朱鳳芝 程赪 劉祥勝 張昆 王立爽 王敏 駱健美

（工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（天津科技大學(xué)） 天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457）

利用響應(yīng)面法優(yōu)化巴卡亭III生成10-DAB的工藝條件

朱鳳芝 程赪 劉祥勝 張昆 王立爽 王敏 駱健美

（工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（天津科技大學(xué)） 天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457）

10-脫乙?；涂ㄍII（10-DAB）是紫杉烷類抗腫瘤藥物多烯紫杉醇的前體物質(zhì)。采用響應(yīng)面法優(yōu)化成團(tuán)泛菌P2-A-8轉(zhuǎn)化巴卡亭III生成10-DAB的工藝條件。利用Box-Behnken試驗(yàn)和方差分析，從菌體培養(yǎng)時(shí)間、菌體濃度OD600、底物終濃度、轉(zhuǎn)化溫度、轉(zhuǎn)化時(shí)間5個(gè)方面優(yōu)化成團(tuán)泛菌P2-A-8轉(zhuǎn)化巴卡亭III生成10-DAB的工藝條件。結(jié)果表明，獲得最佳轉(zhuǎn)化工藝條件為：菌體經(jīng)過二級培養(yǎng)12 h，轉(zhuǎn)接后調(diào)節(jié)初始OD600為3.0，此時(shí)，加入溶解于甲醇的巴卡亭III溶液，使其終濃度為0.007 mg/mL，32℃，200 r/min下轉(zhuǎn)化4 d，此時(shí)10-DAB的生成率達(dá)到24.5%，比優(yōu)化前提高了446.8%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，響應(yīng)面法優(yōu)化成團(tuán)泛菌P2-A-8轉(zhuǎn)化巴卡亭III生成10-DAB的工藝條件合理可行。該研究成果對于多烯紫杉醇生物合成具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

10-脫乙酰巴卡亭III（10-DAB）；巴卡亭III；成團(tuán)泛菌；生物轉(zhuǎn)化；工藝優(yōu)化

多烯紫杉醇是經(jīng)結(jié)構(gòu)修飾的紫杉烷類抗腫瘤藥物的典型代表，具有高效廣譜的抗腫瘤活性，目前已經(jīng)成為卵巢癌、乳腺癌等腫瘤治療的一線藥物［1］。10-脫乙?；涂ㄍII（10-DAB）是合成該藥物的重要前體（圖1）。

目前報(bào)道的10-脫乙?；涂ㄍII的制備方法主要包括：（1）杉科植物中提?。?0-DAB在不同種植物中的含量差異較大，但總體含量偏低，一般在0.00513%-0.175%左右。此過程需要多次層析、梯度洗脫、多次重結(jié)晶后才能獲得精制品，不僅造成10-DAB的大量損失，降低了收率，而且純化過程中大量的使用乙腈和石油醚等對環(huán)境不友好的有機(jī)溶劑［2］；（2）化學(xué)合成：利用紫杉醇生產(chǎn)過程中的廢料化學(xué)合成10-DAB。但此過程步驟繁瑣，條件苛刻，反應(yīng)中使用各種對環(huán)境不友好的有機(jī)溶劑［3］；（3）微生物轉(zhuǎn)化：微生物轉(zhuǎn)化是指某一微生物將一種物質(zhì)（底物）轉(zhuǎn)化成為另一種物質(zhì)（產(chǎn)物）的過程，其本質(zhì)是利用生物體所產(chǎn)生的酶對外源化合物進(jìn)行酶催化反應(yīng)，它具有反應(yīng)選擇性強(qiáng)（位置選擇性、立體選擇性）、反應(yīng)條件溫和、副產(chǎn)物少和不造成環(huán)境污染等優(yōu)點(diǎn)［4，5］。目前，文獻(xiàn)報(bào)道的能利用微生物轉(zhuǎn)化生成10-DAB的底物有巴卡亭III［6］、紫杉醇［7］和7-表-10-去乙酰巴卡亭III［8］等。其中，利用巴卡亭III作為底物，通過轉(zhuǎn)化反應(yīng)生成10-DAB的微生物主要有白色類諾卡氏菌（Nocardioides albus）［6］、藤黃類諾卡氏菌（Nocardioides luteus）［9］、稻草假單胞菌（Pseudomonas straminea）［10］和成團(tuán)泛菌（Pantoea agglomerans）［11］等。

