于林港宿玲恰吳敬，

（1. 江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，無(wú)錫 214122；2. 江南大學(xué)生物工程學(xué)院 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，無(wú)錫 214122）

Escherichia coli str. K-12 substr. MG1655海藻糖酶Tre F的重組表達(dá)及性質(zhì)研究

于林港1宿玲恰2吳敬1，2

（1. 江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，無(wú)錫 214122；2. 江南大學(xué)生物工程學(xué)院 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，無(wú)錫 214122）

海藻糖酶（Trehalase）是一種海藻糖水解酶，能夠特異性的將海藻糖分解為兩分子的葡萄糖。為了將Escherichia coli str. K-12 substr. MG1655的海藻糖酶基因Tre F在E. coli BL21（DE3）中重組表達(dá)和應(yīng)用，該研究通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得E. coli str. K-12 substr. MG1655的海藻糖酶基因Tre F，構(gòu)建了基因工程菌E. coli BL21（DE3）/pET-24a（+）-Tre F。對(duì)重組菌進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，25℃，IPTG濃度為0.4 mmol/L時(shí)，搖瓶發(fā)酵誘導(dǎo)24 h時(shí)得到最高酶活為107 U/mL。進(jìn)一步研究了海藻糖酶的酶學(xué)性質(zhì)，發(fā)現(xiàn)該海藻糖酶的最適pH為7.0，最適溫度為50℃；此外，將該酶應(yīng)用于海藻糖的水解，起始海藻糖濃度為300 g/L，初始pH 7.0、反應(yīng)溫度30℃，加酶量為84 U/g，反應(yīng)36 h，葡萄糖轉(zhuǎn)化率可達(dá)98.4%。該研究是首次將E. coli str. K-12 substr. MG1655海藻糖酶基因Tre F在E. coli BL21（DE3）宿主中重組表達(dá)的報(bào)道。

海藻糖酶；基因克??；重組表達(dá)；酶學(xué)特性

海藻糖（Trehalose）分子是由兩個(gè)吡喃葡萄糖環(huán)分子以α，α-1，1-糖苷鍵連接而成的一種十分穩(wěn)定的非還原二糖［1］。海藻糖廣泛存在于自然界的生物體內(nèi)，包括細(xì)菌、真菌、昆蟲、低等植物、脊椎動(dòng)物，特別在真菌和昆蟲中的含量非常高，是國(guó)際上最近開(kāi)發(fā)的主要低聚糖之一［2-5］。雖然海藻糖的來(lái)源很廣泛，但能在體內(nèi)大量積累海藻糖的生物并不是很多［6］。目前正在研究和開(kāi)發(fā)的海藻糖制備方法主要有微生物抽提法、發(fā)酵法、酶轉(zhuǎn)化法及基因重組法［6］。然而從微生物中提取海藻糖成本高，提取源有限，很難實(shí)現(xiàn)大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)；發(fā)酵法生產(chǎn)海藻糖存在轉(zhuǎn)化率低，發(fā)酵液成分復(fù)雜，海藻糖的提取、精制困難等問(wèn)題；基因重組法生產(chǎn)海藻糖目前研究還不完善，技術(shù)有待發(fā)展，不能廣泛應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)。目前工業(yè)上常用的方法是采用麥芽糖或淀粉等為底物，利用與海藻糖合成有關(guān)的酶的作用轉(zhuǎn)化成海藻糖。然而采用酶轉(zhuǎn)化方法生產(chǎn)海藻糖時(shí)，依然會(huì)有一些問(wèn)題需要解決，如在將海藻糖制備提取后仍然會(huì)產(chǎn)生含有葡萄糖和少量海藻糖等組分的母液，造成資源的浪費(fèi)。如果能將母液中的海藻糖水解為葡萄糖，就可以實(shí)現(xiàn)母液的有效再利用，減少資源浪費(fèi)。因此，本研究將對(duì)海藻糖的水解酶進(jìn)行研究，具有重要的研究?jī)r(jià)值和應(yīng)用前景。

