田海英 徐海苗 楊琛 趙惠琤 王立平 徐棟

·經(jīng)驗(yàn)交流·

超聲引導(dǎo)下細(xì)針穿刺聯(lián)合細(xì)胞蠟塊免疫組化及基因檢測(cè)在診斷肺癌鎖骨上淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中的價(jià)值

田海英 徐海苗 楊琛 趙惠琤 王立平 徐棟

目的探討超聲引導(dǎo)下細(xì)針穿刺聯(lián)合細(xì)胞蠟塊免疫組化及基因檢測(cè)對(duì)老年肺癌鎖骨上淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的臨床應(yīng)用價(jià)值。方法選取85例肺癌鎖骨上淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者（共95個(gè)淋巴結(jié)），采用超聲引導(dǎo)下細(xì)針穿刺獲得標(biāo)本，行細(xì)胞學(xué)涂片檢查，同時(shí)制作細(xì)胞蠟塊行免疫組織化學(xué)和基因檢測(cè)。結(jié)合隨訪結(jié)果分析兩種檢查方法的臨床應(yīng)用價(jià)值。結(jié)果85例患者共穿刺95個(gè)淋巴結(jié)，超聲引導(dǎo)細(xì)針穿刺診斷淋巴結(jié)陽性率為44.8%（30/67），組織學(xué)正確分類比例為37.3%（25/67），淋巴結(jié)陰性率為55.2%（37/67），穿刺成功率為70.5%（67/95）。聯(lián)合細(xì)胞蠟塊切片行免疫組織化學(xué)檢查后，淋巴結(jié)陽性率為77.4%（72/93），組織學(xué)正確分類比例為59.1%（55/93），淋巴結(jié)陰性率為22.6%（21/93），穿刺成功率為97.9%（93/95）。兩種方法比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。37例肺腺癌細(xì)胞蠟塊樣本中22例行表皮生長(zhǎng)因子受體基因突變檢測(cè)，16例突變陽性，突變率72.7%。結(jié)論超聲引導(dǎo)下細(xì)針穿刺聯(lián)合細(xì)胞蠟塊免疫組化診斷肺癌鎖骨上淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移簡(jiǎn)單實(shí)用，可提高臨床診斷準(zhǔn)確率。

超聲檢查；肺癌；鎖骨上淋巴結(jié)；細(xì)胞蠟塊；組織學(xué)

肺癌是目前危害人類健康最常見的惡性腫瘤，其中80%～90%為非小細(xì)胞肺癌［1］，而鎖骨上淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是肺癌常見的轉(zhuǎn)移方式。肺癌發(fā)生鎖骨上淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移被認(rèn)為是N3期，外科手術(shù)的遠(yuǎn)期獲益不明顯［2］。目前臨床上有部分患者在原發(fā)灶病理組織獲取方面出現(xiàn)困難，主要原因是病灶較小或位置靠近肺組織外周，纖支鏡或CT定位下難以獲取有效組織成分，從而無法進(jìn)行免疫組化和基因檢測(cè)。對(duì)于這部分患者如發(fā)現(xiàn)有鎖骨上淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，則可在超聲引導(dǎo)下行細(xì)針穿刺并制作細(xì)胞蠟塊。本研究通過在超聲引導(dǎo)下行鎖骨上淋巴結(jié)細(xì)針穿刺并制作細(xì)胞蠟塊，結(jié)合免疫組化和基因檢測(cè)，探討其對(duì)肺癌鎖骨上淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的臨床價(jià)值。

資料與方法

一、臨床資料

選取2014年1月至2016年4月浙江省腫瘤醫(yī)院收治的85例肺癌患者，其中男63例，女22例，年齡49～85歲，平均（62.68±9.13）歲，60歲以上老年患者占76.5%，所有患者臨床病理資料完整。85例患者共95個(gè)淋巴結(jié)，結(jié)節(jié)最大直徑為4～19mm，平均（8.19±3.18）mm。

