高 媛，孫 旭，馬曉昱，劉云云，張志國，陳 瑤

復(fù)方克林霉素乳膏是解放軍第88醫(yī)院研制，由鹽酸克林霉素、甲硝唑、尿素、醋酸地塞米松等組成的復(fù)方制劑。鹽酸克林霉素和甲硝唑分別具有較強(qiáng)的抗菌和抗炎作用，對厭氧菌、敏感的革蘭陽性菌等有抑制作用；醋酸地塞米松為腎上腺皮質(zhì)激素類藥，有抗過敏、止癢等作用，聯(lián)合使用對痤瘡、膿皰疹、濕疹、各類皮炎及瘙癢性皮膚病有較好的治療作用。為了進(jìn)一步完善該品種的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，配合醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑標(biāo)準(zhǔn)提高，筆者對該制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行修訂，建立HPLC測定復(fù)方克林霉素乳膏中鹽酸克林霉素和甲硝唑含量的方法［1］，結(jié)果準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好，能有效控制該制劑質(zhì)量。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 METTLER AE240電子天平 （梅特勒-托利多國際貿(mào)易（上海）有限公司）；Agilent 1100高效液相色譜儀 （安捷倫科技有限公司，VWD檢測器，數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)為安捷倫系統(tǒng)自帶）；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；101型電熱鼓風(fēng)干燥箱 （北京科偉永興儀器有限公司）。

1.2 試藥 乙腈為色譜純；對照品鹽酸克林霉素（批號130422-201306，中國食品藥品檢定所，純度：84.9%）、甲硝唑（批號100191-200606，中國食品藥品檢定所，純度：99.9%）；復(fù)方克林霉素乳膏（批號140812、140813、140815）。

2 方法與結(jié)果

2.1 鹽酸克林霉素的含量測定［1-4］

2.1.1 色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以磷酸二氫鉀（取磷酸二氫鉀3.4 g溶于400 ml水中，用8 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié) pH 至 7.5）-乙腈（55∶45）為流動相；檢測波長為210 nm；柱溫為30℃；流速1.0 ml/min；理論板數(shù)按克林霉素峰計算不低于2500。陰性對照、對照品以及供試品的HPLC色譜圖見圖1～3。

圖1 陰性對照品HPLC圖

圖2 鹽酸克林霉素對照品HPLC圖

圖3 復(fù)方克林霉素乳膏樣品HPLC圖

2.1.2 對照品溶液的制備 取鹽酸克林霉素對照品適量，精密稱定，加流動相制成每1 ml含鹽酸克林霉素1.803 mg的對照品溶液（對照品儲備液），精密量取適量于容量瓶中，加流動相至刻度，搖勻，濾過，即得360.7μg/ml的對照品溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備 精密稱取復(fù)方克林霉素乳膏2 g，置50 ml量瓶中，加流動相適量于50℃水浴中使其溶解，放冷至室溫，加流動相至刻度，冰浴冷卻1 h后，濾過，取續(xù)濾液放至室溫，即得。

2.1.4 陰性對照品溶液的制備 取缺鹽酸克林霉素的樣品，按“2.1.3”項下方法制備成陰性對照品溶液。

2.1.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 取“2.1.2”項下鹽酸克林霉素對照品貯備液適量，以流動相為溶劑稀釋，得系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，含鹽酸克林霉素為90.2、180.3、360.7、721.3、901.6 μg/ml，分別取 20 μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖。以峰面積值為縱坐標(biāo)（Y），濃度（μg/ml）為橫坐標(biāo)（X）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。計算得鹽酸克林霉素回歸方程：Y=5606.8X-16882，R2=0.9999，實(shí)驗(yàn)表明鹽酸克林霉素在90.2～901.6μg/ml的范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。

2.1.6 精密度試驗(yàn) 分別精密吸取 “2.1.5”項下360.7μg/ml鹽酸克林霉素對照品溶液 20μl，按“2.1.1”項下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積值，計算RSD為0.53%。說明儀器的精密度良好。

2.1.7 重現(xiàn)性試驗(yàn) 取復(fù)方克林霉素乳膏 （批號140812），按“2.1.3”項下方法分別制備6份供試品溶液，分別進(jìn)樣20μl，記錄鹽酸克林霉素峰面積值，計算 RSD（n=6）為0.31%，表明方法重復(fù)性良好。

2.1.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取復(fù)方克林霉素乳膏 （批號140812），按“2.1.3”項下方法配制供試品溶液，分別于 0，2，4，8，12 h 進(jìn)樣 20μl，按“2.1.1”項下色譜條件，測定鹽酸克林霉素的峰面積，計算RSD為0.26%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.9 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的復(fù)方克林霉素乳膏樣品（批號140815）6份，在線性范周內(nèi)分別加入一定量的鹽酸克林霉素對照品溶液各6份，按“2.1.1”項下色譜條件測定，結(jié)果詳見表1。說明本方法回收率良好。

2.1.10 樣品含量測定 按“2.1.1”項下色譜條件，分別精密吸取“2.1.2”、“2.1.3”項下溶液各 20μl，照2015 年版《中國藥典》四部 0512［2］，進(jìn)樣 3 批復(fù)方克林霉素乳膏樣品（批號 140812、140813、140815），每批樣品測定3份，以外標(biāo)法計算各個樣品中鹽酸克林霉素的含量，結(jié)果詳見表2。

表1 復(fù)方克林霉素乳膏中鹽酸克林霉素加樣回收率試驗(yàn)測定結(jié)果（n=6）

表2 復(fù)方克林霉素乳膏中鹽酸克林霉素含量測定結(jié)果（n=2）

2.2 甲硝唑的含量測定［1，2，5，6］

2.2.1 色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以甲醇-水（20∶80）為流動相；檢測波長為320 nm；柱溫為30℃；流速1.0 ml/min；理論板數(shù)按甲硝唑峰計算不低于2000。陰性對照、對照品以及供試品的HPLC色譜圖見圖4～6。

