筱 禾 編譯

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以昆蟲瞬時受體電位(TRP)通道作為殺蟲劑及驅(qū)避劑的靶標(biāo)

筱 禾 編譯

(上海農(nóng)藥研究所，上海 200032)

昆蟲瞬時受體電位(TRP)通道是離子通道的一大類別，在幾乎所有的感覺系統(tǒng)中發(fā)揮關(guān)鍵的信號傳導(dǎo)作用。其他離子通道類別，特別是電壓依賴性離子通道、配體門控離子通道和細(xì)胞內(nèi)鈣釋放通道(魚尼汀受體)長期以來被認(rèn)為是最成功的殺蟲劑靶標(biāo)。但是最近才發(fā)現(xiàn)，TRP通道是探索已久的某些取食抑制劑類殺蟲劑的靶標(biāo)，使這類通道和感覺過程成為殺蟲劑靶標(biāo)的開發(fā)熱點(diǎn)。最近還發(fā)現(xiàn)驅(qū)避劑香茅醛可激活TRPA1通道。由于感受和響應(yīng)外部和內(nèi)部刺激的能力對昆蟲生存和繁殖至關(guān)重要，故TRP通道或可為害蟲防治提供更多的備選靶標(biāo)。

1 離子通道概述

離子通道是一種內(nèi)在膜蛋白，含有能選擇性地跨膜運(yùn)輸特定離子的狹窄的，充滿水的跨膜孔以及參與通道開啟和關(guān)閉或門控的細(xì)胞外和細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。離子通道存在于所有細(xì)胞中，在調(diào)節(jié)細(xì)胞體積，建立靜息膜電位，液體轉(zhuǎn)運(yùn)和細(xì)胞信號傳導(dǎo)中發(fā)揮作用。

離子通道由4個或更多亞基或偽亞基緊密結(jié)合，形成雙層脂膜的跨膜孔。也有少數(shù)類別的通道形成2個這樣的跨膜孔。每一個亞基(偽亞基)有4個或更多個貫穿膜的跨膜-螺旋，一般共有20個或以上這種跨膜-螺旋參與跨膜孔，或根據(jù)它們的位置和序列有其他功能?？缒た字車?~5個螺旋為其提供親水性以及離子選擇性，最外側(cè)的螺旋則具有疏水殘基，其面向周圍雙層脂膜并與其相互作用固定膜內(nèi)的通道。其他區(qū)域?qū)⒖缒た變?nèi)螺旋保持在合適的位置，并且在適當(dāng)信號的作用下移動它們以開啟和關(guān)閉跨膜孔。離子從2個方向被動流過開放的通道，無代謝能量的輸入。離子的凈通量取決于離子的電化學(xué)梯度，即離子濃度差和膜電位差。

參與神經(jīng)信號傳導(dǎo)的大多數(shù)通道對Na+，K+，Cl－或Ca2+具有選擇性，或是非選擇性陽離子通道。Na+和Ca2+順電化學(xué)梯度通過開放通道內(nèi)流，細(xì)胞去極化興奮。除了細(xì)胞膜去極化，Ca2+還可直接調(diào)節(jié)許多細(xì)胞內(nèi)進(jìn)程。K+在細(xì)胞內(nèi)處于高濃度時，經(jīng)通道外流，使細(xì)胞內(nèi)部負(fù)電荷增多，具有抑制性或穩(wěn)定細(xì)胞膜電位作用。需相等濃度的陰離子來平衡陽離子以達(dá)到電中性。細(xì)胞內(nèi)的大多數(shù)陰離子是有機(jī)酸形成的，而細(xì)胞外Cl－濃度高，因此其往往通過開放的氯離子通道流入細(xì)胞，表現(xiàn)抑制性。非選擇性陽離子通道通常使細(xì)胞去極化，因此根據(jù)電學(xué)原則是興奮性的，也是由于允許Ca2+內(nèi)流所致。

