孫俊

摘要：為了對遼寧省近年發(fā)生的新病害——榛子葉斑病病原菌的生物學(xué)特性進(jìn)行系統(tǒng)測定。采用已經(jīng)鑒定并報道的榛子葉斑病致病菌榛葉點霉（Phyllosticta coryli）菌株分別置于設(shè)定條件下，采用十字交叉法測量菌落直徑，分別測定該病原菌菌絲及分生孢子的生物學(xué)特性，對該病害的癥狀及病原菌形態(tài)進(jìn)行描述，并對病菌的生物學(xué)特性進(jìn)行系統(tǒng)測定。病菌菌絲生長以PSA培養(yǎng)基最適，能有效利用多種糖和氮源，分別以麥芽糖和甘氨酸最佳，菌絲適宜生長溫度為20～25 ℃，最適pH值為7～9，光照可促進(jìn)菌絲生長，菌絲致死溫度61 ℃。病菌分生孢子萌發(fā)適宜溫度為15～25 ℃，最適pH值為5，黑暗條件下對孢子更易萌發(fā)，分生孢子致死溫度58 ℃。對病原菌菌絲和分生孢子的生物學(xué)特性系統(tǒng)測定結(jié)果表明，不同培養(yǎng)條件下，病原菌菌絲生長和分生孢子萌發(fā)均表現(xiàn)出明顯的差異。

關(guān)鍵詞：榛子；葉斑病；榛葉點霉；菌落直徑；生長溫度；生物學(xué)特性

中圖分類號： S436.64文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2017）07-0101-03

榛子（Corylus heterophlla Fischl）為榛科榛屬木本植物的球果，別稱平榛、榛、棰子等。榛子為堅果，果形似栗子，紅棕色或金黃褐色，并著彩色條紋[1]，廣泛分布于東北、華北及陜西、甘肅等地。榛子有“堅果之王”的美稱，與扁桃、胡桃、腰果并稱“四大堅果”。其堅果營養(yǎng)豐富，用途廣泛，經(jīng)濟(jì)價值高，是加工各種巧克力、糖果、冰淇淋以及榛子粉和榛子乳等高級營養(yǎng)品的重要原料[2]，還具有消炎、防心血管疾病、增強(qiáng)性功能、養(yǎng)顏護(hù)膚、延年益壽和抗衰老的功效[3]。而隨著榛子的營養(yǎng)價值和藥用價值逐漸被人們重視，種植面積快速增加，隨之而來是病害的發(fā)生嚴(yán)重。2011年8月，筆者在遼寧省瓦房店市炮臺鎮(zhèn)首次發(fā)現(xiàn)榛子葉斑病，隨后在遼寧省撫順章黨基地也發(fā)現(xiàn)該病的發(fā)生。

榛子葉斑病由葉點霉屬（Phyllosticta）真菌引起。Saccardo于1884年首次對榛子葉斑病進(jìn)行記載，病原菌為榛葉點霉（Phyllosticta coryli）[4]。筆者曾對中國遼寧省新見發(fā)生的榛子葉部病害進(jìn)行初步研究，并經(jīng)柯赫氏法則證病，結(jié)合分離菌株的ITS序列分析，鑒定其致病菌為榛葉點霉，認(rèn)為該病害為榛子葉斑病并對其進(jìn)行了相關(guān)報道[5]。

園地調(diào)查發(fā)現(xiàn)，在榛子結(jié)果期，高溫高濕條件下的榛子葉斑病的發(fā)生率顯著增加。近年來，病害發(fā)生面積呈擴(kuò)展趨勢。榛子葉斑病菌主要危害榛子的葉片，初期在葉片正反兩面均產(chǎn)生針尖大小的褐色斑點，隨后病斑逐漸擴(kuò)大，病斑直徑3～9 mm，病斑邊緣顏色較中間顏色稍淺。嚴(yán)重時葉片干枯脫落，影響產(chǎn)量。濕度大時，病斑上生有小黑點，即為病菌的分生孢子器（圖1-A）。利用病菌孢懸液接種榛子葉片后，室溫保濕， 8～10 d葉片開始表現(xiàn)癥狀，葉面出現(xiàn)針尖大小褪綠斑，后擴(kuò)展至圓形至橢圓形褐色病斑（圖1-B），表現(xiàn)癥狀與園地癥狀一致。

