閘雯俊++李三和++周雷++劉+凱++徐華山++陳志軍++楊國才++劉凱++李培德++游艾青

摘要 RNAi能夠抑制基因特異序列的表達，為昆蟲學(xué)研究提供了新方法，尤其是可以分析基因的功能，控制害蟲種群以及減少疾病病原體的感染。不同種群、RNAi攝入方式、靶標(biāo)基因都會影響RNAi的效率，是轉(zhuǎn)錄本抑制程度存在差異的原因所在。對于不能穩(wěn)定轉(zhuǎn)基因的物種，如昆蟲，利用dsRNA介導(dǎo)的 RNAi技術(shù)便成為快速分析基因功能的重要手段。介紹了RNAi技術(shù)的作用機制，并從控制害蟲和保護益蟲方面總結(jié)了RNAi技術(shù)的應(yīng)用。

關(guān)鍵詞 RNAi；害蟲控制；dsRNA；機制；應(yīng)用

中圖分類號 S433；Q789 文獻標(biāo)識碼 A 文章編號 1007-5739（2017）07-0144-02

RNA干擾已經(jīng)徹底改變了昆蟲學(xué)的研究范圍，使研究者能夠通過抑制目的基因的表達，將改變的表型和基因功能聯(lián)系起來。對于基礎(chǔ)研究而言，RNAi（又稱基因沉默）為所有的昆蟲基因組學(xué)研究提供了一條路徑，同時對應(yīng)用昆蟲學(xué)也有巨大的潛在作用。例如，RNAi能夠通過抑制關(guān)鍵基因提高死亡率控制害蟲。此外，利用無害的病毒序列啟動抗病毒RNAi反應(yīng)，能夠有效防止益蟲（如蜜蜂和家蠶） 感染高致病性病毒。

1 RNAi的機制

RNAi是利用非編碼小RNA分子切割靶標(biāo)mRNA抑制基因表達。主要分為以下3個階段。

1.1 起始階段

核糖核酸酶Ⅲ型家族的核酸酶Dicer，以 ATP 依賴的方式逐步切割加工導(dǎo)入生物體的外源或內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄生成的dsRNA，生成21～23nt的siRNA（small interfering RNA），其與靶標(biāo)mRNA具有高度特異性，為成功降解提供保證。

1.2 效應(yīng)階段

siRNA 雙鏈結(jié)合其他蛋白復(fù)合物形成RNA 誘導(dǎo)沉默復(fù)合物（RNA-induced silencing complex RISC），雙鏈siRNA解鏈，RISC介導(dǎo)單鏈反義siRNA通過堿基配對原則從siRNA引導(dǎo)鏈中心所對應(yīng)的靶基因位置切割靶mRNA，進一步降解mRNA，同時還可以引發(fā)宿主細胞的一系列反應(yīng)。

1.3 放大效應(yīng)階段

siRNA在引導(dǎo)RISC切割靶RNA的同時，也在RNA聚合酶（RdRP）的作用下以mRNA為模板合成新的dsRNA。緊接著進入第一步循環(huán)過程，生成大量次級siRNA，經(jīng)過逐級放大效應(yīng)，使mRNA徹底降解。

2 RNAi技術(shù)的應(yīng)用

利用RNAi技術(shù)控制害蟲和保護馴化益蟲（例如蜜蜂）已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用。一般情況下，RNAi序列適用于任何形式，從單個基因型到家系，甚至昆蟲所屬的目；因為目標(biāo)序列可以隨意操控。

2.1 利用RNAi控制害蟲

利用RNAi控制害蟲最早是應(yīng)用于玉米根蟲和棉鈴蟲。研究者喂養(yǎng)玉米根蟲含有290條dsRNAs的人工飼料，發(fā)現(xiàn)14個基因會使成蟲的生理活動下降，并且對液泡ATP酶亞基A基因（V-ATPase）進行了詳細的分析。人工飼料中只含有低濃度V-ATPase的dsRNAs，經(jīng)玉米根蟲取食后，相應(yīng)的mRNA受到抑制。更重要的是，研究者將玉米根蟲喂養(yǎng)在表達V-ATPase dsRNAs的轉(zhuǎn)基因玉米上后，發(fā)現(xiàn)根蟲的V-ATPase基因表達量下降，玉米根部受損程度降低[1]。研究者發(fā)現(xiàn)棉鈴蟲有1個靶標(biāo)基因細胞色素P450（CYP6AE1），該基因在幼蟲中腸中表達，對棉花的二級次生代謝產(chǎn)物棉子酚具有解毒功能[2]。當(dāng)將棉鈴蟲喂養(yǎng)在表達CYP6AE14 dsR-NA的轉(zhuǎn)基因擬南芥和煙草上時，該基因在蟲體中腸里的表達量下降，幼蟲生長發(fā)育減速[3]。同時在玉米根蟲和棉鈴蟲上也都有了新發(fā)現(xiàn)[4]。其中Snf7基因主要參與膜受體的運輸，在玉米根蟲中的效果非常顯著。同時在棉花中表達半胱氨酸蛋白酶，棉鈴蟲取食后，蟲體圍食膜功能減弱，變得更容易吸收dsRNA。更重要的是，棉花同時表達dsCYP6AE14和半胱氨酸蛋白酶比單一表達其中一個基因的抗性強[5]。