二、儀器與試劑

1.儀器：使用GELogiq E 9彩色多普勒超聲診斷儀，9L-D線陣探頭和ML6-15D探頭，頻率9～15MHz。

2.試劑及抗體：免疫組織化學(xué)染色的相關(guān)抗體購自上?；蚬尽１砥どL(zhǎng)因子受體（EGFR）試劑盒購自廈門艾德公司。

三、方法

1.細(xì)針穿刺：患者去枕取平臥位，對(duì)鎖骨上可疑轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)行多軸位掃查，確定結(jié)節(jié)大小，選擇進(jìn)針位置。常規(guī)對(duì)鎖骨上區(qū)域局部皮膚進(jìn)行消毒后，在超聲引導(dǎo)下避開大血管、氣管及周圍神經(jīng)等重要組織，沿淋巴結(jié)長(zhǎng)軸經(jīng)皮刺入淋巴結(jié)皮質(zhì)內(nèi)，保持針管內(nèi)持續(xù)負(fù)壓，反復(fù)旋轉(zhuǎn)抽吸并進(jìn)行多點(diǎn)多方向提插，抽取10～15次，直至所需標(biāo)本進(jìn)入針頭柄及針管后去負(fù)壓退針（圖1）。

圖1 超聲引導(dǎo)下細(xì)針穿刺示意圖

2.涂片制作及細(xì)胞學(xué)診斷：將針管內(nèi)的穿刺標(biāo)本均勻涂布于載玻片上，立即置入95%乙醇，固定15min后行常規(guī)巴氏染色，顯微鏡下觀察并做出細(xì)胞學(xué)診斷。

3.細(xì)胞蠟塊制作：將針管內(nèi)剩余樣本注射至10%中性福爾馬林10m l中固定30～60min以上，2000 r/min，離心5m in，沉淀后棄上層清液，沉淀物瓊脂凝集成塊，濾紙包裹，常規(guī)脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋，厚4μm連續(xù)切片10張以上行HE染色并在顯微鏡下觀察［3］。

4.免疫組織化學(xué)染色：每例樣本的細(xì)胞蠟塊切片同時(shí)進(jìn)行ALK（D5F3）（＋）、ALK-NC（-）、ROS1（-）、c-Met（＋＋，80%）、CK7（＋）、Napsin A（＋）、P40（-）、P63（-）、TTF1（＋）及CK5/6（-）等10項(xiàng)免疫組織化學(xué)染色，采用Lab Vision公司生產(chǎn)的Labvision Autostainer720型自動(dòng)免疫組織化學(xué)染色，Envision法，處理過程與一般的組織學(xué)檢查相同［3］。

5.EGFR檢測(cè)：確認(rèn)為肺腺癌的細(xì)胞蠟塊樣本采用突變特異性擴(kuò)增系統(tǒng)熒光聚合酶鏈反應(yīng)法進(jìn)行EGFR基因突變的檢測(cè)。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件，率的比較行χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

一、穿刺時(shí)間和并發(fā)癥情況

所有患者均穿刺成功，穿刺時(shí)間不超過10min，未出現(xiàn)血腫、感染、食管氣管損傷及神經(jīng)損傷等并發(fā)癥。

二、超聲引導(dǎo)細(xì)針穿刺與聯(lián)合細(xì)胞蠟塊免疫組化診斷結(jié)果比較

95個(gè)淋巴結(jié)超聲引導(dǎo)細(xì)針穿刺常規(guī)涂片及聯(lián)合細(xì)胞蠟塊診斷結(jié)果比較見表1和圖2。其中，常規(guī)涂片取材成功67個(gè)，超聲引導(dǎo)細(xì)針穿刺診斷淋巴結(jié)陽性率為44.8%（30/67），組織學(xué)正確分類比例為37.3%（25/67），淋巴結(jié)陰性率為55.2%（37/67），穿刺成功率為70.5%（67/95）。超聲引導(dǎo)聯(lián)合細(xì)胞蠟塊取材成功93個(gè)，免疫組織化學(xué)檢查后，淋巴結(jié)陽性率為77.4%（72/93），組織學(xué)正確分類比例為59.1%（55/93），淋巴結(jié)陰性率為22.6%（21/93），穿刺成功率為97.9%（93/95）。兩種方法比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖2 肺腺癌鎖骨上淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移細(xì)針穿刺病理圖