海藻糖酶（EC：3.2.1.28）是一種海藻糖水解酶，能夠特異性的將海藻糖分解為兩分子的葡萄糖［7］。海藻糖酶最早是Bourquelot于1893年在黑曲霉中發(fā)現(xiàn)的，1895年Fischer在釀酒酵母里也發(fā)現(xiàn)了海藻糖酶［8］。隨后，科研人員在不同的生物里不斷地發(fā)現(xiàn)和鑒定了不同的海藻糖酶，這些生物包括細(xì)菌、酵母、真菌、昆蟲、線蟲、植物和脊椎動(dòng)物［9-12］。微生物中海藻糖的水解酶分為兩類［13］：中性海藻糖酶（NTH，由nth1 和nth2 基因編碼）和酸性海藻糖酶（ATH，由ath1 基因編碼）。其中酸性海藻糖酶定位于液泡，最適pH在4.5左右；而中性海藻糖酶位于細(xì)胞質(zhì)，負(fù)責(zé)主要的胞內(nèi)海藻糖分解，最適pH在7.0左右［14-16］。本研究以Escherichia coli str. K-12 substr. MG1655為出發(fā)菌株克隆出其中性海藻糖酶基因Tre F，并在E. coli BL21（DE3）中進(jìn)行高效表達(dá)，進(jìn)而對(duì)其酶學(xué)特性和應(yīng)用性能進(jìn)行了研究，為海藻糖酶的后續(xù)制備和應(yīng)用研究奠定良好基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒 E. coli str. K-12 substr. MG1655、E. coli JM109、E. coli BL21（DE3）菌株及表達(dá)載體pET-24a（+）均為本實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.2 試劑與培養(yǎng)基 Taq酶、T4 DNA連接酶、PrimerStarTMHS DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶Nde I和Hind III、堿性磷酸酶（calf intestine alkaline phosphatase，CIAP）、瓊脂糖和核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)均購(gòu)自大連寶生物工程有限公司；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒和質(zhì)粒小提試劑盒均購(gòu)自北京天根生化科技有限公司；蛋白電泳試劑盒和蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；Ezup柱式基因組DNA抽提試劑盒（細(xì)菌）和SanPrep柱式PCR產(chǎn)物純化試劑盒、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（Isopropyl β-D-1-Thiogalactopyranoside，IPTG）、卡那霉素（Kanamycin，Kan）均購(gòu)自上海生物工程股份有限公司；酵母粉和胰蛋白胨均購(gòu)自英國(guó)Oxiod公司；所有引物均由上海睿迪生物科技有限公司合成；其他國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭┚?gòu)自上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

LB液體培養(yǎng)基（g/L）：NaCl 10.0，酵母粉5.0，胰蛋白胨10.0。LB固體培養(yǎng)基：添加質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)為1.5%-2.0%的瓊脂至LB液體培養(yǎng)基。LB-Kan培養(yǎng)基：在LB培養(yǎng)基中添加100.0 μg/mL的Kan。TB培養(yǎng)基（g/L）：甘油5.0，酵母粉24.0，胰蛋白胨12.0，KH2PO42.3，K2HPO4×3H2O 16.4。TB-Kan培養(yǎng)基：在TB培養(yǎng)基中添加30.0 μg/mL的Kan。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取 E. coli str. K-12 substr. MG1655基因組DNA的提取按照上海生工的細(xì)菌基因組抽提試劑盒說(shuō)明書提取獲得。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)與基因克隆 根據(jù)GenBank中海藻糖酶的同源序列（NC_000913.3）為模板，按需要加入適宜的內(nèi)切酶（Nde I和Hind III）位點(diǎn)，設(shè)計(jì)出一對(duì)PCR引物P1/P2：上游引物P1：5'-GGAATTCCA TATGCTCAATCAGAAAATTCAAAACC-3'；（下劃線處為酶切位點(diǎn)Nde I）；下游引物P2：5'-CCCAAGCTTA TGGTTCGCCGTACAAACCAATTA-3'。（下劃線處為酶切位點(diǎn)Hind III）；以E. coli str. K-12 substr. MG1655基因組DNA為模板，以P1/P2為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系（50 μL）：ddH2O 33.5 μL，dNTP混合物4 μL，5×PS Buffer 10 μL，模板1 μL，上游引物P10.5 μL，下游引物P20.5 μL，PrimerSTARTMHS DNA聚合酶0.5 μL。PCR擴(kuò)增條件為：于95℃預(yù)變性5 min，然后開(kāi)始循環(huán)，首先于98℃變性10 s，然后于55℃退火5 s，最后于72℃延伸110 s，循環(huán)30次后于72℃延伸10 min，并于4℃保溫。

