高 媛，孫 旭，馬曉昱，劉云云，張志國，陳 瑤

復方克林霉素乳膏是解放軍第88醫(yī)院研制，由鹽酸克林霉素、甲硝唑、尿素、醋酸地塞米松等組成的復方制劑。鹽酸克林霉素和甲硝唑分別具有較強的抗菌和抗炎作用，對厭氧菌、敏感的革蘭陽性菌等有抑制作用；醋酸地塞米松為腎上腺皮質(zhì)激素類藥，有抗過敏、止癢等作用，聯(lián)合使用對痤瘡、膿皰疹、濕疹、各類皮炎及瘙癢性皮膚病有較好的治療作用。為了進一步完善該品種的質(zhì)量標準，配合醫(yī)療機構(gòu)制劑標準提高，筆者對該制劑的質(zhì)量標準進行修訂，建立HPLC測定復方克林霉素乳膏中鹽酸克林霉素和甲硝唑含量的方法［1］，結(jié)果準確，重現(xiàn)性好，能有效控制該制劑質(zhì)量。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 METTLER AE240電子天平 （梅特勒-托利多國際貿(mào)易（上海）有限公司）；Agilent 1100高效液相色譜儀 （安捷倫科技有限公司，VWD檢測器，數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)為安捷倫系統(tǒng)自帶）；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；101型電熱鼓風干燥箱 （北京科偉永興儀器有限公司）。

1.2 試藥 乙腈為色譜純；對照品鹽酸克林霉素（批號130422-201306，中國食品藥品檢定所，純度：84.9%）、甲硝唑（批號100191-200606，中國食品藥品檢定所，純度：99.9%）；復方克林霉素乳膏（批號140812、140813、140815）。

2 方法與結(jié)果

2.1 鹽酸克林霉素的含量測定［1-4］

2.1.1 色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以磷酸二氫鉀（取磷酸二氫鉀3.4 g溶于400 ml水中，用8 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié) pH 至 7.5）-乙腈（55∶45）為流動相；檢測波長為210 nm；柱溫為30℃；流速1.0 ml/min；理論板數(shù)按克林霉素峰計算不低于2500。陰性對照、對照品以及供試品的HPLC色譜圖見圖1～3。

圖1 陰性對照品HPLC圖

圖2 鹽酸克林霉素對照品HPLC圖

圖3 復方克林霉素乳膏樣品HPLC圖

2.1.2 對照品溶液的制備 取鹽酸克林霉素對照品適量，精密稱定，加流動相制成每1 ml含鹽酸克林霉素1.803 mg的對照品溶液（對照品儲備液），精密量取適量于容量瓶中，加流動相至刻度，搖勻，濾過，即得360.7μg/ml的對照品溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備 精密稱取復方克林霉素乳膏2 g，置50 ml量瓶中，加流動相適量于50℃水浴中使其溶解，放冷至室溫，加流動相至刻度，冰浴冷卻1 h后，濾過，取續(xù)濾液放至室溫，即得。

2.1.4 陰性對照品溶液的制備 取缺鹽酸克林霉素的樣品，按“2.1.3”項下方法制備成陰性對照品溶液。

2.1.5 標準曲線的繪制 取“2.1.2”項下鹽酸克林霉素對照品貯備液適量，以流動相為溶劑稀釋，得系列標準溶液，含鹽酸克林霉素為90.2、180.3、360.7、721.3、901.6 μg/ml，分別取 20 μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖。以峰面積值為縱坐標（Y），濃度（μg/ml）為橫坐標（X）繪制標準曲線。計算得鹽酸克林霉素回歸方程：Y=5606.8X-16882，R2=0.9999，實驗表明鹽酸克林霉素在90.2～901.6μg/ml的范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。

2.1.6 精密度試驗 分別精密吸取 “2.1.5”項下360.7μg/ml鹽酸克林霉素對照品溶液 20μl，按“2.1.1”項下色譜條件重復進樣6次，記錄峰面積值，計算RSD為0.53%。說明儀器的精密度良好。

2.1.7 重現(xiàn)性試驗 取復方克林霉素乳膏 （批號140812），按“2.1.3”項下方法分別制備6份供試品溶液，分別進樣20μl，記錄鹽酸克林霉素峰面積值，計算 RSD（n=6）為0.31%，表明方法重復性良好。

2.1.8 穩(wěn)定性試驗 取復方克林霉素乳膏 （批號140812），按“2.1.3”項下方法配制供試品溶液，分別于 0，2，4，8，12 h 進樣 20μl，按“2.1.1”項下色譜條件，測定鹽酸克林霉素的峰面積，計算RSD為0.26%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.9 加樣回收率試驗 取已知含量的復方克林霉素乳膏樣品（批號140815）6份，在線性范周內(nèi)分別加入一定量的鹽酸克林霉素對照品溶液各6份，按“2.1.1”項下色譜條件測定，結(jié)果詳見表1。說明本方法回收率良好。

2.1.10 樣品含量測定 按“2.1.1”項下色譜條件，分別精密吸取“2.1.2”、“2.1.3”項下溶液各 20μl，照2015 年版《中國藥典》四部 0512［2］，進樣 3 批復方克林霉素乳膏樣品（批號 140812、140813、140815），每批樣品測定3份，以外標法計算各個樣品中鹽酸克林霉素的含量，結(jié)果詳見表2。