三、細(xì)胞蠟塊EGFR基因檢測(cè)

本研究22例確診為肺腺癌病例的細(xì)胞蠟塊切片采用突變特異性擴(kuò)增系統(tǒng)法行EGFR基因突變檢測(cè)，其中16例突變陽性，突變率72.7%。EGFR突變陽性患者均采用靶向藥物治療。

討論

目前組織學(xué)檢查雖然是鎖骨上淋巴結(jié)病變公認(rèn)的診斷標(biāo)準(zhǔn)，但多需采用外科手術(shù)切除或粗針穿刺獲取組織學(xué)標(biāo)本［4］，對(duì)鎖骨上淋巴結(jié)的初始診斷而言，患者難以接受。為解決這一問題，本院超聲科開展了超聲引導(dǎo)下細(xì)針穿刺聯(lián)合細(xì)胞蠟塊免疫組化檢查。

常規(guī)超聲引導(dǎo)下淋巴結(jié)穿刺活檢在診斷淋巴結(jié)疾病中有著重要作用，超聲定位引導(dǎo)穿刺活檢可實(shí)時(shí)監(jiān)控穿刺針頭，避開重要血管和神經(jīng)組織，具有安全、微創(chuàng)及可重復(fù)性高的特點(diǎn)［5］。有研究［6］顯示，超聲聯(lián)合超聲定位引導(dǎo)穿刺活檢對(duì)腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的準(zhǔn)確性和特異性均較高。在超聲引導(dǎo)下，穿刺針可對(duì)常規(guī)超聲認(rèn)為可疑的腫大淋巴結(jié)進(jìn)行標(biāo)本采集，并可根據(jù)標(biāo)本質(zhì)量實(shí)時(shí)調(diào)整穿刺次數(shù)，為診斷提供更多信息。同時(shí)穿刺操作者可通過二維超聲選擇最佳進(jìn)針路徑，并在穿刺過程中盡量避開大血管和神經(jīng)，減少對(duì)組織的損傷，以及大出血等并發(fā)癥的發(fā)生，較外科手術(shù)切除或粗針穿刺創(chuàng)傷更小，降低了操作難度，有利于臨床推廣應(yīng)用。

細(xì)胞蠟塊免疫組化檢查是一種介于涂片細(xì)胞學(xué)和病理組織學(xué)之間的一種有效的臨床診斷方法［7－9］，利用細(xì)針穿刺標(biāo)本呈現(xiàn)局部組織病理學(xué)形態(tài)，細(xì)胞蠟塊切片中細(xì)胞數(shù)量豐富而且相對(duì)集中，為進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色后分子病理學(xué)檢測(cè)提供了良好的樣本平臺(tái)。近年來，許多獲批的抗癌藥物均為靶向治療藥物，在給藥前對(duì)患者進(jìn)行特定基因突變的篩查，能夠使部分患者獲得最大的治療益處。而目前臨床對(duì)于肺癌選擇用藥的重要依據(jù)是明確組織學(xué)類型，尤其是區(qū)分小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌。對(duì)于非小細(xì)胞肺癌臨床要求進(jìn)一步區(qū)別鱗癌和腺癌，并提供與藥物使用相關(guān)的分子病理學(xué)檢測(cè)結(jié)果，然而目前超過70%的肺癌確診依賴小活檢和細(xì)胞學(xué)樣本［10－11］。本研究對(duì)85例臨床懷疑肺癌卻無法獲取原發(fā)灶組織病理的患者在超聲引導(dǎo)下行鎖骨上可疑腫大淋巴結(jié)細(xì)針穿刺，結(jié)合細(xì)胞蠟塊免疫組化做出了明確診斷及分型，避免了更高風(fēng)險(xiǎn)的其他侵襲性活檢，必要時(shí)對(duì)部分患者進(jìn)行了EGFR基因檢測(cè)，為臨床的靶向治療及預(yù)后評(píng)估等方面提供了依據(jù)。