上述研究闡明利用RNAi控制害蟲有2個關(guān)鍵因素：①用于RNAi靶標(biāo)基因序列的選擇；②傳遞dsRNA的方式。其中靶標(biāo)基因必須是昆蟲的關(guān)鍵基因，同時在昆蟲的整個生活史中要持續(xù)表達。隨著技術(shù)從理論證明到應(yīng)用的轉(zhuǎn)變，嚴(yán)苛設(shè)計靶標(biāo)序列是必須的。先決條件就是從dsRNA中獲得的21～25 bp siRNAs必須與序列保證完全的一致性，同時與昆蟲的mRNA具有同源性，與非靶標(biāo)物種的所有siRNAs和編碼蛋白基因具有序列差異性。在網(wǎng)上將候選dsRNA同時與靶標(biāo)物種的目的基因及所有公共基因組中預(yù)測的編碼蛋白的基因進行比對，杜絕不能與靶標(biāo)序列完全匹配以及與非靶標(biāo)物種序列匹配的siRNAs。

RNAi成功的第2個關(guān)鍵就是在有效劑量下傳遞放大RNAi信號。目前dsRNA合成方法已有重大突破，一次能夠合成1 kg左右，合成成本的持續(xù)下降將有利于dsRNA產(chǎn)品應(yīng)用于魚餌、生物農(nóng)藥噴霧以及灌溉系統(tǒng)中。利用植物介導(dǎo)的RNAi已經(jīng)廣泛應(yīng)用于控制咀嚼式昆蟲（例如玉米根蟲和棉鈴蟲）和刺吸式昆蟲。Bt抗蟲轉(zhuǎn)基因作物控制刺吸式昆蟲的作用甚微，因為Bt類毒素尚未對這些昆蟲產(chǎn)生作用。由于生態(tài)釋放導(dǎo)致廣譜殺蟲劑的使用逐漸減少，Bt作物上的害蟲卻逐年增加。因此，利用植物介導(dǎo)的RNAi解決了這個難題，在褐飛虱和蚜蟲中都得到了應(yīng)用。此方法可以代替?zhèn)鹘y(tǒng)殺蟲劑，例如可以作為城市害蟲（螞蟻、蟑螂、白蟻）的殺蟲餌劑；其商業(yè)潛力主要取決于dsRNA傳遞給靶標(biāo)昆蟲的效率、dsRNA是否在昆蟲體內(nèi)能穩(wěn)定存在、作為殺蟲餌劑的濃度。上述因素均影響dsRNA的生產(chǎn)成本。因此，加強昆蟲細胞吸收dsRNA和保證dsRNA在昆蟲體內(nèi)不被dsRNases降解至關(guān)重要。

2.2 利用RNAi保護益蟲

許多真核寄生蟲對RNAi敏感，可以利用這一特點增強益蟲的健康。當(dāng)然，這個策略不適用于細菌性病原體或某些真核生物（如錐和瘧原蟲物種），因為其缺乏RNAi的能力。最經(jīng)典的例子就是蜜蜂的寄生蟲疾病，此疾病會導(dǎo)致蜜蜂高發(fā)病率和高死亡率。蜜蜂的寄生蟲具備應(yīng)用RNAi的2個要點：首先，其具有RNAi的分子機制；其次，中腸作為攝取dsRNA的場所，寄生蟲能夠在蜜蜂中腸上繁殖。蜜蜂寄生蟲的ADP/ATP轉(zhuǎn)運子對于能量代謝是至關(guān)重要的，當(dāng)感染疾病的蜜蜂取食了含有寄生蟲的ADP/ATP轉(zhuǎn)運子的dsRNA后，寄生蟲的靶標(biāo)基因表達量下降，蜜蜂的死亡率會隨之下降。