圖1 多烯紫杉醇的化學(xué)結(jié)構(gòu)式

Hanson等［9］以巴卡亭III為底物，從土壤中分離得到一株能將巴卡亭III轉(zhuǎn)化生成10-DAB的菌株藤黃類諾氏桿菌（Nocardioides luteus）SC 13912，確定了該酶的最適反應(yīng)溫度為37℃，最佳pH為8.0，酶活性在10%甲醇中較高。

王曉鵬［6］選取課題組前期保存的白色類諾卡氏菌4.1334為研究對象，對該菌株的發(fā)酵培養(yǎng)條件進(jìn)行了初步優(yōu)化發(fā)現(xiàn)，最佳發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間為8 d，且采用甲苯破碎法可以有效地使該菌的胞內(nèi)酶釋放。在此破碎條件下該菌株轉(zhuǎn)化巴卡亭III生成10-DAB的生成率在轉(zhuǎn)化時(shí)間為96 h時(shí)達(dá)到最大值，為9%。轉(zhuǎn)化反應(yīng)體系中的最適有機(jī)溶劑甲醇比例在10%-20%之間。

目前，該領(lǐng)域的工作多集中在轉(zhuǎn)化菌株篩選和鑒定、催化酶分離純化及其酶學(xué)性質(zhì)研究等方面，關(guān)于轉(zhuǎn)化工藝的系統(tǒng)優(yōu)化還少見報(bào)道。轉(zhuǎn)化工藝條件的優(yōu)化是提高目的產(chǎn)物生成效率的重要方式。常規(guī)的單因素水平試驗(yàn)方法是針對某一因素的不同取值采用多次實(shí)驗(yàn)，對于獲得最優(yōu)參數(shù)所需的試驗(yàn)次數(shù)較多，耗時(shí)較長，且不能考慮因素之間的相互作用。而響應(yīng)面法［12，13］是一種統(tǒng)計(jì)技術(shù)的合稱。它試圖用最少試驗(yàn)次數(shù)對因素的主效果進(jìn)行盡可能精確的估計(jì)，能在設(shè)計(jì)合理的有限實(shí)驗(yàn)次數(shù)下，評價(jià)各因子對生物過程的影響，探清其交互作用的程度，最后求得最優(yōu)條件。其中Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)是較常用的方法［14］。微生物轉(zhuǎn)化效率的高低受到多個(gè)因素的影響，如菌體生理狀態(tài)、菌體濃度、底物濃度、轉(zhuǎn)化溫度、轉(zhuǎn)化時(shí)間等，且這些因素之間存在著明顯的交互作用［15］，目前，利用響應(yīng)面法優(yōu)化巴卡亭III生成10-DAB的轉(zhuǎn)化工藝的報(bào)道還比較少。

本研究以課題組前期從泰達(dá)污水處理廠污泥中已分離得到的能轉(zhuǎn)化巴卡亭III生成10-DAB的成團(tuán)泛菌P2-A-8為對象，以巴卡亭III為底物，以10-DAB生成率為指標(biāo)，運(yùn)用響應(yīng)面法分析中的因素篩選實(shí)驗(yàn)、最陡爬坡實(shí)驗(yàn)以及中心組合設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，對該菌株的轉(zhuǎn)化工藝進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)優(yōu)化，旨在為進(jìn)一步提高10-DAB的生成量，以及多烯紫杉醇生物合成提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 成團(tuán)泛菌P2-A-8，來源于泰達(dá)污水處理廠污泥，保藏于天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院微生物制藥研究室。