在PDA培養(yǎng)基中培養(yǎng)10 d左右，菌落呈灰白色，氣生菌絲短而致密；隨著培養(yǎng)時間的不斷加長，菌落顏色逐漸變深，呈灰黑色，在菌落上產(chǎn)生分生孢子器。分生孢子器球形，深褐色，直徑150～205 m（圖2-A）。分生孢子單胞，無色，卵圓形至橢圓形，大小在（2.4～4.5） m×（1.6～2.4） m（圖2-B）。

本研究針對榛子葉斑病致病菌的生物學(xué)特性進(jìn)行了較為系統(tǒng)的測定，以便進(jìn)一步為該病害的深入研究提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1病菌菌絲生長測定

將純化的菌株進(jìn)行活化，在試驗設(shè)定條件下接種病菌單孢子，25 ℃恒溫培養(yǎng)，10 d后采用十字交叉法測量菌落直徑。每處理5次重復(fù)[6]。

1.1.1培養(yǎng)基試驗選用PDA、PSA、OA、玉米粉培養(yǎng)基、水瓊脂培養(yǎng)基、Rechard、Czapek和孟加拉紅培養(yǎng)基。

1.1.2碳源試驗供試碳源為木糖、可溶性淀粉、麥芽糖、葡萄糖、果糖、甘露醇、乳糖、山梨醇，PDA為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，不同碳源等量置換葡萄糖[7]。

1.1.3氮源試驗供試氮源分別選用蛋白胨、丙氨酸、胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、精氨酸、甲硫氨酸，查氏為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，不同氮源等量置換KNO3。

1.1.4溫度試驗用PDA培養(yǎng)基，分別置于5、10、15、20、25、30、35 ℃不同溫度下恒溫培養(yǎng)。

1.1.5pH值試驗用1 mol/L HCl和1 mol/L NaOH將PDA培養(yǎng)基pH值分別調(diào)節(jié)為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0。

1.1.6光照試驗采用PDA平板培養(yǎng)基，分別置于24 h/d光照條件、12 h光照與12 h黑暗交替、24 h黑暗條件下培養(yǎng)。

1.2菌絲致死溫度試驗

將直徑為4 mm的菌片移入裝有10 mL無菌水的試管中，再將試管分別置于40～80 ℃（梯度為5 ℃）9個處理溫度的恒溫水浴鍋中處理10 min（預(yù)熱1 min），測得致死溫度范圍后，以1 ℃為梯度求得準(zhǔn)確的致死溫度。試驗重復(fù)處理5次。

1.3分生孢子萌發(fā)測定

每處理重復(fù)5次，培養(yǎng)24 h后每次隨機(jī)鏡檢100個孢子，統(tǒng)計萌發(fā)率[6]。

1.3.1溫度對分生孢子萌發(fā)的影響經(jīng)預(yù)備試驗后，選用孢子清水萌發(fā)法，將分生孢子配成濃度適當(dāng)?shù)膽腋∫?，滴于載玻片上，分別置于5、10、15、20、25、30、35 ℃條件下培養(yǎng)。

1.3.2pH值對分生孢子萌發(fā)的影響用磷酸鹽緩沖液將分生孢子懸浮液pH值調(diào)配為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0，25 ℃恒溫培養(yǎng)。

