表2)。

圖 3 小鼠肝組織病理學(xué)變化

3 討論

圖 4 小鼠肝臟炎癥活動(dòng)都和纖維化Ishaki評(píng)分

表 2 對(duì)照組和模型組小鼠血清炎癥因子表達(dá)比較

建立一個(gè)與人類病變相似的非酒精性脂肪性肝纖維化動(dòng)物模型, 對(duì)于深入研究其發(fā)病機(jī)制和研發(fā)治療藥物意義重大[7]。目前非酒精性脂肪性肝纖維化動(dòng)物模型的建立主要有以下三種: ①由基因變異或基因敲除引起的遺傳性小鼠模型如瘦素缺乏型(ob/ob)小鼠[8]; ②高脂高糖飲食誘導(dǎo)模型[9]; ③MCD飲食誘導(dǎo)模型[10,11]。相對(duì)于遺傳性動(dòng)物模型，飲食誘導(dǎo)動(dòng)物模型取材便利，應(yīng)用更為廣泛。高脂飲食誘導(dǎo)模型可出現(xiàn)肝脂肪含量增加，胰島素抵抗等, 與人類NAFLD臨床特征相類似[12]。但該模型主要缺陷在于造模時(shí)間過長(zhǎng), 炎癥和肝纖維化程度較輕[13,14]。MCD是指在喂養(yǎng)飼料中選擇性地不含有蛋氨酸及膽堿。其作用機(jī)理在于減少了脂蛋白的合成，尤其是極低密度脂蛋白，造成了甘油三酯在肝臟細(xì)胞的沉積，并且損傷了抗氧化屏障機(jī)制導(dǎo)致了氧化應(yīng)激加劇，在非酒精性脂肪性肝纖維化發(fā)生和發(fā)展的多個(gè)環(huán)節(jié)都產(chǎn)生作用[15,16]。

研究表明[17], 不同的動(dòng)物種系及性別對(duì)MCD的敏感性不同, 與大鼠相比, 小鼠具有敏感性高、模型周期短, 肝組織病理學(xué)特點(diǎn)顯著等優(yōu)點(diǎn)。Marcolind等[18]采用MCD飲食誘導(dǎo)C57BL/6J小鼠非酒精脂肪性肝炎 (NASH)模型，喂養(yǎng)2周即觀察到模型小鼠血清ALT和AST水平明顯升高，肝組織纖維化評(píng)分顯著高于對(duì)照組。為進(jìn)一步證實(shí)MCD飲食誘導(dǎo)非酒精性脂肪性肝纖維化模型的可靠性和肝脂肪變、纖維化程度, 了解該模型炎癥因子的表達(dá)情況,本文采用MCD飲食喂養(yǎng)C57BL/6J小鼠誘導(dǎo)非酒精性脂肪性肝纖維化，觀察其肝組織炎癥和肝纖維化程度、肝功能和血清TNF-α、IL-6水平變化情況。研究表明, 第8周末, 模型組小鼠血清ALT和AST水平顯著高于對(duì)照組(P＜0.01)。肝組織形態(tài)學(xué)觀察顯示，模型組小鼠肝細(xì)胞大泡狀脂肪變非常明顯,并出現(xiàn)點(diǎn)灶狀壞死及淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，局灶見界面肝炎, 大部分匯管區(qū)及匯管區(qū)周圍竇周纖維化。模型組小鼠肝組織炎癥活動(dòng)度和纖維化得分顯著高于對(duì)照組(P＜0.01)。肝組織慢性炎癥是非酒精性脂肪性肝纖維化發(fā)病機(jī)制之一, 表現(xiàn)為炎癥因子高表達(dá)[19]。本文結(jié)果表明, 模型組小鼠血清TNF-α、IL-6水平明顯升高。研究結(jié)果證實(shí)，C57BL/6J小鼠對(duì)MCD飲食敏感性好，飼養(yǎng)8周可誘導(dǎo)小鼠出現(xiàn)明顯肝組織炎癥活動(dòng)和肝纖維化，伴隨血清轉(zhuǎn)氨酶和炎癥因子升高，誘導(dǎo)時(shí)間短，重復(fù)性好，是較為理想的非酒精性脂肪性肝纖維化造模方法。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中未見小鼠自然死亡，提示該模型存活率高。

本研究還觀察到，模型組小鼠拒食現(xiàn)象較常見，從造模開始體質(zhì)量持續(xù)下降，同時(shí)TG和TC下降，與人類NAFLD代謝表型相反[20]。由于非酒精性脂肪性肝纖維化發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，目前尚無(wú)一種動(dòng)物模型能全面模擬人類病變過程。因此，在實(shí)際研究工作中應(yīng)根據(jù)不同實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，選擇重復(fù)性高、操作方法簡(jiǎn)便的動(dòng)物模型。

綜上所述，采用MCD飼料喂養(yǎng)8周可成功誘導(dǎo)C57BL/6J小鼠非酒精性脂肪性肝纖維化模型。該方法造模方法簡(jiǎn)單，成?？?，動(dòng)物存活率高，適合用于非酒精性脂肪性肝纖維化發(fā)病機(jī)制及藥物干預(yù)等方面的研究。

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Establishment of Nonalcoholic Fatty Liver Fibrosis Model and Expression of Inflammatory Factors in Mice

YANG Hua1, ZHAO Ya-Juan2, OU Qiang2
(1. Shanghai Public Health Clinical Center, Shanghai 201508, China; 2. Eighth People’s Hospital of Shanghai, Shanghai 200235, China)

Objective To establish the non-alcoholic fatty liver fibrosis model in mice and observe the pathological changes and the expression of inflammatory factors. Methods Twenty male C57BL/6J mice were randomly divided into control group and model group. The mice in control group were fed with methionine and choline-supplement(MCS) diet, and the model group were fed with methionine choline deficiency (MCD) diet. The mice were weighed and sacrificed at after 8 weeks feeding. The histopathological changes in liver were observed. The level of serum aspartate aminotransferase (AST), alanine aminotransferase (ALT), cholesterol (TC), triglyceride (TG), tumor necrosis factor -α (TNF-α) and interleukin (IL-6 ) were detected. Results The body weight of mice in the model group decreased significantly at the end of the study. Severe hepatic steatosis, liver cell edema, visible focal necrosis and focal lymphocytic infiltration, interface hepatitis, periportal enlargement, hyperplasia of fibrous tissue were observed.The scores of liver inflammation activity and fibrosis score in model group were significantly higher than those in control group (P＜0.01).The level of serum ALT、AST、TNF-α、IL-6 were significantly higher in the model group than that of control group (P＜0.01). Conclusion After feeding mice with MCD diet feeding for 8 weeks, non-alcoholic fatty liver fibrosis model of mice was successfully induced. The modeling method was simple, rapid, and with has high survival rate. It is suitable for the pathogenesis and drug intervention study of nonalcoholic fatty liver fibrosis.

Non-alcoholic fatty liver Fibrosis; Methionine choline deficiency(MCD); C57BL/6J mice; Inflammatory factors

Q95-33

A

1674-5817(2017)01-0020-05

10.3969/j.issn.1674-5817.2017.01.005

2016-09-12

上海市第八人民醫(yī)院人才引進(jìn)科研基金(BY201406)

楊 華(1973-), 女, 高級(jí)獸醫(yī)師, 主要從事動(dòng)物模型研究。E-mail: yanghua@shaphc.org

歐 強(qiáng), 男, 博士, 副主任醫(yī)師, 主要從事非酒精性脂肪肝基礎(chǔ)和臨床研究。

E-mail: ouqiang76@163.com