本研究顯示應(yīng)用超聲引導(dǎo)下細(xì)針穿刺聯(lián)合細(xì)胞蠟塊免疫組化及基因檢測(cè)有較高的臨床推廣價(jià)值：①超聲引導(dǎo)下細(xì)針穿刺在一定程度上有效避免了高風(fēng)險(xiǎn)的侵襲性活檢及不必要的外科手術(shù)，對(duì)大血管周圍或1 cm以下的轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)更具優(yōu)勢(shì)；②超聲引導(dǎo)下穿刺具有微創(chuàng)、可重復(fù)取樣的優(yōu)點(diǎn)，適用范圍廣，尤其適用于晚期老年患者，對(duì)于氣道阻塞及上腔靜脈綜合征引起端坐呼吸的患者同樣適用；③隨著臨床需求不斷提高，如精確定性分型、藥物敏感及預(yù)后相關(guān)性的各類分子檢測(cè)項(xiàng)目的廣泛應(yīng)用，細(xì)針穿刺結(jié)合細(xì)胞蠟塊技術(shù)逐漸成熟和廣泛應(yīng)用；④超聲引導(dǎo)下細(xì)針穿刺聯(lián)合細(xì)胞蠟塊可最終明確病理診斷和疾病分期，為制定治療方案及評(píng)估預(yù)后提供了依據(jù)，提高了臨床的治療水平。

綜上所述，超聲引導(dǎo)下的多點(diǎn)多方向針吸細(xì)胞學(xué)檢查診斷準(zhǔn)確率高、安全性好，穿刺靶點(diǎn)、穿刺針及血管在超聲圖像下可清晰顯示，對(duì)于明確頸部腫大淋巴結(jié)性質(zhì)有重要的應(yīng)用價(jià)值，可作為診斷的首選方法。超聲引導(dǎo)下細(xì)針穿刺聯(lián)合細(xì)胞蠟塊免疫組化不僅為臨床提供診斷依據(jù)，更為臨床的靶向治療及預(yù)后評(píng)估等方面提供了有力證據(jù)。

［1］DeSantis CE，Lin CC，Mariotto AB，et al.Cancer treatment and survivorship statistics，2014［J］.CA Cancer JClin，2014，64（4）：252－271.

［2］Verhagen AF，Bulten J，Shirango H，et al.The clinical value of lymphatic micrometastases in patients with non small cell lung cancer［J］.J Thorac Oncol，2010，5（8）：1201－1205.

［3］徐海苗，程曄，孫文勇.肺癌細(xì)胞病理學(xué)樣本組織學(xué)分類及分子病理學(xué)檢測(cè)［J］.中華實(shí)驗(yàn)外科雜志，2013，30（4）：741－742.

［4］董寶瑋，溫朝陽.介入超聲學(xué)實(shí)用教程［M］.北京：人民軍醫(yī)出版社，2013：66－69.

［5］張榮，王曉榮，姚蘭輝.超聲新技術(shù)診斷淺表淋巴結(jié)病變的進(jìn)展［J］.臨床超聲醫(yī)學(xué)雜志，2015，17（11）：761-763.

［6］Ciatto S，Brancato B，Risso G，et al.Accurancy of fine need leaspirationcy tology（FNAC）of axillary lymph nodes asatriagetestin breast cancer staging［J］.Breast Cancer Res Treat，2007，103（1）：85－91.