1.3.3光照對分生孢子萌發(fā)的影響將分生孢子懸浮液滴在載玻片上，分別置于光照、光照與黑暗交替、黑暗條件下，25 ℃ 恒溫培養(yǎng)。

1.4分生孢子致死溫度測定

清水配制孢懸液，裝入試管中，置于35～60 ℃（梯度為 5 ℃）恒溫水浴鍋中處理10 min（預(yù)熱1 min），測得致死溫度范圍后，以1 ℃為梯度求得準(zhǔn)確的致死溫度。

2結(jié)果與分析

2.1環(huán)境條件對病菌菌絲生長的影響

2.1.1培養(yǎng)基對菌絲生長的影響病菌菌絲在PSA培養(yǎng)基中生長最快，其次為PDA培養(yǎng)基；在Rechard培養(yǎng)基中生長速度最慢（表1）。從菌落形態(tài)和顏色看，病菌在水瓊脂中稀疏且菌落呈薄透明狀，在其他各培養(yǎng)基中均生長致密，在OA培養(yǎng)基、玉米粉培養(yǎng)基、PDA、PSA中菌落呈局部放射狀溝痕。

2.1.2碳源對菌絲生長的影響病原菌可利用多種糖，在以麥芽糖為碳源的培養(yǎng)基上菌絲生長最快，在以木糖為碳源的培養(yǎng)基上生長最慢（表2）。

2.1.3氮源對菌絲生長的影響病菌在不同氮源中生長差異顯著，其中尤以甘氨酸、蛋白胨最適合菌絲生長，在含精氨酸的培養(yǎng)基上菌絲幾乎不生長（表3）。

2.1.4溫度對菌絲生長的影響溫度對病菌生長影響明顯，菌絲在5～35 ℃范圍內(nèi)均能擴(kuò)展，20～25 ℃為最適宜溫度。低于5 ℃或高于35 ℃均不利于病菌菌絲生長（圖3）。

2.1.5pH值對菌絲生長的影響菌絲生長的pH值范圍為3～11，pH值3～4范圍內(nèi)，隨pH值增高菌絲生長速度明顯加快；pH值7～9時，菌落生長速度最快，為該菌最適宜生長的pH值。可見，偏堿性條件有利于菌絲生長（圖4）。

2.1.6光照對菌絲生長的影響菌絲在光照條件、光暗交替條件下菌落直徑分別為6.50、6.45 cm顯著高于黑暗條件下的4.77 cm。說明不同光照處理對菌絲生長的影響存在一定差異，光照條件更有利于菌絲生長。

2.1.7菌絲致死溫度當(dāng)處理溫度達(dá)61 ℃后，無菌絲生長，表明該菌菌絲致死溫度為61 ℃。

2.2環(huán)境條件對分生孢子萌發(fā)的影響

2.2.1溫度對孢子萌發(fā)的影響從圖5可以看出，溫度對分生孢子萌發(fā)的影響較大，15～25 ℃為萌發(fā)最適溫度，24 h萌發(fā)率接近80%，低于10 ℃或高于30 ℃嚴(yán)重抑制分生孢子的萌發(fā)。

2.2.2pH值對孢子萌發(fā)的影響病菌分生孢子萌發(fā)的pH值范圍為3～11，最適pH值為5。pH值3、11時，病菌分生孢子萌發(fā)率極低（圖6）。

2.2.3光照對孢子萌發(fā)的影響黑暗條件下孢子萌發(fā)率為71.67%，明顯高于光照條件下的35.46%和光暗交替條件下的53.07%，可見黑暗條件促進(jìn)孢子萌發(fā)。

2.2.4分生孢子致死溫度測定病菌的分生孢子經(jīng)≥58 ℃的幾個溫度處理后，均不萌發(fā)，表明該菌分生孢子的致死溫度為58 ℃。

3討論

Saccardo于1884年首次對榛子葉斑病進(jìn)行記載，確定其病原為榛葉點霉[4]。于莉等于1994年首次在吉林地區(qū)發(fā)現(xiàn)榛葉點霉生于榛葉片上[7]。筆者于2013年在遼寧地區(qū)首次發(fā)現(xiàn)該病，并以報道[5]。此外，未見相關(guān)榛子葉斑病的報道。葉點霉能寄生于多種草本和木本植物的葉片上，在條件適宜的情況下，可對植株進(jìn)行侵染并引起葉斑類病害，如小葉黃楊葉斑?。≒. spinarum）[8]，龍眼白星病（P. dimocarpi）[9]，八仙花葉斑?。≒. hydrangeae）[10]等。