表1 復方克林霉素乳膏中鹽酸克林霉素加樣回收率試驗測定結(jié)果（n=6）

表2 復方克林霉素乳膏中鹽酸克林霉素含量測定結(jié)果（n=2）

2.2 甲硝唑的含量測定［1，2，5，6］

2.2.1 色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以甲醇-水（20∶80）為流動相；檢測波長為320 nm；柱溫為30℃；流速1.0 ml/min；理論板數(shù)按甲硝唑峰計算不低于2000。陰性對照、對照品以及供試品的HPLC色譜圖見圖4～6。

2.2.2 對照品溶液的制備 取甲硝唑?qū)φ掌愤m量，精密稱定，用流動相溶解制成每1 ml約含甲硝唑1.035 mg的溶液（對照品儲備液）；精密量取對照品儲備液適量于容量瓶中，加流動相至刻度，搖勻，濾過，即得51.7μg/ml的對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 精密稱取復方克林霉素乳膏0.5 g，置100 ml量瓶中，加流動相適量，50℃超聲提取20 min，放冷，用流動相稀釋至刻度，搖勻，過濾，即得。

2.2.4 陰性對照品溶液的制備 取缺甲硝唑的樣品，按“2.2.3”項下方法制備成陰性對照品溶液。

2.2.5 標準曲線的繪制 取“2.2.2”項下甲硝唑?qū)φ掌穬湟哼m量，以流動相為溶劑稀釋，得系列標準溶液， 含甲硝唑為 12.9、25.9、51.7、103.5、207.0、414.0μg/ml，分別取20μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖。 以峰面積值為縱坐標（Y），濃度（μg/ml）為橫坐標 （X）繪制標準曲線。計算得回歸方程，Y=61.761X+89.518，R2=0.9999。實驗表明甲硝唑在12.9～414.0μg/ml的范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。

2.2.6 精密度試驗 精密吸取“2.2.5”項下51.7μg/ml甲硝唑?qū)φ掌啡芤?20μl，按“2.2.1”項下色譜條件重復進樣6次，記錄峰面積值，計算RSD為0.01%。說明儀器的精密度良好。

2.2.7 重現(xiàn)性試驗 取復方克林霉素乳膏 （批號140812），按“2.2.3”項下方法分別制備6份供試品溶液，分別進樣20μl，記錄甲硝唑峰面積值，計算RSD（n=6）為0.06%，表明方法重復性良好。

2.2.8 穩(wěn)定性試驗 取復方克林霉素乳膏 （批號140812），按“2.2.3”項下方法配制供試品溶液，分別于 0，2，4，8，12 h 進樣 20 μl，按“2.2.1”項下色譜條件，測定甲硝唑的峰面積，計算RSD為0.20%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.9 加樣回收率試驗 取已知含量的復方克林霉素乳膏樣品（批號140815）6份，在線性范周內(nèi)分別加入一定量的甲硝唑?qū)φ掌啡芤?，按?.2.1”項下色譜條件測定，結(jié)果詳見表3。說明本方法回收率良好。

2.2.10 樣品含量測定 按“2.2.1”項下色譜條件，分別精密吸取“2.2.2”、“2.2.3”項下溶液各 20 μl，照2015 年版《中國藥典》四部 0512［2］，進樣 3 批復方克林霉素乳膏樣品（批號 140812、140813、140815），每批樣品測定3份，以外標法計算各個樣品中甲硝唑的含量，結(jié)果詳見表4。

圖4 陰性對照品HPLC圖

圖5 甲硝唑?qū)φ掌稨PLC圖

圖6 復方克林霉素乳膏樣品HPLC圖

表3 復方克林霉素乳膏中甲硝唑加樣回收率試驗測定結(jié)果（n=6）

表4 復方克林霉素乳膏中甲硝唑含量測定結(jié)果（n=2）

3 討論

3.1 波長的選擇 鹽酸克林霉素在190～400 nm范圍內(nèi)沒有最大吸收，僅有末端吸收，且文獻報道［3，4］其在210 nm處的吸光度值為214 nm的2倍，因此選擇檢測波長為210 nm。甲硝唑在320 nm處有最大吸收，因此該文并未同時測定兩者的含量，而是采用不同的波長分別對復方克林霉素乳膏中的鹽酸克林霉素和甲硝唑進行測定。

3.2 流動相的選擇 該復方制劑中鹽酸克林霉素和甲硝唑分別參照 《中國藥典》2015年版二部檢測方法選擇流動相，各雜質(zhì)峰與主峰的分離度＞2.0，理論板數(shù)符合要求，符合HPLC法的要求。

綜上所述，本實驗建立了HPLC法測定復方克林霉素乳膏中鹽酸克林霉素和甲硝唑的含量測定方法，具有靈敏度高、回收率良好，準確可靠的優(yōu)點，可作為復方克林霉素乳膏的質(zhì)量控制方法。

參考文獻

［1］國家藥典委員會編.中華人民共和國藥典2015年版：二部［S］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：212-213，973-974.

［2］國家藥典委員會編.中華人民共和國藥典2015年版：四部［S］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：59-61.

［3］張帶榮.高效液相色譜法測定鹽酸克林霉素注射液含量［J］.中國醫(yī)院藥學雜志，2010，30（13）：1165-1167.

［4］黎淵弘，蔣 英，黎肇炎.消痘寧乳膏的制備及質(zhì)量控制［J］.中國藥房，2009，20（34）：2686-2688.

［5］張?zhí)J燕，王 坤，賀 凱，等.甲硝唑口頰片中甲硝唑含量測定及其方法學研究［J］. 寧夏醫(yī)學雜志，2012，34（5）：453-454.

［6］陳 娟，徐 劍，張永萍.HPLC測定復方足癬乳膏中甲硝唑含量［J］. 貴陽中醫(yī)學院學報，2016，38（2）：29-31.