1.1.2 主要試劑 巴卡亭III，純度≥98%，購自上海源葉生物科技有限公司；10-脫乙酰巴卡亭III（10-DAB），純度99%，購自天津希恩思生化科技有限公司。乙腈為天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司產(chǎn)品；甲醇為天津市康科德科技有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 培養(yǎng)基 LB液體培養(yǎng)基（L-1）：酵母提取物10 g，蛋白胨5 g，氯化鈉10 g，pH 7.2，121℃滅菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 成團(tuán)泛菌P2-A-8的生長特性分析 從甘油管中取20 μL菌株P(guān)2-A-8的保存液接種到裝有50 mL LB液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，30℃，200 r/min振蕩培養(yǎng)12 h。以0.5%接種量將上述培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接到裝有50 mL LB液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，30℃，200 r/min振蕩培養(yǎng)。每隔一段時(shí)間取樣測定OD600，繪制生長曲線。實(shí)驗(yàn)中設(shè)定3個(gè)平行。

1.2.2 成團(tuán)泛菌P2-A-8轉(zhuǎn)化巴卡亭III生成10-DAB的初始工藝條件 從甘油管中取20 μL菌株P(guān)2-A-8的保存液接種于含有50 mL LB液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，30℃，200 r/min培養(yǎng)12 h。以0.5%的接種量將上述培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接到含有50 mL LB液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，30℃，200 r/min振蕩培養(yǎng)到一定時(shí)期（此時(shí)OD600達(dá)到3.5左右），此時(shí)，加入溶解于甲醇的巴卡亭III溶液，使其終濃度為0.006 mg/mL，37℃，200 r/min轉(zhuǎn)化3 d。實(shí)驗(yàn)中以不投加底物只加入菌體的LB培養(yǎng)液作為菌體對照組，以只加入底物不加入菌體的LB培養(yǎng)基作為底物對照組。

1.2.3 成團(tuán)泛菌P2-A-8轉(zhuǎn)化巴卡亭III生成10-DAB工藝的響應(yīng)面優(yōu)化 按照1.2.2的方法進(jìn)行菌株P(guān)2-A-8的一級培養(yǎng)和二級培養(yǎng)，收集二級培養(yǎng)到不同時(shí)期的菌體，并將其分別轉(zhuǎn)接到含有50 mL新鮮LB液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，將菌液初始OD600值調(diào)整為不同的水平后，加入不同濃度的溶解于甲醇的巴卡亭III溶液，200 r/min，在不同的條件下進(jìn)行轉(zhuǎn)化。以10-DAB生成率為指標(biāo)，運(yùn)用響應(yīng)面法分析中的因素篩選實(shí)驗(yàn)、最陡爬坡實(shí)驗(yàn)以及中心組合設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，對菌株的轉(zhuǎn)化工藝進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)優(yōu)化。

1.2.3.1 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 選用N=12的Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行關(guān)鍵因素的篩選。選擇的因素和水平見表1。由表1可知，5個(gè)影響因素（菌體培養(yǎng)時(shí)間、菌體濃度、底物終濃度、轉(zhuǎn)化時(shí)間、轉(zhuǎn)化溫度）分別設(shè)為自變量A、B、C、D、E，每個(gè)影響因素取高低兩個(gè)水平。巴卡亭III的轉(zhuǎn)化率和10-DAB生成率為因變量，并預(yù)留5個(gè)空項(xiàng)作為誤差分析。利用Design Expert軟件對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，根據(jù)各因素的F值進(jìn)行顯著性排名，選擇Prob＞F值小于0.30的因素作為關(guān)鍵因素用于后續(xù)的最陡爬坡試驗(yàn)。

表1 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素及水平值

1.2.3.2 最陡爬坡實(shí)驗(yàn) 通過最陡爬坡試驗(yàn)對Plackett-Burman試驗(yàn)篩選得到的關(guān)鍵因素的水平展開進(jìn)一步優(yōu)化，并根據(jù)實(shí)際情況確定合適的步長，以快速逼近最大響應(yīng)區(qū)域（表2）。每組實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)3個(gè)平行。

表2 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.3.3 響應(yīng)面分析 以最陡爬坡試驗(yàn)得到的最高點(diǎn)作為中心組合實(shí)驗(yàn)（Box-Behnken）的中心點(diǎn)，設(shè)計(jì)了三因素三水平共12個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)面分析（表3）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果用Design Expert 軟件分析，根據(jù)擬合得到的回歸方程，在一定水平范圍內(nèi)求取最佳值。