將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖（1%）凝膠電泳驗(yàn)證，將驗(yàn)證正確的PCR產(chǎn)物進(jìn)行膠回收，膠回收后的產(chǎn)物在PCR儀或者恒溫水浴鍋中72℃反應(yīng)10 min完成平末端加A，然后將加A后的產(chǎn)物進(jìn)行DNA產(chǎn)物純化，最后將純化后產(chǎn)物連接至pMD19-T simple vector，并轉(zhuǎn)化E. coli JM109感受態(tài)細(xì)胞，涂布LBKan固體培養(yǎng)基，于37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)過(guò)夜。挑取陽(yáng)性克隆至LB-Kan液體培養(yǎng)基，抽提質(zhì)粒經(jīng)限制性內(nèi)切酶Nde I和Hind III雙酶切，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證，并將驗(yàn)證正確的序列送睿迪基因測(cè)序。測(cè)序正確的重組質(zhì)粒命名為pMD19T-Tre F，-80℃甘油管保存。

1.2.3 E. coli重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 分別用限制性內(nèi)切酶Nde I和Hind III對(duì)測(cè)序正確的pMD19T-Tre F質(zhì)粒和表達(dá)載體pET-24a（+）進(jìn)行雙酶切，用DNA膠回收試劑盒將目的片段回收，然后用T4連接酶將目的基因和表達(dá)載體16℃連接過(guò)夜，轉(zhuǎn)化E. coli JM109感受態(tài)細(xì)胞，涂布LB-Kan固體培養(yǎng)基，于37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)過(guò)夜。挑取陽(yáng)性克隆至LBKan液體培養(yǎng)基，抽提質(zhì)粒經(jīng)限制性內(nèi)切酶Nde I和Hind III雙酶切，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證。將驗(yàn)證正確的序列送睿迪基因測(cè)序。測(cè)序正確的重組質(zhì)粒命名為pET-24a（+）-Tre F，-80℃甘油管保存。將測(cè)序正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主E. coli BL21（DE3），-80℃甘油管保存。

1.2.4 重組菌的誘導(dǎo)表達(dá)和優(yōu)化 將重組菌E. coli BL21（DE3）/pET-24a（+）-Tre F接種至LB-Kan液體培養(yǎng)基，于37℃，200 r/min培養(yǎng)8 h，以5%的接種量轉(zhuǎn)接上述菌液至50 mL TB-Kan培養(yǎng)基中，于37℃，200 r/min培養(yǎng)至OD600約為1.0時(shí)，加入終濃度為0.4 mmol/L的IPTG，于25℃，200 r/min誘導(dǎo)發(fā)酵。

在搖瓶發(fā)酵的基礎(chǔ)上優(yōu)化了不同誘導(dǎo)劑濃度和不同的誘導(dǎo)溫度對(duì)產(chǎn)酶的影響。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)改變單因子的方法對(duì)誘導(dǎo)條件進(jìn)行優(yōu)化，根據(jù)以上測(cè)酶活方法獲得的酶活大小作為優(yōu)化參考標(biāo)準(zhǔn)，每個(gè)因素做3個(gè)平行。