離子通道的概念起源于Hodgkin和Huxley提出的具有里程碑意義的神經(jīng)動作電位解構(gòu)，他們發(fā)現(xiàn)神經(jīng)動作電位是由不同的Na+和K+傳導(dǎo)途徑產(chǎn)生的。利用“膜片鉗”技術(shù)證實(shí)了通道的存在。通過基因測序現(xiàn)已知許多離子通道的蛋白序列。這些蛋白可在異源系統(tǒng)中常規(guī)表達(dá)，以便于對通道功能和結(jié)構(gòu)進(jìn)行測定。因為在脂質(zhì)膜外結(jié)晶這些蛋白質(zhì)有難度，故到目前為止，只獲得了極少數(shù)離子通道的X射線晶體結(jié)構(gòu)。谷氨酸門控氯離子通道中的大環(huán)內(nèi)酯結(jié)合位點(diǎn)是唯一已經(jīng)通過X射線晶體學(xué)表征的離子通道中殺蟲劑結(jié)合位點(diǎn)。而利用冷凍電子顯微鏡(cryo-EM)進(jìn)行離子通道結(jié)構(gòu)測定的研究正以較快的速度增加，已有2個TRP通道的cryo-EM結(jié)構(gòu)被公開。

植物、微生物、蛇、魚、蝎、蜘蛛和其他動物產(chǎn)生的許多毒素通過破壞特定的離子通道而致效。離子通道也是許多殺蟲劑的重要靶標(biāo)位點(diǎn)，現(xiàn)行版本的IRAC(殺蟲劑抗性行動委員會)作用機(jī)制分類中列舉的27種殺蟲劑作用機(jī)制中的9種為作用于離子通道(www.irac-online.org)。

2 TRP 通道

第一個TRP通道是在果蠅突變體中發(fā)現(xiàn)的，此突變體具有視覺障礙，視網(wǎng)膜電流圖顯示其對光的響應(yīng)時間縮短?；虮磉_(dá)產(chǎn)物被鑒定為一種離子通道后，發(fā)現(xiàn)TRP通道是所有后生動物中保留的離子通道的超家族。此外，TRP通道也存在于原生生物、綠藻、領(lǐng)鞭蟲類(choanoflagellates)和真菌中，發(fā)揮化學(xué)傳感、熱傳感和機(jī)械力傳感器的作用。因此，TRP通道出現(xiàn)在真核生物進(jìn)化早期，但后來在植物中消失了。

TRP超家族包含約30個成員，根據(jù)序列的相似性分為7個家族：TRPC[典型(canonical)]、TRPA[錨蛋白(ankyrin)]、TRPV[香草酸(vanilloid)]、TRPN(nompC)、TRPM(melastatin)、TRPML (mucolipin)和TRPP(polycystic)。家族名字的第4個字母是指每個家族的一個或多個成員的一個方面，但不一定是所有成員。例如，TRPC通道與從上述突變體分離的果蠅TRP通道的同源性較高，TRPA通道在N末端胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域中具有多個錨蛋白重復(fù)序列模體(Ankyrin repeat motifs)(盡管其他幾個家族也是如此)，TRPV通道包括能被香草酸激活的亞型，而TRPN通道與NOMPC(No Mechanoreceptor Potential)通道相關(guān)，對機(jī)械力信號傳導(dǎo)很重要。

TRP通道與電壓依賴性離子通道具有序列相似性，但具有與物理和化學(xué)刺激多模態(tài)敏感性相關(guān)的延長的胞質(zhì)C端和N端區(qū)域。與一些電壓門控通道一樣，TRP通道亞基有6個跨膜螺旋，組裝為四聚體。在其他電壓門控通道中，有4個偽亞基，每個包含6個跨膜螺旋，連接在一起作為單個蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域。