2.2.2 對照品溶液的制備 取甲硝唑?qū)φ掌愤m量，精密稱定，用流動相溶解制成每1 ml約含甲硝唑1.035 mg的溶液（對照品儲備液）；精密量取對照品儲備液適量于容量瓶中，加流動相至刻度，搖勻，濾過，即得51.7μg/ml的對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 精密稱取復(fù)方克林霉素乳膏0.5 g，置100 ml量瓶中，加流動相適量，50℃超聲提取20 min，放冷，用流動相稀釋至刻度，搖勻，過濾，即得。

2.2.4 陰性對照品溶液的制備 取缺甲硝唑的樣品，按“2.2.3”項下方法制備成陰性對照品溶液。

2.2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 取“2.2.2”項下甲硝唑?qū)φ掌穬湟哼m量，以流動相為溶劑稀釋，得系列標(biāo)準(zhǔn)溶液， 含甲硝唑?yàn)?12.9、25.9、51.7、103.5、207.0、414.0μg/ml，分別取20μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖。 以峰面積值為縱坐標(biāo)（Y），濃度（μg/ml）為橫坐標(biāo) （X）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。計算得回歸方程，Y=61.761X+89.518，R2=0.9999。實(shí)驗(yàn)表明甲硝唑在12.9～414.0μg/ml的范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。

2.2.6 精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.2.5”項下51.7μg/ml甲硝唑?qū)φ掌啡芤?20μl，按“2.2.1”項下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積值，計算RSD為0.01%。說明儀器的精密度良好。

2.2.7 重現(xiàn)性試驗(yàn) 取復(fù)方克林霉素乳膏 （批號140812），按“2.2.3”項下方法分別制備6份供試品溶液，分別進(jìn)樣20μl，記錄甲硝唑峰面積值，計算RSD（n=6）為0.06%，表明方法重復(fù)性良好。

2.2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取復(fù)方克林霉素乳膏 （批號140812），按“2.2.3”項下方法配制供試品溶液，分別于 0，2，4，8，12 h 進(jìn)樣 20 μl，按“2.2.1”項下色譜條件，測定甲硝唑的峰面積，計算RSD為0.20%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.9 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的復(fù)方克林霉素乳膏樣品（批號140815）6份，在線性范周內(nèi)分別加入一定量的甲硝唑?qū)φ掌啡芤?，按?.2.1”項下色譜條件測定，結(jié)果詳見表3。說明本方法回收率良好。

2.2.10 樣品含量測定 按“2.2.1”項下色譜條件，分別精密吸取“2.2.2”、“2.2.3”項下溶液各 20 μl，照2015 年版《中國藥典》四部 0512［2］，進(jìn)樣 3 批復(fù)方克林霉素乳膏樣品（批號 140812、140813、140815），每批樣品測定3份，以外標(biāo)法計算各個樣品中甲硝唑的含量，結(jié)果詳見表4。

圖4 陰性對照品HPLC圖

圖5 甲硝唑?qū)φ掌稨PLC圖

圖6 復(fù)方克林霉素乳膏樣品HPLC圖

表3 復(fù)方克林霉素乳膏中甲硝唑加樣回收率試驗(yàn)測定結(jié)果（n=6）

表4 復(fù)方克林霉素乳膏中甲硝唑含量測定結(jié)果（n=2）

3 討論

3.1 波長的選擇 鹽酸克林霉素在190～400 nm范圍內(nèi)沒有最大吸收，僅有末端吸收，且文獻(xiàn)報道［3，4］其在210 nm處的吸光度值為214 nm的2倍，因此選擇檢測波長為210 nm。甲硝唑在320 nm處有最大吸收，因此該文并未同時測定兩者的含量，而是采用不同的波長分別對復(fù)方克林霉素乳膏中的鹽酸克林霉素和甲硝唑進(jìn)行測定。

3.2 流動相的選擇 該復(fù)方制劑中鹽酸克林霉素和甲硝唑分別參照 《中國藥典》2015年版二部檢測方法選擇流動相，各雜質(zhì)峰與主峰的分離度＞2.0，理論板數(shù)符合要求，符合HPLC法的要求。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)建立了HPLC法測定復(fù)方克林霉素乳膏中鹽酸克林霉素和甲硝唑的含量測定方法，具有靈敏度高、回收率良好，準(zhǔn)確可靠的優(yōu)點(diǎn)，可作為復(fù)方克林霉素乳膏的質(zhì)量控制方法。

參考文獻(xiàn)

［1］國家藥典委員會編.中華人民共和國藥典2015年版：二部［S］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：212-213，973-974.

［2］國家藥典委員會編.中華人民共和國藥典2015年版：四部［S］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：59-61.

［3］張帶榮.高效液相色譜法測定鹽酸克林霉素注射液含量［J］.中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2010，30（13）：1165-1167.

［4］黎淵弘，蔣 英，黎肇炎.消痘寧乳膏的制備及質(zhì)量控制［J］.中國藥房，2009，20（34）：2686-2688.

［5］張?zhí)J燕，王 坤，賀 凱，等.甲硝唑口頰片中甲硝唑含量測定及其方法學(xué)研究［J］. 寧夏醫(yī)學(xué)雜志，2012，34（5）：453-454.

［6］陳 娟，徐 劍，張永萍.HPLC測定復(fù)方足癬乳膏中甲硝唑含量［J］. 貴陽中醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2016，38（2）：29-31.