1.2.5 重組菌生長(zhǎng)曲線的測(cè)定和粗酶液的制備 為了檢測(cè)重組菌隨著時(shí)間的生長(zhǎng)情況，分別在不同的誘導(dǎo)時(shí)間點(diǎn)取樣1 mL發(fā)酵液，在吸光值600 nm測(cè)量菌體的OD600。取一定量發(fā)酵液離心收集得到菌體并采用去離子水洗滌3次后，當(dāng)OD600低于5.0時(shí)直接用1 mL 50 mmol/L pH7.0 的K2HPO4-KH2PO4緩沖液懸浮菌體，當(dāng)菌體生長(zhǎng)至OD600大于5.0時(shí)，采用緩沖液稀釋至5.0，超聲破碎（破碎2 s、間歇3 s，總時(shí)間10 min）后離心10 min，破壁上清即為Tre F粗酶液，單位體積酶活根據(jù)相應(yīng)體積發(fā)酵液菌體稀釋倍數(shù)折算得出。

濃縮粗酶液的制備：取500 mL發(fā)酵液離心收集得到菌體并采用去離子水洗滌3次后，用100 mL 50 mmol/L pH 7.0 K2HPO4-KH2PO4緩沖液懸浮菌體，超聲破碎（破碎2 s、間歇3 s，總時(shí)間30 min）后離心10 min，破壁上清即為濃縮的Tre F粗酶液。

1.2.6 酶活力測(cè)定 將1 mL適當(dāng)濃度（80 g/L）的海藻糖溶液和0.9 mL的50 mmol/L，pH7.0的磷酸緩沖液充分混勻，在37℃預(yù)熱10 min，加入100 μL適當(dāng)稀釋的酶液，反應(yīng)10 min后加入3 mL 3，5-二硝基水楊酸（DNS），煮沸7 min迅速冷卻，加蒸餾水定容至15 mL，在540 nm下測(cè)吸光度（以緩沖液同樣操作作為空白對(duì)照）［17］。

在上述條件下，將每分鐘水解1 μmol海藻糖生成2 μmol的葡萄糖所需酶量定義為一個(gè)酶活單位（1U）。

1.2.7 海藻糖酶的酶學(xué)性質(zhì) （1）溫度對(duì)重組Tre F酶活力的影響：分別測(cè)定Tre F在30-70℃（間隔5℃）下的酶活，將Tre F最高酶活設(shè)定為100%。實(shí)驗(yàn)方法同上，每個(gè)梯度設(shè)置3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。（2）pH對(duì)重組Tre F酶活力的影響：分別測(cè)定Tre F在pH 4.5-8.0（間隔為0.5）的50 mmol/L檸檬酸-K2HPO4緩沖液中的酶活，將Tre F最高酶活設(shè)定為100%。實(shí)驗(yàn)方法同上，每個(gè)梯度設(shè)置3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。（3）重組Tre F穩(wěn)定性：將Tre F分別置于最適pH下，溫度為30℃、37℃以及50℃的恒溫水浴鍋中，測(cè)定不同時(shí)間的殘留酶活，將未經(jīng)過(guò)熱處理的樣品的酶活設(shè)定為100%。實(shí)驗(yàn)方法同上，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)置3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。

1.2.8 加酶量對(duì)葡萄糖轉(zhuǎn)化率的影響 用pH值為7.0的50 mmol/L K2HPO4-KH2PO4緩沖液配制反應(yīng)底物海藻糖溶液（300 g/L），分別加入12 U/g、24 U/g、36 U/g、48 U/g、60 U/g、72 U/g、84 U/g、96 U/g、108 U/g、120 U/g及132 U/g濃縮后的粗酶液，在30℃，150 r/min的水浴搖床中反應(yīng)36 h。用HPLC檢測(cè)反應(yīng)液中海藻糖的殘余量和葡萄糖的生成量，計(jì)算海藻糖轉(zhuǎn)化生成葡萄糖的轉(zhuǎn)化率，每個(gè)梯度做3個(gè)平行。

葡萄糖含量的測(cè)定：產(chǎn)物中的葡萄糖糖含量采用HPLC檢測(cè)。色譜條件為：安捷倫 1200 HPLC色譜儀，色譜柱 APS-2 HYPERSIL（250 mm×4.6 mm），示差檢測(cè)器為安捷倫 2410；流動(dòng)相為80%（V/V）乙腈和水的混合溶液，流速為0.8 mL/min，柱溫設(shè)定為40℃。葡萄糖轉(zhuǎn)化率的計(jì)算：

