趙 南，劉義雄，徐永華，周金龍，宋革命，徐 勇

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赤霉酸GA4+7提取預(yù)處理酶法工藝研究

趙 南，劉義雄，徐永華，周金龍，宋革命，徐 勇

(江西新瑞豐生化有限公司，江西新干 331300)

考查復(fù)合酶預(yù)處理工藝在赤霉酸GA4+7提取生產(chǎn)中的應(yīng)用效果。GA4+7發(fā)酵液提取預(yù)處理工藝，采用復(fù)合酶酶解替代傳統(tǒng)的重金屬鹽類絮凝，配合后續(xù)工段的調(diào)整，形成完整的赤霉酸GA4+7提取新工藝。相比傳統(tǒng)工藝，新工藝提取收率增幅達(dá)23.3%，極大提高產(chǎn)品的收率水平，適用于工業(yè)化生產(chǎn)。

赤霉酸GA4+7；預(yù)處理；復(fù)合酶

赤霉酸GA4+7屬赤霉素類植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，是GA4和GA7的混合物，其對(duì)于植物的生理學(xué)功能與GA3不同。在100多種赤霉素同系物中，GA4+7和GA3更具使用價(jià)值和商業(yè)價(jià)值，尤以前者為甚[1]。目前GA4+7產(chǎn)品在國(guó)內(nèi)和歐美一些國(guó)家有著較廣泛的應(yīng)用。隨著其應(yīng)用領(lǐng)域的不斷拓展，GA4+7產(chǎn)品的市場(chǎng)容量亦逐步擴(kuò)大。

在工業(yè)微生物領(lǐng)域，發(fā)酵液往往需經(jīng)過預(yù)處理后進(jìn)入下游提取[2-3]。常見的預(yù)處理手段有調(diào)節(jié)pH等電點(diǎn)法，加鹽絮凝沉降蛋白法，助濾劑(如硅藻土、珍珠巖粉)法，絮凝劑聚合法等。對(duì)于赤霉酸類GA3發(fā)酵液預(yù)處理，中科院趙彥修等[4]通過添加硫酸鋁獲得良好的效果，此外調(diào)節(jié)pH等電點(diǎn)法應(yīng)用也較為普遍。而赤霉酸類GA4+7發(fā)酵液組分與GA3相比差異較大，目前通行的預(yù)處理工藝是采用黃血鹽、硫酸鋅2種鹽類協(xié)同作用使料液產(chǎn)生絮凝以實(shí)現(xiàn)固液分離。該工藝的特點(diǎn)是濾液清澈、過濾速度快。但同時(shí)存在較大缺陷，即鹽類本身對(duì)產(chǎn)品產(chǎn)生的破壞，加之絮凝結(jié)團(tuán)易導(dǎo)致菌絲內(nèi)產(chǎn)品釋放受阻，頂洗不徹底，影響收率；添加鹽類后極大提高濾液滲透壓，無法應(yīng)用先進(jìn)的膜分離工藝進(jìn)行下游濃縮，只能選擇落后的薄膜蒸發(fā)工藝；后者工作能耗大，料溫高(50 ℃左右)，產(chǎn)品易受熱被破壞；濾渣內(nèi)富含重金屬物質(zhì)，存在環(huán)保問題。

本研究擬建立全新的酶法預(yù)處理工藝，以提高收率，更新濃縮方式，解決環(huán)保等問題。

1 材料與方法

1.1 材料

赤霉酸GA4+7發(fā)酵液，江西新瑞豐生化有限公司生產(chǎn)；纖維素酶、溶菌酶、酸性蛋白酶，市場(chǎng)購(gòu)買；中速定型性濾紙，市場(chǎng)購(gòu)買；722N可見分光光度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司；中試納濾膜設(shè)備ZNF2540L-1，廈門征成膜清洗科技有限公司；納濾膜芯NF-90(分子量200)，廈門征成膜清洗科技有限公司；高效液相色譜儀LC-10ATVP，日本島津。