1.2.3.4 優(yōu)化結(jié)果驗(yàn)證 在求得的最佳條件下進(jìn)行轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，將得到的實(shí)驗(yàn)值與理論預(yù)測值進(jìn)行對比，以確定模型的可靠性。

1.2.4 底物轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)物生成率的檢測 轉(zhuǎn)化結(jié)束后向轉(zhuǎn)化液中加入等體積的氯仿，37℃，200 r/min萃取1.5 h，然后經(jīng)5 000 r/min離心5 min，得到氯仿萃取液。相同的方法萃取3次，合并收集萃取液，旋蒸去掉有機(jī)溶劑。蒸干后的樣品用1 mL甲醇溶解，用0.22 μm濾膜進(jìn)行過濾，濾液分別用于薄層層析法（TLC）和高效液相色譜法（HPLC）進(jìn)行分析。

薄層層析分析（TLC）展開劑采用丙酮∶石油醚=2∶3（V/V），顯色劑采用硫酸∶乙醇=1∶9（V/V），105℃下烘烤顯色1-3 min，觀察斑點(diǎn)的顏色和對應(yīng)的比移值。

高效液相色譜的條件：液相色譜儀：Agilent Technologies 1260 Infinity Series；紫 外 檢 測 器：Agilent Technologies 1200 Infinity Series；色 譜 柱：Agela C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇∶乙腈∶水=24∶37∶39（V/V/V）；檢測波長：227 nm；流速：0.8 mL/min；柱溫：室溫；進(jìn)樣體積：10 μL。根據(jù)譜圖中的保留時(shí)間和標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定轉(zhuǎn)化液中底物巴卡亭III和目標(biāo)產(chǎn)物10-DAB的含量。1.2.5 底物轉(zhuǎn)化率和目標(biāo)產(chǎn)物生成率的計(jì)算 10-DAB生成率（%）=轉(zhuǎn)化液中產(chǎn)物質(zhì)量/投加的底物質(zhì)量×100；巴卡亭III轉(zhuǎn)化率（%）=（1-轉(zhuǎn)化液中殘余的底物質(zhì)量/投加的底物質(zhì)量）×100。

表3 Box-Behnken設(shè)計(jì)各因素及其編碼值

2 結(jié)果

2.1 成團(tuán)泛菌P2-A-8的生長特性分析

由圖2可知，成團(tuán)泛菌P2-A-8的延滯期為0-2 h，對數(shù)期為2-7 h，此時(shí)菌體的OD600值由0.12迅速增大到3.50，之后菌體生長進(jìn)入穩(wěn)定期。

2.2 成團(tuán)泛菌P2-A-8轉(zhuǎn)化巴卡亭III生成10-DAB的

初始工藝條件

根據(jù)圖2，選擇了生長達(dá)到穩(wěn)定期（培養(yǎng)12 h，菌體OD600約為3.5）的菌體進(jìn)行轉(zhuǎn)化。菌體P2-A-8轉(zhuǎn)化巴卡亭III生成10-DAB的轉(zhuǎn)化液的TLC和HPLC結(jié)果如圖3-A所示。菌株P(guān)2-A-8的轉(zhuǎn)化液樣品在TLC板上出現(xiàn)了3個(gè)明顯的斑點(diǎn)，其中，按照距離點(diǎn)樣位置由近到遠(yuǎn)的順序觀察到的斑點(diǎn)的比移值Rf分別和10-DAB、巴卡亭III標(biāo)準(zhǔn)品的Rf值相同，分別為0.12和0.25。另外，還有一個(gè)副產(chǎn)物的斑點(diǎn)，其Rf值為0.24。對轉(zhuǎn)化液樣品進(jìn)行HPLC分析（圖3-B），標(biāo)準(zhǔn)品巴卡亭III和10-DAB分離峰的保留時(shí)間分別為5.708 min和4.281 min。菌株P(guān)2-A-8轉(zhuǎn)化巴卡亭III的轉(zhuǎn)化液樣品在保留時(shí)間4.281 min左右均出現(xiàn)了一個(gè)明顯的分離峰，表明轉(zhuǎn)化液中含有10-DAB。這一結(jié)果與TLC的結(jié)果相符。認(rèn)為菌株P(guān)2-A-8具有將巴卡亭III轉(zhuǎn)化生成10-DAB的轉(zhuǎn)化能力。且當(dāng)菌體P2-A-8二級培養(yǎng)12 h（此時(shí)OD600為3.5左右）時(shí)直接加入溶解于甲醇的巴卡亭III溶液，使其終濃度為0.006 mg/mL，37℃、200 r/min繼續(xù)轉(zhuǎn)化3 d，10-DAB的生成率為4.48%，底物的轉(zhuǎn)化率為47.8%。

