周杰，張莉，張鮑虎，黃偉忠，徐康立，張揚

(深圳市坪山新區(qū)人民醫(yī)院檢驗科，廣東 深圳 518118)

RNA恒溫擴增法在肺炎支原體檢測中的應(yīng)用

周杰，張莉，張鮑虎，黃偉忠，徐康立，張揚

(深圳市坪山新區(qū)人民醫(yī)院檢驗科，廣東 深圳 518118)

目的 探討RNA恒溫擴增法檢測肺炎支原體的可行性及其應(yīng)用價值。方法采集2016年5～7月在我院住院治療的200例患急性呼吸道感染兒童咽拭子，分別用RNA恒溫擴增法和PCR熒光探針法進行肺炎支原體檢測，分別計算兩種檢測方法的檢出率，根據(jù)公式計算靈敏度和特異性，并進行統(tǒng)計學(xué)分析。結(jié)果RNA恒溫擴增法檢出肺炎支原體17例，檢出率為8.5%，PCR熒光探針法檢出肺炎支原體18例，檢出率為9.0%，兩種方法的檢出率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；RNA恒溫擴增法與PCR熒光探針法相比靈敏度為88.9%、特異度為99.5%。結(jié)論RNA恒溫擴增法與PCR熒光探針法檢出率相當(dāng)，具有較高的靈敏度和特異度，可以作為一種新的方法用于肺炎支原體臨床檢測。

RNA恒溫擴增法；PCR熒光探針法；肺炎支原體

肺炎支原體(Mycoplasma pneumoniae，MP)是沒有細胞壁，能通過濾菌器，可在無生命培養(yǎng)基培養(yǎng)增殖的介于病毒和細菌之間的原核細胞型微生物[1]。MP青少年易感，主要經(jīng)呼吸道感染，可引起支氣管炎，常伴有上呼吸道感染癥狀，約30%的感染者可引起肺炎，個別患者并發(fā)呼吸道以外的疾病，如腦膜炎、心包炎、皮疹等[2]。目前檢測MP的方法有多種，如血清學(xué)檢測、快速培養(yǎng)法等，但均存在不同的缺陷，如血清學(xué)檢測陽性率易受患者免疫力水平的影響，快速培養(yǎng)法檢測結(jié)果易受到送檢標(biāo)本中其他病原體的干擾。核糖核酸(ribonucleic acid，RNA)恒溫擴增法是一種新興的檢測方法，具有敏感度高、針對活菌檢測的特點，但其檢測性能需要進一步驗證。本文擬收集我院近年來臨床診斷為急性呼吸道感染的標(biāo)本，以目前臨床較認可的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)熒光探針法作為對照，分析其靈敏度和特異度，探討該方法在臨床診斷中的應(yīng)用價值，現(xiàn)報道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集于2016年5～7月在我院兒科住院的200例臨床診斷為急性呼吸道感染的兒童咽拭子標(biāo)本，其中男性123例，女性77例，年齡1個月～13歲。所有患者均在入院當(dāng)天采集咽拭子送檢，標(biāo)本接收后立即用1 mL生理鹽水進行病原體洗脫，洗脫液分裝成2份放-20℃冰箱待檢。

1.2 儀器與試劑 檢測儀器均為美國ABI 7500型實時熒光定量PCR儀，RNA恒溫擴增法試劑采用上海仁度生物技術(shù)有限公司MP核酸檢測試劑盒，PCR熒光探針法試劑采用中山大學(xué)達安基因股份有限公司MP核酸檢測盒。

1.3 方法

1.3.1 RNA恒溫擴增法 將凍存標(biāo)本恢復(fù)室溫后加500μL裂解液，100μL核酸提取液加入400μL裂解后樣本中，同時設(shè)置陰陽性對照。60℃恒溫5 min后室溫放置10 min，然后置于磁珠分離裝置上靜置5 min，吸凈管蓋及管中的氣泡和液體，洗滌液洗滌2次，加入40μL擴增液，震蕩混勻，取30μL磁珠懸液至新的微量反應(yīng)管中，60℃恒溫10 min，42℃恒溫5 min，加入10μL擴增酶，放入核酸擴增儀進行檢測。反應(yīng)程序：采用FAM熒光通道，42℃1 min，40個循環(huán)，并進行溶解曲線分析。設(shè)定閾值后分別讀取每個樣本的dt值(RNA擴增循環(huán)數(shù))。dt值≤35設(shè)定為陽性，dt值≥40設(shè)定為陰性；dt值在35～40之間的樣本重新擴增后，設(shè)定dt值≤35為陽性，dt>35為陰性。