2 結(jié)果

2.1 目的基因的克隆

以E. coli str. K-12 substr. MG1655的基因組DNA為模板，用引物P1/P2進(jìn)行PCR擴(kuò)增海藻糖酶基因Tre F，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，擴(kuò)增出的DNA片段約在1 650 bp處，與預(yù)期大小相符（圖1）。將目的基因與pMD19-T simple vector載體連接并轉(zhuǎn)化E. coli JM109感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒用Nde I和Hind III雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳（圖2）顯示約為2 600 bp和1 650 bp兩條帶，與預(yù)期相符。測(cè)序結(jié)果顯示目的片段全長(zhǎng)1 650 bp，編碼549個(gè)氨基酸，通過(guò)DNAMAN軟件比對(duì)與E. coli str. K-12 substr. MG1655的Tre F基因序列（NC_000913.3）相似度達(dá)到99%，蛋白質(zhì)序列相似度為100%?？梢酝茢嗫寺〉幕?yàn)镋. coli str. K-12 substr. MG1655的海藻糖酶Tre F基因。

2.2 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

將測(cè)序正確的目的基因用Nde I和Hind III雙酶切，與同樣酶切的表達(dá)載體pET-24a（+）進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E. coli JM109，挑取單克隆提取質(zhì)粒用Nde I和Hind III雙酶切驗(yàn)證，結(jié)果如圖3所示，瓊脂糖凝膠電泳顯示約為5 300 bp和1 650 bp的兩條片段，重組表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功，命名為pET-24a（+）-Tre F。

圖1 PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證

圖2 pMD19T-Tre F Nde I和Hind III雙酶切瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證

圖3 pET-24a（+）-Tre F Nde I和Hind III雙酶切瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證

2.3 重組酶在E. coli中的表達(dá)

將驗(yàn)證正確的重組質(zhì)粒pET-24a（+）-Tre F轉(zhuǎn)化E. coli BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，涂布LB-Kan固體平板，挑取單菌落到LB-Kan培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜，以5%的轉(zhuǎn)接量將菌液接種到TB-Kan培養(yǎng)基，待OD600約為1.0時(shí)，加入終濃度為0.4 mmol/L的IPTG，于25℃，200 r/min誘導(dǎo)，分別在不同的時(shí)間進(jìn)行取樣測(cè)定重組菌的生長(zhǎng)曲線和產(chǎn)酶曲線，如圖4所示，發(fā)酵培養(yǎng)26 h時(shí)，OD600為11.9，海藻糖酶活達(dá)到最高為103 U/mL。對(duì)樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳鑒定，如圖5所示，重組菌E. coli BL21（DE3）/ pET-24a（+）-Tre F成功表達(dá)了分子量約為63 kD的蛋白，與預(yù)期結(jié)果一致。

圖4 重組菌E. coli BL21（DE3）/pET-24a（+）-Tre F的細(xì)胞生長(zhǎng)情況和產(chǎn)酶情況

圖5 重組Tre F的SDS-PAGE凝膠電泳分析

2.4 重組菌誘導(dǎo)條件的優(yōu)化

2.4.1 IPTG最佳誘導(dǎo)濃度的確定 本研究選取0.1、 0.2、0.4、0.6、0.8 mmol/L等不同的IPTG濃度對(duì)重組菌進(jìn)行誘導(dǎo)發(fā)酵。如圖6所示，重組菌的OD600隨著IPTG誘導(dǎo)濃度的增加呈現(xiàn)降低的趨勢(shì)；而重組酶的酶活則是隨著誘導(dǎo)劑濃度呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢(shì)，當(dāng)IPTG的濃度低于0.4 mmol/L時(shí)，重組菌海藻糖酶的酶活力隨著IPTG濃度的增加而提高，0.4 mmol/L時(shí)酶活達(dá)到最高為103 U/mL；當(dāng)IPTG誘導(dǎo)濃度超過(guò)0.4 mmol/L時(shí)，重組菌的酶活開(kāi)始下降。因此，重組菌的最佳IPTG誘導(dǎo)劑濃度為0.4 mmol/L。