本試驗在鑒定確準(zhǔn)為榛葉點霉基礎(chǔ)上，首次對該病原菌的生物學(xué)特性進(jìn)行系統(tǒng)研究。研究結(jié)果表明，榛葉點霉的適宜生長范圍為20～25 ℃，最適溫度25 ℃，與此病在遼寧省5月下旬至6月上旬開始發(fā)病，6—7月高溫多雨季節(jié)有利于病害迅速傳播蔓延的發(fā)病規(guī)律相吻合。有關(guān)病菌的生物學(xué)特性研究，未見相關(guān)報道。在PDA培養(yǎng)基中，該菌的pH值適應(yīng)范圍較寬，在pH值3～11下均可生長，在pH值7～9即偏堿性的條件下菌絲生長較快，而適合孢子萌發(fā)的pH值相對較窄為pH值4～8，在pH值5～7即酸性條件下孢子萌發(fā)率最高。該病原菌生長對營養(yǎng)要求并不嚴(yán)格，多數(shù)供試碳源均能滿足生長的需要，最適碳源為麥芽糖；最佳供試氮源為甘氨酸。病原菌分生孢子致死溫度經(jīng)5次累積25次重復(fù)驗證確定為 58 ℃，表明其抗逆性較強(qiáng)，所以病菌在高溫季節(jié)可能具有較強(qiáng)的存活能力和侵染能力而導(dǎo)致病害擴(kuò)大蔓延的趨勢不容忽視。

作為榛子生產(chǎn)上的新病害，筆者對其病原菌生物學(xué)特性進(jìn)行測定研究，這對開展預(yù)測預(yù)報、適時綜合防治、有效控制榛子葉斑病的擴(kuò)大蔓延具有一定理論指導(dǎo)意義。同時，對于病原菌致病機(jī)理等已開展深入研究，以期為經(jīng)濟(jì)林作物的科學(xué)防治提供理論依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1]李雪嵐. 談榛子的開發(fā)與利用[J]. 林業(yè)勘查設(shè)計，2011（4）：114-115.

[2]姜殿勤，王素玲，張儉衛(wèi). 野生平榛綜合開發(fā)利用初探[J]. 特種經(jīng)濟(jì)動植物，2005，8（10）：19-20.

[3]陳佳. 補(bǔ)氣明目食榛子[J]. 國土綠化，2004（1）：45.

[4]Saccardo P A. Sylloge fungorum omnium hucusque cognitorum[M]. Patavii：Typis Seminarii，1884.

[5]Sun J，Wang D M，Huang X Y，et al. First report of a leaf spot on hazel leaves caused by Phyllosticta coryli in Liaoning Province of China[J]. Plant Disease，2013，97（9）：1254.

[6]方中達(dá). 植病研究方法[M]. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1979：140-155.

[7]于莉，呂國忠，劉偉成，等. 東北地區(qū)莖點霉和葉點霉兩屬真菌分類研究[J]. 沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，1994，25（2）：153-158.

[8]邵陽，劉秋，胡英暢，等. 小葉黃楊葉斑病菌YC06生物學(xué)特性與殺菌劑篩選[J]. 東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報，2011，39（7）：138-140.

[9]李本金，蘭成忠，陳慶河，等. 龍眼葉點霉菌生物學(xué)特性及殺菌劑的藥效研究[J]. 中國食用菌，2008（27）：31-34.

[10]王樹和，劉忠勇. 八仙花葉點霉菌生物學(xué)特性的研究[J]. 河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2004（11）：62-64.