圖2 菌株P(guān)2-A-8的生長曲線

2.3 Plackett-Burman設(shè)計(jì)篩選顯著影響因素

經(jīng)過之前單因素考察等預(yù)實(shí)驗(yàn)確定的各個(gè)因素的水平，采用Plackett-Burman設(shè)計(jì)從5個(gè)影響因素中篩選出具有顯著影響的因素。利用Design Expert軟件對實(shí)驗(yàn)進(jìn)行設(shè)計(jì)，并按設(shè)計(jì)表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表4。

以10-DAB生成率為判斷指標(biāo)，根據(jù)Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果對10-DAB生成率影響因素進(jìn)行效應(yīng)分析，各因素效應(yīng)分析見表5，根據(jù)各因素的F值進(jìn)行顯著性排名，菌體培養(yǎng)時(shí)間、底物終濃度、轉(zhuǎn)化時(shí)間這3個(gè)因素對10-DAB生成率率的影響較大，而這3個(gè)因素對10-DAB生成率的影響均為正效應(yīng)。因而確定這3個(gè)因素作為下一步實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵因素。而菌體濃度和轉(zhuǎn)化溫度對巴卡亭III轉(zhuǎn)化效率的影響較小，根據(jù)其系數(shù)的符號(hào)，選擇二者的低水平用于后續(xù)的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，即菌體濃度為3.0，轉(zhuǎn)化溫度為32℃。

圖3 菌株P(guān)2-A-8轉(zhuǎn)化巴卡亭III的TLC（A）和HPLC（B）結(jié)果

2.4 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及其結(jié)果

響應(yīng)面擬合方程只有在考察的鄰近區(qū)域里才能充分近似真實(shí)情況，所以應(yīng)先逼近最大影響區(qū)域后再建立有效的擬合方程。根據(jù)Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)，正效應(yīng)明顯的因素（菌體培養(yǎng)時(shí)間、底物終濃度、轉(zhuǎn)化時(shí)間）取其較高值，最陡爬坡實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果（表6）顯示，隨著菌體培養(yǎng)時(shí)間、轉(zhuǎn)化時(shí)間和底物終濃度的變化，10-DAB的生成率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，當(dāng)菌體培養(yǎng)時(shí)間為12 h、轉(zhuǎn)化時(shí)間為5 d和底物終濃度為0.007 mg/mL時(shí)，所得到的轉(zhuǎn)化液中的10-DAB生成率最高。因此，以這組條件為中心點(diǎn)，進(jìn)行下一步優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

2.5 響應(yīng)面分析

根據(jù)菌體培養(yǎng)時(shí)間、轉(zhuǎn)化時(shí)間和底物終濃度的變化點(diǎn)，采用Box-Behnken設(shè)計(jì)，設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)，各因素水平選擇及其結(jié)果如表7所示。

運(yùn)用Design-Expert軟件對表7試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得出回歸方程：Y=15.40+0.95X1+0.56X2+ 1.52X3+0.77X1X2+0.63X1X3-1.93X2X3-4.48X12-1.10X22-3.53X32。方程中Y為10-DAB的生成率，X1為菌體培養(yǎng)時(shí)間，X2為轉(zhuǎn)化時(shí)間，X3為底物終濃度（表8）。方差分析顯著性檢驗(yàn)表明，R2=91.06%，方程回歸性顯著。預(yù)測模型的使用條件為菌體培養(yǎng)時(shí)間10-14 h、轉(zhuǎn)化時(shí)間2-6 d、底物終濃度0.006-0.008 mg/mL，在此條件下可以用該模型對轉(zhuǎn)化液中的10-DAB生成率進(jìn)行預(yù)測。