圖6 IPTG濃度對(duì)重組菌的生物量和產(chǎn)酶情況的影響

2.4.2 最佳誘導(dǎo)溫度的確定 溫度的高低決定著微生物細(xì)胞內(nèi)新陳代謝的酶催化反應(yīng)，低的誘導(dǎo)溫度可能導(dǎo)致重組菌生長(zhǎng)和產(chǎn)酶較慢，而高的誘導(dǎo)溫度又可能導(dǎo)致重組蛋白易折疊錯(cuò)誤而以包涵體的形式從而導(dǎo)致酶活很低，因此需要對(duì)重組菌的誘導(dǎo)溫度進(jìn)行優(yōu)化。本研究選取了3個(gè)不同的誘溫度25℃、30℃和37℃，考察了誘導(dǎo)溫度對(duì)重組菌的生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的影響，結(jié)果如圖7所示。重組菌的OD600隨著誘導(dǎo)溫度的增加顯示為先增加后降低，30℃時(shí)重組菌的OD600最高為12.5，25℃為11.5，37℃最低為11；而重組菌的酶活則是隨著溫度升高而降低，在25℃時(shí)酶活最高為107 U/mL，30℃時(shí)酶活為87.5 U/mL，當(dāng)誘導(dǎo)溫度為37℃時(shí)酶活最低僅有35 U/mL，可以看出低溫有利于重組酶的表達(dá)。由于低于25℃的溫度不易控制，成本較高，故本研究選取發(fā)酵產(chǎn)酶的最佳溫度為25℃。

2.5 重組Tre F的酶學(xué)性質(zhì)

2.5.1 溫度對(duì)重組Tre F酶活力的影響 將酶液分別置于不同溫度進(jìn)行酶反應(yīng)并測(cè)定酶活，以最高酶活為100%，結(jié)果如圖8，海藻糖酶反應(yīng)液在50-60℃時(shí)活性較高，在50℃時(shí)酶活最高，而當(dāng)溫度超過(guò)60℃后酶活急劇下降，由此可推斷出海藻糖酶的最適反應(yīng)溫度為50℃。

圖7 誘導(dǎo)溫度對(duì)重組菌的生物量和產(chǎn)酶情況的影響

圖8 反應(yīng)溫度對(duì)重組Tre F酶活力的影響

2.5.2 pH對(duì)重組Tre F的影響 待測(cè)樣品分別置于不同pH的緩沖液中測(cè)定酶活，以最高酶活為100%，結(jié)果見(jiàn)圖9。當(dāng)pH小于7.0時(shí)海藻糖酶的酶活隨著pH的增加而上升，海藻糖酶在pH 7.0處酶活最高，而當(dāng)pH大于7.0時(shí)海藻糖酶的酶活隨著pH的增加而逐漸下降。由此可判斷海藻糖酶的最適反應(yīng)pH為7.0。

2.5.3 重組Tre F的溫度穩(wěn)定性 將粗酶液分別置于30℃、37℃、50℃的水浴鍋進(jìn)行保溫，測(cè)定其殘留酶活。結(jié)果（圖10）顯示，Tre F在30℃放置24 h，酶活基本無(wú)下降，可見(jiàn)重組酶在30℃下具有良好的穩(wěn)定性；在37℃下放置時(shí)，Tre F半衰期約為12 h，具有較好的穩(wěn)定性；而在50℃下放置時(shí)，酶迅速失活，半衰期大約只有10 min，可見(jiàn)重組酶在較高溫度條件下穩(wěn)定性較差。綜上所述，Tre F在30℃時(shí)具有良好的穩(wěn)定性。