TRP通道在視覺、溫度感覺(thermosensation)、嗅覺、味覺、濕度感覺(hygrosensation)、機(jī)械力感覺(mechanosensation)、細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)、突觸傳遞和離子體內(nèi)平衡中發(fā)揮作用?？梢栽O(shè)想通過中斷以上任一種生物功能來防治某些昆蟲。此外，TRP通道通常能被提供正常感覺經(jīng)驗的化學(xué)物質(zhì)激活。例如，辣椒中的辣椒素激活哺乳動物熱敏TRPV1通道產(chǎn)生熱感，而薄荷醇激活TRPM8通道產(chǎn)生涼感。在從辣根、催淚氣體等材料中發(fā)現(xiàn)的辛辣刺激物可激活TRPA1通道，俗稱山葵(wasabi)受體。TRPV1和TRPA1通道是最早采用cryo-EM解析結(jié)構(gòu)的TRP通道，進(jìn)而對化學(xué)物質(zhì)與這些通道的結(jié)合情況有了深入了解。辣椒素對TRPV1通道的親合力為70 nM，在商品化殺蟲劑的范圍內(nèi)。

黑腹果蠅()具有13個TRP通道，上述7個家族每家族至少有1個，表明所有的TRP通道家族在該昆蟲分化之前已進(jìn)化。在一項對6種昆蟲基因組的調(diào)查中，發(fā)現(xiàn)這些昆蟲均有13~14個TRP通道，包括2個TRPV，1個TRPN，1個TRPM，3個TRPC和1個TRPML。調(diào)查中的3種昆蟲有1個TRPP通道，但鱗翅目家蠶()、膜翅目意蜂()、麗蠅蛹集金小蜂()則沒有。TRPP被認(rèn)為是最古老的TRP通道家族，甚至在酵母中也存在，后來在某些昆蟲群體中消失了。

2.1 TRPC

除了TRP通道之外，蠅類還有一個TRPC家族成員，稱為類TRP通道TRPL，與TRP一樣參與光傳導(dǎo)，另外還參與冷感覺。TRP是Ca2+選擇性通道，而TRPL與其他大多數(shù)TRP通道一樣，為非選擇性陽離子通道，同樣運(yùn)輸Ca2+。蠅類還具有一個TRPC通道——TRPγ，其為在本體感覺性弦音器官(chordotonal organs)中表達(dá)的非選擇性陽離子通道，是控制精細(xì)運(yùn)動所必需的，但在專門感知重力和聲音的弦音器官——江氏器(Johnston’s organ)中并未發(fā)現(xiàn)該通道。

2.2 TRPP

存在于精子鞭毛中的果蠅TRPP通道是精子進(jìn)入雌蠅受精囊所必需的。雖然受精的中斷可能具有一定程度的害蟲防治作用，但可能還不足用于殺蟲劑的研究。哺乳動物多囊性腎病2的同源物Amo也稱為PKD2，其在凋亡細(xì)胞吞噬清除期對細(xì)胞內(nèi)Ca2+調(diào)節(jié)的作用尚不明確。

2.3 TRPM

單一果蠅TRPM通道在馬氏管中表達(dá)，為從血淋巴去除Mg2+所必需，其突變后喪失功能會導(dǎo)致高鎂血癥，幼蟲發(fā)育減慢，蛹前發(fā)育。該作用可因高鎂飲食而加劇。其他TRP通道影響昆蟲的感覺官能，它們的紊亂會干擾昆蟲行為，TRPM則是唯一具有直接致死突變表型的TRP通道，因此是殺蟲劑候選靶標(biāo)之一。由于鱗翅目和鞘翅目等咀嚼式植食性昆蟲的飲食中Mg2+含量高，故破壞TRPM通道可能尤為有效。

2.4. TRPML

在果蠅體內(nèi)，TRPML為位于內(nèi)溶酶體(endolysosomal)和質(zhì)膜中的磷脂酰肌醇3,5-二磷酸激活陽離子通道。雖然TRPML突變體表現(xiàn)嚴(yán)重的神經(jīng)變性和與受損線粒體自噬性清除作用的缺損相關(guān)的運(yùn)動障礙以及溶酶體囊泡積累，但如果TRPML被化學(xué)物質(zhì)破壞，還不明確這些影響使昆蟲失去行動能力會有多快。