1.2 方法

1.2.1 復(fù)合酶及作用條件的確定

用正交試驗(yàn)法[5]研究了復(fù)合酶的最佳組合以及最適作用pH。

1.2.2 濾速測(cè)定

以單層中性定性濾紙作為介質(zhì)，自然過濾5 min，收集濾液，計(jì)量體積作為濾速參數(shù)。

1.2.3 濾液質(zhì)量測(cè)定

用722N可見分光光度計(jì)在666 nm波長(zhǎng)條件下，以蒸餾水空白歸零修正，測(cè)定濾液吸光值，濾液質(zhì)量與其呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。

1.2.4 納濾膜分離濃縮方法

將NF-90納濾膜芯安裝于小試膜設(shè)備上，成一納濾系統(tǒng)。濾洗液過膜，控制進(jìn)膜壓力16~18 bar，出膜壓力13.7~15.3 bar，透析液為水及小分子物質(zhì)，棄去。回流液內(nèi)含產(chǎn)品重回原料儲(chǔ)罐中循環(huán)處理，達(dá)到濃縮目的，當(dāng)其體積為初始濾液體積1/6左右時(shí)，終止納濾，收集濃縮液。計(jì)量體積，檢測(cè)濃縮液含量，考查收率。

1.2.5 HPLC測(cè)定含量

StableBond C18反相柱；柱溫：35 ℃；檢測(cè)器：UV 210 nm；流動(dòng)相：甲醇67%、水33%、甲酸0.05%；流速：0.7 mL/min；進(jìn)樣體積：20 μL。進(jìn)樣濃縮液，測(cè)定GA4+7的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)合預(yù)處理酶的選型及配伍組分比例確定

赤霉酸GA4+7發(fā)酵液內(nèi)固形物組分主要為目標(biāo)產(chǎn)物、菌絲體(內(nèi)含胞內(nèi)物質(zhì)及部分目標(biāo)產(chǎn)物)、培養(yǎng)基殘料(蛋白質(zhì)、糖類、無機(jī)鹽等)。選擇纖維素酶、溶菌酶作用于菌絲體，促其破壁釋放目標(biāo)產(chǎn)物。殘料中蛋白質(zhì)具有一般膠體性質(zhì)，選擇酸性蛋白酶對(duì)培養(yǎng)基殘料中蛋白質(zhì)進(jìn)行適度水解，使其絮凝沉降成為濾渣。本研究在常溫、復(fù)合酶添加比例0.05%，酶解1 h的條件下預(yù)處理GA4+7發(fā)酵液，以原工藝(加鹽絮凝)為對(duì)照，考查新工藝的濾速、濾液質(zhì)量、效價(jià)等指標(biāo)，確定最優(yōu)預(yù)處理復(fù)合酶配方。

2.1.1 正交試驗(yàn)

設(shè)定纖維素酶、溶菌酶、酸性蛋白酶、pH作為4個(gè)因素，復(fù)合酶總量按6份計(jì)，各因素以1份、2份、3份設(shè)定3個(gè)水平，pH分別設(shè)定4.0、5.0、6.0 3個(gè)水平。對(duì)4個(gè)因素進(jìn)行正交試驗(yàn)(表1)。

表1 正交試驗(yàn)

注：對(duì)照效價(jià)以100%計(jì)，以下該指標(biāo)數(shù)據(jù)處理與此相同。

表2 結(jié)果統(tǒng)計(jì)

表2數(shù)據(jù)表明，當(dāng)將發(fā)酵料液pH控制在6.0時(shí)，各項(xiàng)指標(biāo)數(shù)據(jù)均處于最高水平；就核心指標(biāo)效價(jià)而言，纖維素酶3份、溶菌酶1份、酸性蛋白酶2份配伍組合效果最優(yōu)；與對(duì)照組相比，各組合對(duì)濾速、濾液質(zhì)量的影響并不明顯；根據(jù)各因素隨水平變化表現(xiàn)的趨勢(shì)看，纖維素酶可在上限基礎(chǔ)上適當(dāng)增加比例，溶菌酶可在下限基礎(chǔ)上適當(dāng)減少比例，酸性蛋白酶于2水平處效果最優(yōu)；經(jīng)修正后，確定酶解pH 6.0最適控制點(diǎn)，復(fù)合預(yù)處理酶配伍組合為纖維素酶52%、溶菌酶33%、酸性蛋白酶15%。