表4 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

通過對回歸模型進(jìn)行響應(yīng)面分析，可以得到3個(gè)響應(yīng)面立體分析圖（圖4、圖5、圖6），對回歸方程求解，得模型極值點(diǎn)，即回歸模型Y值最大估計(jì)值為25.2%，極值點(diǎn)分別對應(yīng)A、C、D因素的值為12、4、0.007，即菌體培養(yǎng)時(shí)間12 h，轉(zhuǎn)化時(shí)間4 d，底物終濃度0.007 mg/mL。

2.6 優(yōu)化結(jié)果驗(yàn)證

根據(jù)模型預(yù)測得到的最佳轉(zhuǎn)化條件進(jìn)行了3次實(shí)驗(yàn)，得到10-DAB平均生成率為24.5%，與預(yù)測值25.2%接近，說明該模型能較好的預(yù)測底物實(shí)際轉(zhuǎn)化生成10-DAB的情況。

2.7 優(yōu)化前后的工藝和10-DAB生成率的比較

如表10所示，轉(zhuǎn)化工藝優(yōu)化后菌株P(guān)2-A-8對巴卡亭III轉(zhuǎn)化液中10-DAB的生成率為24.5%。與優(yōu)化前相比，提高了446.8%。

表5 Plackett-Burman各因素效應(yīng)分析

表6 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

3 討論

表7 Box-Behnken設(shè)計(jì)表及實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2010年，李松等［11］以甲苯破碎菌體得到的粗酶液進(jìn)行巴卡亭III的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，結(jié)合TLC、HPLC、LC-MS等檢測手段，從采集自昆明市區(qū)周圍和大理云龍縣等地的肉類市場、屠宰廠、飯館、食堂、油坊等的土樣中，篩選得到1株巴卡亭III C10-脫乙酰酶產(chǎn)生菌，即能將巴卡亭III轉(zhuǎn)化生成10-DAB的菌株，通過形態(tài)特征、生理生化特征、16S rDNA序列分析等手段，將該菌株鑒定為成團(tuán)泛菌（Pantoea agglomerans）。但研究者只是對該菌株轉(zhuǎn)化巴卡亭III生成10-DAB的能力進(jìn)行了定性驗(yàn)證，并未對菌株生產(chǎn)10-DAB的能力進(jìn)行定量分析。本研究以課題組前期以從泰達(dá)污水處理廠污泥中分離得到的成團(tuán)泛菌P2-A-8為對象，利用Box-Behnken試驗(yàn)和方差分析相結(jié)合的方法對其轉(zhuǎn)化巴卡亭III生成10-DAB的工藝條件進(jìn)行系統(tǒng)優(yōu)化，明確了該菌株具有較高的生產(chǎn)10-DAB的能力。由表10可知，轉(zhuǎn)化時(shí)間和底物終濃度是影響菌株轉(zhuǎn)化巴卡亭III生成10-DAB的主要影響因素。而文獻(xiàn)大多研究的是催化巴卡亭III生成10-DAB的酶的最佳pH、酶的最適溫度等，如研究者將藤黃類諾氏桿菌（Nocardioides luteus SC 13912）催化巴卡亭III生成10-DAB的C10-脫乙?；高M(jìn)行分離純化，發(fā)現(xiàn)純酶分子量大小為40 kD，最佳pH為8.0，在10%甲醇中酶活性較高，最適反應(yīng)溫度為37℃［9］；以白色類諾卡氏菌（Nocardioides albus 4.1334）的粗酶液為對象，發(fā)現(xiàn)該菌株中酶的最適反應(yīng)溫度為37℃［16］。而本研究中成團(tuán)泛菌P2-A-8轉(zhuǎn)化巴卡亭III生成10-DAB的相關(guān)酶的酶學(xué)性質(zhì)還有待于深入研究。