2.5 TRPN

果蠅TRPN1通道nompC(no mechanoreceptor potential C)是高度靈敏的各種果蠅機(jī)械力感覺神經(jīng)元中的候選機(jī)械力信號傳導(dǎo)通道。成蠅機(jī)械力感覺毛的末梢可感知溫和的觸覺。果蠅幼蟲缺乏剛毛，體壁由2種類型的多樹突機(jī)械力感覺神經(jīng)元的樹突樹平鋪而成。在這些神經(jīng)元的IV類亞群中，非TRP通道的piezo通道傳導(dǎo)強(qiáng)烈的、有害的觸覺刺激，而在III類神經(jīng)元nompC中傳導(dǎo)溫和的觸覺。NompC在鐘形感器(campaniform sensillae)傳導(dǎo)表皮變形信號，在果蠅成蠅江氏器的聽覺傳導(dǎo)以及果蠅幼蟲側(cè)(pentascolopidial)弦音器檢測振動中不可或缺。NOMPC也存在于足部弦音器官的纖毛頂端，它也可能參與本體感覺的感覺傳導(dǎo)。由于NOMPC在觸覺、聽覺和本體感覺的敏感機(jī)械力感覺產(chǎn)生過程中的重要性以及這些感覺在社會互動和行為中的重要性，因此其可能是一個有效的殺蟲靶標(biāo)。無效突變體果蠅行為嚴(yán)重不協(xié)調(diào)，而化學(xué)修飾或可具有相同的效果。

2.6 TRPA

由于昆蟲個體較小，缺乏體溫調(diào)節(jié)能力，故其必須通過感受溫度來尋求最適于生長和繁殖且未被嚴(yán)重破壞的微環(huán)境。果蠅有4種TRPA通道——TRPA1、Painless (Pain)、Pyrexia (Pyx)和water witch (Wtrw)。除Wtrw外，其他3種都參與溫度感覺。果蠅的TRPA1、Pain、Pyx直接由溫度變化門控，被稱為thermoTRP。果蠅TRPV、TRPC和TRPP家族的成員也有一定溫度感覺作用，但不是thermTRP，是主要溫度感受器的下游部分。

果蠅TRPA1通道參與傷害刺激感受(檢測有害觸覺)、炎癥及對異硫氰酸烯丙酯等有毒化學(xué)物質(zhì)的敏感性。果蠅至少表達(dá)4種具不同N末端細(xì)胞內(nèi)區(qū)域的TRPA1亞型，它們具有不同的溫度感覺特性。TRPA1-A在26 ℃時開啟，以感應(yīng)舒適范圍內(nèi)的溫度。TRPA1-D在34 ℃時打開，此溫度太低則無法直接介導(dǎo)對39 ℃以上發(fā)生的有毒害作用的熱(noxious heat)響應(yīng)。盡管已知TRPA1、Pain(激活溫度閾值為39~42 ℃)和Pyx (46 ℃時開啟)3種thermTRP均參與對有毒害作用的熱的響應(yīng)，但這3種通道各自的作用還不明確。TRPA1還使幼蟲躲避高強(qiáng)度光，但機(jī)制未知，也可能與味覺感受器相關(guān)。TRPA1的B和C亞型不具有溫度敏感性，但所有的亞型均可被異硫氰酸烯丙酯激活。

膜翅目意蜂和麗蠅蛹集金小蜂沒有TRPA1通道，但具有HsTRPAs(膜翅目特異性TRPAs)，由基因重組進(jìn)化而來，為感知溫度升高的溫度感受器。因此有人提出在HsTRPA具有溫度敏感性后，TRPA1就在膜翅目中喪失了。

TRPA1對溫度波動的感知在控制晝夜節(jié)律和昆蟲發(fā)育中也很重要。此外，哺乳動物和鳥類等恒溫動物的外寄生蟲利用基于TRPA1通道的熱敏感來尋找寄主，并在這些寄主上找到最佳取食部位。事實(shí)上，植物源驅(qū)避劑香芹酚和-松油醇可激活瓦螨TRPA1L通道，但不激活蜜蜂的HsTRPA通道，抑制螨進(jìn)入蜂群的巢房，表明了在養(yǎng)蜂中使用激活TRPA1的化合物防治害螨的潛力。TRPA1控制-Gq/磷脂酶C信號級聯(lián)反應(yīng)的下游，也是果蠅避開驅(qū)避劑香茅醛所需，而岡比亞按蚊()的TRPA1由香茅醛直接激活。