圖9 pH對(duì)重組Tre F酶活力的影響

圖10 重組Tre F在30℃和37℃的溫度穩(wěn)定性

2.6 加酶量對(duì)葡萄糖轉(zhuǎn)化率的影響

由于重組Tre F在30℃的穩(wěn)定性較好，保溫24 h酶活基本不變，因此酶轉(zhuǎn)化時(shí)選取30℃進(jìn)行酶反應(yīng)。葡萄糖轉(zhuǎn)化率結(jié)果如圖11所示，相同的反應(yīng)時(shí)間內(nèi)葡萄糖的轉(zhuǎn)化率隨著海藻糖酶的加酶量的逐漸增加而增大，當(dāng)單位加酶量為24 U時(shí)轉(zhuǎn)化率就能達(dá)到84.3%，當(dāng)單位加酶量為36 U時(shí)轉(zhuǎn)化率能達(dá)到92.2%，繼續(xù)提高加酶量到單位加酶量為84 U時(shí)轉(zhuǎn)化率達(dá)到最高98.4%，之后提高加酶量葡萄糖的轉(zhuǎn)化率基本不變。因此，重組Tre F酶轉(zhuǎn)化反應(yīng)的最適條件為：?jiǎn)挝患用噶繛?4 U，反應(yīng)溫度為30℃，pH為7.0，反應(yīng)時(shí)間為36 h。

圖11 加酶量對(duì)葡萄糖轉(zhuǎn)化率的影響

3 討論

目前，國(guó)內(nèi)外研究較多的海藻糖酶主要有昆蟲來(lái)源，如綠盲蝽（Apolygus lucorum）［18，19］、大豆蚜（Aphis glycines）［20］、棉鈴蟲（Helicoverpa armigera）［21］、甜菜夜蛾（Spodopteraexigua）［22］和煙粉虱（Bemisia tabaci）［23］等，真菌來(lái)源如釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）等，植物來(lái)源如擬南芥（Arabidopsis thaliana）等，而對(duì)細(xì)菌來(lái)源的海藻糖酶進(jìn)行研究的報(bào)道并不多。譚永安等［19］將綠盲蝽水溶性海藻糖酶ALTre-1基因在宿主E. coli BL21（DE3）中能夠高效表達(dá)，純化獲得的重組蛋白具有較高的海藻糖水解活性，最適溫度為55℃，最適pH為7.0，在最適溫度和最適pH下純化獲得的重組蛋白酶活達(dá)到（228.59±4.62）nmol·μg-1·min-1。呂燁等［24］構(gòu)建了酵母海藻糖酶缺失突變株，使突變株的海藻糖積累量和細(xì)胞密度均高于親本，提高了其冷凍、高溫、高糖和酒精耐性。郭蓓等［25］將擬南芥海藻糖酶基因在E. coli BL21（DE3）菌株中進(jìn)行高效誘導(dǎo)表達(dá)，純化獲得的海藻糖酶蛋白在試管條件下具有較高水解活性的海藻糖酶（報(bào)道未提到酶活力情況），其最適溫度為45℃。

本研究以E. coli str. K-12 substr. MG1655的基因組為模板，克隆PCR擴(kuò)增出其海藻糖酶基因Tre F，選用pET-24a（+）為表達(dá)載體，構(gòu)建了高效原核表達(dá)重組質(zhì)粒，將重組菌轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主E. coli BL21（DE3），對(duì)重組菌進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，并對(duì)重組菌進(jìn)行誘導(dǎo)條件優(yōu)化，最佳誘導(dǎo)溫度為25℃，最佳IPTG誘導(dǎo)濃度為0.4 mmol/L。在最佳誘導(dǎo)條件下：海藻糖酶的酶活可達(dá)到107 U/mL。此外，通過(guò)酶學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)海藻糖酶的最適反應(yīng)溫度為50℃，最適pH為7.0。將該酶用于海藻糖水解時(shí)，當(dāng)?shù)孜锖Ｔ逄菨舛葹?00 g/L，加酶量為每克底物84 U，初始pH 7.0，溫度為30℃，150 r/min，反應(yīng)36 h，葡萄糖的轉(zhuǎn)化率最高為98.4%。這一過(guò)程說(shuō)明，從E. coli str. K-12 substr. MG1655中克隆得到的海藻糖酶基因Tre F不但能夠在E.coli BL21（DE3）中完整表達(dá)，而且得到的重組蛋白對(duì)海藻糖具有很好的水解活性。本研究是首次將E. coli str. K-12 substr. MG1655的海藻糖酶基因Tre F進(jìn)行重組表達(dá)的報(bào)道，得到的重組蛋白具有較高的海藻糖水解活性（107 U/mL），在30℃具有很好的穩(wěn)定性（放置24 h酶活基本無(wú)下降），將之應(yīng)用于海藻糖的水解，以300g/L的海藻糖溶液為底物水解率高達(dá)98.4%。與其他來(lái)源的海藻糖酶相比，E. coli str. K-12 substr. MG1655來(lái)源的海藻糖酶基因在表達(dá)宿主E. coli BL21（DE3）重組表達(dá)是同源表達(dá)，具有表達(dá)效率高、操作簡(jiǎn)單、應(yīng)用效果好等優(yōu)點(diǎn)。