真核寄生蟲除了能夠利用腸道作為傳遞RANi的場所，還可以利用昆蟲器官傳遞系統(tǒng)性RNAi信號，已經(jīng)在以蜜蜂血液為食的寄生蟲瓦螨中得到證實。當(dāng)蜜蜂取食了瓦螨特定基因的dsRNA之后，寄居在蜜蜂上的螨蟲群體明顯減少，同時對蜜蜂沒有明顯的有害影響。隨后，研究者利用熒光蛋白的dsRNA（dsRNA-GFP）檢測蜜蜂體內(nèi)是否能夠進行系統(tǒng)性RNAi。蜜蜂和寄生蟲體內(nèi)均沒有綠色熒光蛋白基因，故可以利用GFP-RNA檢測干擾效果。當(dāng)感染寄生蟲的蜜蜂取食含有dsRNA-GFP的蔗糖溶液后，寄生蟲全身覆蓋GFP-RNA。除此而外，將這些寄生蟲轉(zhuǎn)移到?jīng)]有取食dsR-NA-GFP的蜜蜂上，蜜蜂體內(nèi)會含有GFP-RNA。說明RNAi信號不僅可以在昆蟲個體水平進行傳播和放大，同時還可以在蜜蜂繁殖群體水平進行傳播。下一步需要研究如何使RNAi的效率和劑量持續(xù)保護益蟲群體，同時控制寄生蟲的成本是否合理，以及對蜜蜂群體的健康是否有害都需要加以考慮。

可以利用RNAi抗病毒保護昆蟲，同時也可以利用RNAi進行抗病毒治療。利用RNAi介導(dǎo)來抑制昆蟲感染病毒，同時還可以預(yù)防一些人類、牲畜和農(nóng)作物嚴(yán)重病毒性疾病。外源提供和攝取的dsRNA可以提高宿主本身RNAi運轉(zhuǎn)效率，保護宿主包括預(yù)防和直接治療。RNAi介導(dǎo)的抗病毒免疫有利于抑制蚊子的登革熱病毒、辛德畢斯病毒和西尼羅河病毒等。此外，加強RNAi通路能夠促進病毒抑制，例如通過基因工程使昆蟲體內(nèi)表達特定病毒序列的反向重復(fù)RNA，從而促發(fā)dsRNA生成。

蜜蜂是另一個遭病毒侵襲亟須被保護的昆蟲，其中以色列急性麻痹病毒（IAPV）可能導(dǎo)致蜜蜂種群持續(xù)下降和群落消失的危險?？茖W(xué)家通過體外合成IAPV基因組的dsRNA，感染IAPV的蜜蜂取食后，體內(nèi)的RNAi工廠機制可以消除IAPV。實驗室和蜂場試驗表明，在接種IAPV以前飼喂特異RNA的IAPV，與只接種IAPV比較，其幼蟲孵化率和產(chǎn)蜜量均明顯較高。此結(jié)果在美國已經(jīng)進行了大量的田間試驗。2007年Beeologics公司成立了一個研究小組，開始研制一種治療此病毒的制劑，研發(fā)出殺死IAPV的藥物Remebee，是利用核糖核酸干擾機制，阻止目的基因表達。Remebee是以RANi為基礎(chǔ)，理論上RANi生物制劑能促使RANi發(fā)生。

3 展望

近年對昆蟲RNAi的研究展示了科學(xué)發(fā)現(xiàn)的偉大力量和其控制昆蟲種群的潛力。隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，RNAi已經(jīng)不再是靈丹妙藥，但卻提出了一系列的新概念，給昆蟲學(xué)家提出了新的技術(shù)挑戰(zhàn)，沒有一種技術(shù)是適用于所有物種的。同時，RNAi信號是如何在單個細胞里放大和在昆蟲細胞間傳播的也始終困擾著科學(xué)家。因此，昆蟲RNAi如何運轉(zhuǎn)的問題仍需堅持不懈的研究探索。

4 參考文獻

[1] BAUM JA，BOGAERT T FAU-CLINTON W，CLINTON W FAU-HECK GR，et al.Control of coleopteran insect pests through RNA interference[J].Nat biotechnol，2007（11）：1322-1326.

[2] MAO YB，CAI WJ，WANG JW，et al.ilencing a cotton bollworm P450 monooxygenase gene by plant-mediated RNAi impairs larval tolerance of gossypol[J].Nat Biotechnol，2007（25）：1307-1313.

[3] MAO YB，TAO XY，XUE XY，et al.Cotton plants expressing CYP6AE14 double-stranded RNA show enhanced resistance to bollworms[J].Transg-enic Res，2011，20：665-673.

[4] BOLOGNESI R，RAMASESHADRI P，ANDERSON J，et al.Character-izing the mechanism of action of double-stranded RNA activity against western corn rootworm （Diabrotica virgifera virgifera LeConte）[J].PLoS One，2012，7：e47534.

[5] MAO YB，XUE XY，TAO XY，et al.Cysteine protease enhances plant-m-ediated bollworm RNA interference[J].Plant Mol Biol，2013，83：119-129.