［7］Simone G，Mangia A，Malfettone A，et al.Chromogenic in situ hybridization to detect EGFR gene copy number in cell blocks from fine－needle aspirates of non small cell lung carcinomas and lung metastases from colo－rectalcancer［J］.JExp Clin Cancer Res，2010，29（15）：125.

［8］Gauchotte G，Vignaud JM，Ménard O，et al.A combination of smears and cell block preparations provides high diagnostic accuracy forendobronchialultrasound-guided transbronchialneedleaspiration［J］. Virchows Arch，2012，461（5）：505-512.

［9］Shivakumarswamy U，Arakeri SU，Karigowdar MH，et al.Diagnostic utility of the cellblockmethod versus the conventional smear study in pleural fluid cytology［J］.JCytol，2012，29（1）：11-15.

［10］Ceyhan K，Kupana SA，Bekta M，etal.The diagnostic valueofon-site cytopathological evaluation and cell block preparation in fine-needle aspiration cytology of livermasses［J］.Cytopathology，2006，17（5）：267-274.

［11］Kimbrell HZ，Gustafson KS，Huang M，et al.Subclassification of non-small cell lung cancer by cytologic sampling：a logicalapproach with selectiveuseofimmunocytochemistry［J］.ActaCytof，2012，56（4）：419-424.

V alue of ultrasound－guided fine－needle aspiration cell blocks immunohistochem istry and gene detection in diagnosis of metastatic supraclavicular lym ph nodes in lung cancer

TIANHaiying，XUHaimiao，YANGChen，ZHAOHuicheng，WANGLiping，XUDong
DepartmentofUltrasound，t he Second ClinicalMedicalCollege，Zhejiang ChineseMedicalUniversity，Hangzhou 310053，China

ObjectiveTo investigate the clinical value of ultrasound－guided fine－needle aspiration combined with cell block immunohistochemical and gene testing in the elderly patients with supraclavicular lymph nodemetastasis of lung cancer.MethodsEight-five patientswith supraclavicular lymph nodemetastasis of lung cancerwere collected（95 lymph nodes）.Using ultrasound－guided fine－needle aspiration，the specimenswere obtained cytological smears，and alsomade into cell block for immunohistochemical and genetic testing.Combined with follow－up results，the diagnosis of cytological smearsand cell block immunohistochemicalwere retrospectively analyzed and compared.ResultsA total of 95 lymph nodeswere punctured in 85 patients，the positive rate of lymph node s diagnosis was 44.8%（30/67）by ultrasound-guided fine-heedle aspiration，histological correct classification ratewas37.3%（25/67），the negative rate of lymph node s was55.2%（37/67），and the success rateofpuncturewas70.5%（67/95）.Combinedwith immunohistochemistry，the positive rate of lymph node s diagnosis was77.4%（72/93），the histological correct classification rate was 59.1%（55/93），the negative rate of lymph node s was 22.6%（21/93），and the success rate of puncture was97.9%（93/95）.The differencebetween the twomethodswasstatistically significant（P＜0.05）.37 casesof lung adenocarcinoma cellblock samples in 22 casesof EGFR genemutation detection，16 cases ofmutation－positive，mutation rate was 72.7%.ConclusionThe diagnosis of supraclavicular lymph nodemetastasis in lung cancer is simple and practicalunder the ultrasound－guided fine－needleaspiration combined with cellblock immunohistochemical.Italso can improve the clinicaldiagnosis rate.

Ultrason ography；Lung cancer；Supraclavicular lymph node s；Cellblock；Histology

R734.2；R445.1

A

2016-07-16）

310053杭州市，浙江中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床學(xué)院超聲醫(yī)學(xué)科（田海英）；浙江省腫瘤醫(yī)院病理科（徐海苗），超聲科（楊琛、趙惠琤、王立平、徐棟）

徐棟，Email：xudnj＠163.com