2.1.2 配方效果驗(yàn)證

將上述配制復(fù)合酶添加于發(fā)酵液中酶解，與對(duì)照鹽析預(yù)處理工藝進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果見表3。

結(jié)果表明酶解預(yù)處理工藝具有良好的增產(chǎn)效果，同時(shí)對(duì)過濾工序的運(yùn)行工效及濾液質(zhì)量并未產(chǎn)生不利影響。

2.2 復(fù)合預(yù)處理酶添加比例確定

在確定復(fù)合酶配方基礎(chǔ)上，通過添加系列梯度用量復(fù)合酶進(jìn)行小試，考查收率、濾液質(zhì)量等指標(biāo)，確定適用于生產(chǎn)實(shí)際的最佳復(fù)合酶用量。

表3 酶解工藝與原工藝效果對(duì)比

表4 復(fù)合酶梯度用量小試研究

由表4可知，復(fù)合酶添加用量為0.08%時(shí)，在保證過濾工序進(jìn)度和濾液質(zhì)量的前提下，能大幅提高過濾工序的收率水平。

2.3 下游濃縮工藝重建

傳統(tǒng)濾液因富含鹽類，滲透壓較高，故選擇薄膜蒸發(fā)法濃縮。但此法50 ℃左右的高溫對(duì)產(chǎn)品有一定程度的破壞，且能耗較大，運(yùn)行成本高。由復(fù)合酶替代鹽類進(jìn)行發(fā)酵液預(yù)處理后，濾液滲透壓大幅降低，可應(yīng)用先進(jìn)的膜分離工藝進(jìn)行下游濃縮。通過考查納濾透析通量變化、工作時(shí)間、濃縮倍數(shù)、工段收率等指標(biāo)，評(píng)估納濾膜分離的濃縮效果。

2.3.1 納濾膜濃縮運(yùn)行功效考查

復(fù)合酶預(yù)處理后，收集板框?yàn)V液，采用中試納濾膜分離系統(tǒng)進(jìn)行分離濃縮。以物料濃縮至6倍作為控制終點(diǎn)，監(jiān)測(cè)期間通量變化，同期以自來水進(jìn)膜分離為對(duì)照，確定納濾膜分離的濃縮適用性。結(jié)果見圖1、圖2。

2.3.2 納濾濃縮對(duì)收率的影響

將同一板框?yàn)V液均分2組，分別采用納濾分離、薄膜蒸發(fā)2種方式進(jìn)行濃縮，結(jié)果見表5。

由表5可知，相比傳統(tǒng)薄膜蒸發(fā)法，納濾分離工藝無論是運(yùn)行工效，還是技術(shù)指標(biāo)都具有明顯優(yōu)勢(shì)。

表5 納濾、薄膜蒸發(fā)工藝濃縮效果及收率比較

圖1 濃縮液體積隨時(shí)間變化趨勢(shì)

圖2 通量隨時(shí)間變化趨勢(shì)

2.4 新工藝整合后試產(chǎn)驗(yàn)證效果及對(duì)技術(shù)指標(biāo)的影響

整合以上試驗(yàn)結(jié)果形成完整工藝體系，并應(yīng)用于工業(yè)化試生產(chǎn)，同時(shí)采用原工藝作為對(duì)照，連續(xù)8批次驗(yàn)證結(jié)果見表6。

表6 新工藝試生產(chǎn)水平驗(yàn)證

由表6可見，應(yīng)用復(fù)合酶預(yù)處理結(jié)合納濾濃縮工藝能極大提高板框、濃縮二工段收率，后續(xù)工段無異常，對(duì)總收率水平的提升效果明顯。之后各批成品檢測(cè)數(shù)據(jù)顯示，所有批次產(chǎn)品質(zhì)量指標(biāo)均符合標(biāo)準(zhǔn)要求，進(jìn)一步證明新工藝適用于規(guī)?；a(chǎn)。