4 結(jié)論

構(gòu)建了重組菌E. coli BL21（DE3）/pET-24a（+）-Tre F，對(duì)誘導(dǎo)溫度、IPTG誘導(dǎo)濃度進(jìn)行發(fā)酵優(yōu)化，獲得最佳誘導(dǎo)發(fā)酵條件：25℃，0.4 mmol/L IPTG，誘導(dǎo)24 h后，Tre F酶活達(dá)到107 U/mL。Tre F酶的最適反應(yīng)pH為7.0，最適反應(yīng)溫度是50℃。此外，將該酶用于海藻糖水解，當(dāng)?shù)孜锖Ｔ逄菨舛葹?00 g/L，單位底物加酶量為84 U，初始pH 7.0，溫度為30℃，150 r/min，反應(yīng)36 h，葡萄糖的轉(zhuǎn)化率達(dá)到98.4%。

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（責(zé)任編輯 狄艷紅）

Recombinant Expression and Characterization of Trehalase Tre F from Escherichia coli str. K-12 substr. MG1655

YU Lin-gang1SU Ling-qia2WU Jing1，2
（1. State Key Laboratory of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122；2. School of Biotechnology and Key Laboratory of Industrial Biotechnology Ministry of Education，Jiangnan University，Wuxi 214122）

Trehalase is a trehalose hydrolase，which can distinctively catalyze trehalose into two molecules of glucose. In order to have a recombinant expression and application of the trehalase gene Tre F from Escherichia coli str. K-12 substr. MG1655 in E. coli BL21（DE3），the Tre F was amplified by PCR，and a recombinant strain E. coli BL21（DE3）/pET-24a（+）-Tre F was constructed. The highest activity reached 107 U/mL when the strain was cultured in shake flask for 24 h at induction temperature 25℃and IPTG induction concentration 0.4 mmol/L. Further study of the enzymatic properties indicated that the optimal pH and temperature was 7.0 and 50℃，respectively. The crude enzyme was used in the hydrolysis of trehalose. The reaction conditions for the conversion was as the following：initial trehalose concentration 300 g/L，initial pH 7.0，reaction temperature 30℃，enzyme concentration 84 U/g. When the reaction was performed under this specified condition，the glucose yield reached the maximum of 98.4 % at 36 h. This paper is the first report on the recombinant expression of trehalase gene Tre F of E. coli str. K-12 substr. MG1655 in E. coli BL21（DE3）.

trehalase；gene cloning；recombinant expression；enzyme properties

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.04.023

2016-09-30

國(guó)家自然科學(xué)基金杰出青年基金（31425020），江蘇省2015年度普通高校研究生實(shí)踐創(chuàng)新計(jì)劃（SJLX15_0543）

于林港，男，碩士，研究方向：工業(yè)微生物與酶技術(shù)；E-mail：13771099654@163.com

吳敬，女，博士生導(dǎo)師，研究方向：食品與發(fā)酵；E-mail：jingwu@jiangnan.edu.cn