Pain和Pyx在有毒害影響的熱感知中的作用已在上文提及。這2種通道也參與弦音器重力感知，Pain還參與強(qiáng)刺激機(jī)械力感知。

由于昆蟲比表面積大，對濕度特別敏感，濕度感知對昆蟲的生存至關(guān)重要。在果蠅觸角第3節(jié)的特定感覺毛中表達(dá)，為感知潮濕空氣和弦音器中的機(jī)械力感覺放大所必需(見下文)。

膜翅目、鞘翅目和鱗翅目的一些昆蟲還有一個TRPA通道——TRPA5。目前暫未對此通道的功能進(jìn)行研究，但其在觸角中的表達(dá)表明它可能具有嗅覺功能。

2.7 TRPV

瞬時感受電位香草素受體亞家族離子通道(TRPV)是唯一已被確定的商業(yè)化殺蟲劑的靶標(biāo)TRP。昆蟲有Nanchung(Nan)和Inactive(Iav)2個TRPV通道亞基，它們在果蠅中僅在弦音神經(jīng)元(chordotonal neurons)中共表達(dá)，形成能被吡啶甲亞胺類(pyridine azomethine derivative)殺蟲劑吡蚜酮和pyrifluquinazon激活的異聚體(heteromers)。弦音器是昆蟲軀體大多數(shù)關(guān)節(jié)中具有的牽張受體，由關(guān)節(jié)連接部件的相對運(yùn)動引起的牽張激活。在大多數(shù)關(guān)節(jié)中，弦音器官負(fù)責(zé)關(guān)節(jié)角度和運(yùn)動，提供本體感覺，但是果蠅第2、3節(jié)觸角間關(guān)節(jié)中的一個弦音器——被稱為江氏器，負(fù)責(zé)觸角在重力、風(fēng)和聲音影響下的運(yùn)動，所以參與平衡、空氣運(yùn)動和聽覺的感知。此外，許多昆蟲還具有鼓膜聽覺器官，其內(nèi)一個弦音器傳導(dǎo)薄表皮膜的感應(yīng)，進(jìn)行聲音感知。

于1999年上市的吡蚜酮是一種內(nèi)吸性殺蟲劑，對刺吸式口器害蟲具有顯著的選擇性，導(dǎo)致害蟲立即從植物中取出口針和停止進(jìn)一步探測等特定的行為效應(yīng)，沒有其他神經(jīng)活性殺蟲劑典型的擊倒或麻痹作用。2007年推出的pyrifluquinazon是具有相似特性的吡蚜酮類似物。這2種殺蟲劑可造成害蟲不能進(jìn)食繼而饑餓，致死作用緩慢。關(guān)于這些殺蟲劑的作用機(jī)制的第一個真實(shí)跡象是觀察到以吡蚜酮飼喂或注射處理蝗蟲可導(dǎo)致它們后足抬起，脛節(jié)伸展。以控制股脛關(guān)節(jié)的反饋環(huán)為模型的研究清晰地表明吡蚜酮特異性地激活了通常由關(guān)節(jié)屈曲激活的股骨弦音器官。神經(jīng)系統(tǒng)錯誤地將關(guān)節(jié)記錄為彎曲的，反射性地激活伸肌延長脛節(jié)。該化合物對“翅膀鉸鏈”(wing hinge)和肩板(tegula)中的弦音器官具有相似的作用，但不影響腹板突上的感覺毛，脛節(jié)和亞前緣脈(subcostal vein)上的鐘形感器或“翅膀鉸鏈”中的非弦音牽張受體，即得出它對所有的弦音器官有選擇性作用的結(jié)論。吡蚜酮同樣可選擇性地作用于螽斯鼓膜的弦音器、果蠅成蟲的江氏器和果蠅幼蟲pentascolopidial的弦音器，則進(jìn)一步證實(shí)了這一結(jié)論。