3 結(jié) 論

預(yù)處理酶作為一種具有催化能力的蛋白質(zhì)，應(yīng)用于工業(yè)微生物提取領(lǐng)域是創(chuàng)新式嘗試，并獲得了良好的試驗(yàn)效果。本文針對(duì)赤霉酸GA4+7收率水平不高的瓶頸問題，通過酶法研究，篩選出預(yù)處理復(fù)合酶最優(yōu)組合，即纖維素酶52%、溶菌酶33%、酸性蛋白酶15%，確定了適宜的處理?xiàng)l件pH 6.0及0.08%的添加比例。通過酶解作用，促進(jìn)菌絲體內(nèi)目標(biāo)產(chǎn)物充分釋放，改善發(fā)酵液流變狀態(tài)，利于后提取工序順暢銜接，在提高產(chǎn)品總收率、降低單位生產(chǎn)成本的同時(shí)能夠?qū)υ泄に圀w系進(jìn)行重建，淘汰落后的高能耗生產(chǎn)方式，避免了鹽析濾渣產(chǎn)生的重金屬污染問題，最終實(shí)現(xiàn)經(jīng)濟(jì)效益、能源效益、生態(tài)效益的全面提高。通過酶法工藝產(chǎn)生的板框?yàn)V渣富含蛋白質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，后續(xù)研究將對(duì)內(nèi)含物質(zhì)進(jìn)行組分分析，探索建立適宜的加工方法，把濾渣處理成為符合相關(guān)要求的動(dòng)物飼料或作物有機(jī)肥，變廢為寶，推動(dòng)赤霉酸GA4+7循環(huán)經(jīng)濟(jì)進(jìn)一步發(fā)展。

[1] 顏方貴, 秦杰, 何增國(guó), 等. 赤霉素A4、A7的研究進(jìn)展[J]. 微生物學(xué)通報(bào), 1994, 21(3): 163.

[2] 俞俊堂, 唐孝宣, 鄔行彥. 新編生物工藝學(xué)[M]. 北京: 化學(xué)工業(yè)出版社, 2009: 1－21.

[3] 俞文和. 新編抗生素工藝學(xué)[M]. 北京: 中國(guó)建材工業(yè)出版社, 1996: 10－23.

[4] 趙彥修, 張露茜. 赤霉素發(fā)酵液的絮凝預(yù)處理研究[J]. 微生物學(xué)通報(bào), 1994, 21(1): 3－5.

[5] 廖永平. 質(zhì)量管理常用統(tǒng)計(jì)技術(shù)與方法[M]. 北京: 中國(guó)科學(xué)技術(shù)出版社, 1999: 198－204.

Study on the Effects of Enzyme Pretreatment on Extraction of GA4+7

ZHAO Nan, LIU Yixiong, XU Yonghua, ZHOU Jinlong, SONG Geming, XU Yong

(Jiangxi New Reyphon Biochemical Ltd., Xingan 331307, Jiangxi, China)

The effect of pretreatment technology with complex enzyme on gibberellinGA4+7 extraction was investigated. The extraction pretreatment process of the gibberellins GA4+7 fermentation broth changes from the traditional heavy metal salts flocculation to the complex enzyme hydrolysis, combined with the subsequent section adjustment, and is a new gibberellins GA4+7 extraction technology.Compared with the traditional process, the extraction yield increased by 23.3%.The new technology can greatly improve the yield of products, and is suitable for industrial production.

gibberellins GA4+7; pretreatment; compound enzyme

10.16201/j.cnki.cn31-1827/tq.2017.02.07

TQ450

A

1009-6485(2017)02-0034-04

江西省優(yōu)勢(shì)科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)建設(shè)計(jì)劃項(xiàng)目(20152BCB24012)

趙南(1973—)，高級(jí)工程師，江西南昌人，從事工業(yè)微生物菌種、發(fā)酵、提取研究。

2017-03-08。