通過實(shí)驗(yàn)證明，PB、最陡爬坡實(shí)驗(yàn)和Box-Behnken設(shè)計(jì)的結(jié)合是一種很好的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)組合，能在最短時(shí)間內(nèi)，快速優(yōu)化轉(zhuǎn)化條件的關(guān)鍵參數(shù)，響應(yīng)值較單因素實(shí)驗(yàn)或正交實(shí)驗(yàn)有明顯的提高。

表8 響應(yīng)面回歸模型ANOVA 分析結(jié)果

4 結(jié)論

圖4 轉(zhuǎn)化時(shí)間和菌體培養(yǎng)時(shí)間對10-DAB生成率交互影響的三維曲面圖（A）和等高線圖（B）

本實(shí)驗(yàn)以巴卡亭III為底物，以10-DAB生成率為指標(biāo)，運(yùn)用響應(yīng)面法分析中的因素篩選實(shí)驗(yàn)、最陡爬坡實(shí)驗(yàn)以及中心組合設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，對成團(tuán)泛菌P2-A-8轉(zhuǎn)化巴卡亭III生成10-DAB的工藝進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)優(yōu)化。確定得到的最優(yōu)轉(zhuǎn)化工藝：菌體分別經(jīng)過一級和二級培養(yǎng)，離心收集二級培養(yǎng)12 h后的菌體，轉(zhuǎn)接到新鮮的LB液體培養(yǎng)基中并使其初始OD600為3.0，此時(shí)，加入溶解于甲醇的巴卡亭III溶液，使其終濃度為0.007 mg/mL，32℃，200 r/min下轉(zhuǎn)化4 d，此時(shí)10-DAB的生成率達(dá)到24.5%，比優(yōu)化前提高了446.8%。該研究成果對于多烯紫杉醇生物合成具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

圖5 底物終濃度和菌體培養(yǎng)時(shí)間對10-DAB生成率交互影響的三維曲面圖（A）和等高線圖（B）

圖6 轉(zhuǎn)化時(shí)間和底物終濃度對10-DAB生成率交互影響的三維曲面圖（A）和等高線圖（B）

表10 轉(zhuǎn)化條件優(yōu)化前后轉(zhuǎn)化液中10-DAB生成率比較

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（責(zé)任編輯 李楠）

Optimization of Biotransformation Technology for 10-DAB Production from Baccatin III Using Response Surface Methodology

ZHU Feng-zhi CHENG Cheng LIU Xiang-sheng ZHANG Kun WANG Li-shuang WANG Min LUO Jian-mei
（Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology（Tianjin University of Science &Technology），Ministry of Education，Tianjin Key Lab of Industrial Microbiology，College of Biotechnology，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457）

10-Deacetyl baccatin III（10-DAB）is the synthetic precursor of docetaxel-a taxanes drug with anti-tumor activity. The biotransformation technology conditions for 10-DAB production from baccatin III by Pantoea agglomerans P2-A-8 was optimized by response surface methodology（RSM）. Using Box-Behnken test and variance analysis，the transformation conditions for baccatin III to 10-DAB were optimized from the followings：cell culture time，cell concentration OD600，substrate final concentration，transformation temperature，and transformation time. The optimized biotransformation conditions were as follows：after the second stage cultivation for 12 h，cells were transferred and the initial OD600of cells was adjusted to 3.0 and the final concentration of baccatin III solution（dissolved in methanol）was 0.007 mg/mL The biotransformation was performed at 32℃ on a rotary shaker（200 r/min）for 4 d. Under the above optimized conditions，the yield of 10-DAB reached 24.5%，which increased by 446.8% compared with that before optimization. This study proved that applying RSM for modeling of 10-DAB production from baccatin III by Pantoea agglomerans P2-A-8 was reasonable and feasible. This result has important application value for docetaxel biosynthesis.

10-DAB；baccatin III；Pantoea agglomerans；biotransformation；technology optimization

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.04.031

2016-07-20

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（21646017，21306138），2015年天津市大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃（國家級）（201510057017）

朱鳳芝，女，碩士研究生，研究方向：微生物轉(zhuǎn)化；E-mail：zfz09045235@163.com

駱健美，女，博士，研究方向：微生物轉(zhuǎn)化；E-mail：luojianmei@tust.edu.cn