弦音器官神經(jīng)元具有特異性功能。作為聲音、重力和風(fēng)的傳感器，蠅類昆蟲的江氏器是最復(fù)雜的弦音器官之一，具有能感應(yīng)不同頻率振動以及風(fēng)和重力的5個弦音神經(jīng)元亞群。盡管對各類江氏器神經(jīng)元的機(jī)械力傳導(dǎo)機(jī)制尚不清楚，但所有這些神經(jīng)元對機(jī)械刺激的神經(jīng)反應(yīng)都需要異源Nan-Iav TRPV通道，吡蚜酮和pyrifluquinazon對這些通道的活化激活了所有江氏器神經(jīng)元以及幼蟲pentascolopidial神經(jīng)元中Ca2+信號傳導(dǎo)，證實(shí)了所有弦音器官均受到吡蚜酮的影響。

表1 昆蟲TRP通道及其功能，作為殺蟲劑或驅(qū)避劑靶標(biāo)的價值

其他TRP通道只對某些弦音神經(jīng)元是必不可少的。而Iav或Nan的突變導(dǎo)致弦音神經(jīng)功能喪失，中斷聽力和重力感知能力，無效nompC具有特定的 聽覺缺陷。機(jī)械力感覺毛和其他機(jī)械力感覺器官也需要NompC才能產(chǎn)生正常的功能。在江氏器中需要TRP、TRPL、2個TRPC通道以及TRPA通道Wtrw進(jìn)行機(jī)械力感覺放大，而TRPA通道基因和基因的突變干擾重力感知而非聽覺。如上所述，這些通道還有其他感覺功能(表1)。上文也提及，本體感覺性弦音神經(jīng)元中具有TRPC通道TRPγ，但江氏器中不需要。

Iav和Nan以異源TRPV通道的亞基在弦音神經(jīng)元中同時存在，能被吡啶甲亞胺類殺蟲劑激活，但兩者單獨(dú)分布時分布范圍更廣。Iav在運(yùn)動神經(jīng)元中表達(dá)(沒有Nan)，可影響突觸前靜息Ca2+濃度，是突觸發(fā)育和功能的重要調(diào)節(jié)劑。Nan在蠅幼蟲的某些多樹突神經(jīng)元和果蠅的第3節(jié)觸角的感覺毛中表達(dá)，對干燥空氣作出響應(yīng)，即Nan是避開干燥空氣所必需的。由于Nan和Iav似乎沒有形成功能性同聚物(functional homomers)，所以可能與所在細(xì)胞中的其他成分形成功能性異聚體(functional heteromers)，但是還未被證實(shí)。然而，吡蚜酮或pyrifluquinazon僅誘導(dǎo)弦音神經(jīng)元中的鈣信號，而不是在僅表達(dá)Nan的幼蟲多樹突神經(jīng)元或成蟲濕感受器中。

3 結(jié) 語

TRP通道在所有感覺形成過程中具有信號傳導(dǎo)作用，通?？梢员换瘜W(xué)物質(zhì)激活。隨著對吡啶甲亞胺類殺蟲劑吡蚜酮和pyrifluquinazon選擇性激活昆蟲TRPV通道的闡明，最近才了解了殺蟲劑對TRP通道和感覺功能的具體作用。目前沒有其他已知作用于TRP通道的殺蟲劑，也還未明確其他11或12種昆蟲TRP通道中哪種是合適的殺蟲劑靶標(biāo)?，F(xiàn)已知香茅醛、香芹酚和-松油醇等一些驅(qū)避劑作用于TRPA1通道。由于膜翅目昆蟲缺乏TRPA1通道，故已對TRPA1作為瓦螨等蜜蜂寄生蟲的驅(qū)避劑的適合靶標(biāo)進(jìn)行了研究。

10.16201/j.cnki.cn31-1827/tq.2017.02.02

TQ450

A

1009-6485(2017)02-0009-05

筱禾，女，工程師。Tel: 021-64387891-201。

2016-03-31。