1.3.2 PCR熒光探針法 將凍存標(biāo)本室溫放置后，12 000 r/min離心5 min后去上清，沉淀加入50μL脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid，DNA)提取液，100℃干浴10 min后12 000 r/min離心5 min，吸取上清液。反應(yīng)管中加入2μL上清液、40μL反應(yīng)液、3μL擴增酶供擴增。反應(yīng)程序：采用FAM熒光通道，93℃2 min，1個循環(huán)；93℃45 s，55℃60 s，10個循環(huán)；93℃30 s，55℃45 s，30個循環(huán)。設(shè)定閾值后分別讀取每個樣本的ct值(DNA擴增循環(huán)數(shù))，設(shè)定ct值<30為陽性。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，率的比較采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1兩種檢測方法的檢出率比較 200份咽拭子標(biāo)本分別進行RNA恒溫擴增法與PCR熒光探針法檢測，其中RNA恒溫擴增法檢出肺炎支原體17例，檢出率為8.5%，PCR熒光探針法檢出肺炎支原體18例，檢出率為9.0%，RNA恒溫擴增法與PCR熒光探針法檢出率進行χ2檢驗，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.031，P>0.05)。

2.2 兩種檢測方法的靈敏度和特異比較 以PCR熒光探針法的檢出陽性率和陰性率作為對照，根據(jù)公式計算RNA恒溫擴增法的相對靈敏度和特異度，結(jié)果顯示RNA恒溫擴增法的靈敏度為88.9%，特異度為99.5%，見表1。

表1 RNA恒溫擴增法與PCR熒光探針法檢測肺炎支原體結(jié)果(例)

3 討 論

肺炎支原體是引起上呼吸道感染、急性支氣管炎、支氣管哮喘、肺炎等臨床疾病一種病原體，肺炎支原體肺炎是小兒肺炎的常見類型之一，是由MP引起的間質(zhì)性肺炎，多有發(fā)熱、頭痛、咽喉痛及劇烈咳嗽等癥狀，同時還常伴有廣泛多器官、多系統(tǒng)的肺外合并癥[3-6]。兒童感染MP臨床表現(xiàn)不典型，易與病毒性感冒等疾病相混淆，容易被誤診而延誤治療，因此如何快速準(zhǔn)確檢測出MP對臨床正確診斷病情有重要的幫助。

MP的實驗室檢測方法目前是MP傳統(tǒng)培養(yǎng)法、MP快速培養(yǎng)法、血清學(xué)抗體檢測以及PCR技術(shù)等。MP傳統(tǒng)培養(yǎng)法雖然是檢測MP的金標(biāo)準(zhǔn)，但由于其培養(yǎng)條件要求高、敏感度低、培養(yǎng)時間長，不能滿足臨床快速診斷的要求，限制了其臨床應(yīng)用。MP快速培養(yǎng)法采用的是液體培養(yǎng)，根據(jù)液體培養(yǎng)基的顏色變化來判斷陰陽性，但是當(dāng)有其他病原體生長繁殖時也可以引起顏色變化而造成假陽性[7]。王楠等[8]對95例肺炎支原體快速培養(yǎng)陽性標(biāo)本進一步分析，發(fā)現(xiàn)其中有88例為真菌、1例為肺炎鏈球菌、1例為流感嗜血桿菌。血清學(xué)抗體檢測方法雖然簡便易操作，但是存在檢測窗口期的問題，MP抗體一般出現(xiàn)在感染1周后，3～4周達高峰，因此早期診斷敏感性不高；而且檢測結(jié)果易受患者年齡、免疫功能等因素造成的低水平免疫應(yīng)答的影響[9]。PCR熒光探針法可直接檢測患者咽部分泌物中肺炎支原體DNA，具有很高的敏感性和特異性，可用于MP感染的早期診斷[10]，但是治療后短期內(nèi)局部有肺炎支原體DNA殘余，容易影響臨床療效的觀察，同時由于操作人員的不規(guī)范容易引起實驗室DNA污染而影響結(jié)果。

RNA恒溫擴增法是新一代的核酸檢測技術(shù)，其特點是以MP的RNA為靶標(biāo)進行恒溫擴增檢測。因為RNA僅在活菌中存在，MP死亡后RNA快速降解，因此采用該方法進行MP檢測，如果陽性提示MP近期感染，而不是既往感染[11-12]。本研究以PCR熒光探針法作為參照，與該檢測方法對比顯示RNA恒溫擴增法檢測MP的相對敏感度和特異度分別為88.9%和99.5%，提示其具有良好的診斷價值。本研究中有2例RNA恒溫擴增法檢測陰性而PCR熒光探針法檢測陽性，收集臨床資料進一步分析，發(fā)現(xiàn)這2例患兒入院前已經(jīng)應(yīng)用抗生素治療，推測原因可能為MP被殺死后特異性RNA被降解但特異性DNA可能還持續(xù)存在一段時間，從而造成檢測結(jié)果的差異。

綜上所述，RNA恒溫擴增法在MP檢測中具有較高的敏感性和特異性，且只能檢測出活的肺炎支原體，可以作為一種新的方法用于MP臨床檢測。

參考文獻

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Application of isothermal RNA amplification in the detection of Mycoplasma pneumoniae.

ZHOU Jie,ZHANG Li, ZHANG Bao-hu,HUANG Wei-zhong,XU Kang-li,ZHANG Yang.Department of Clinical Laboratory,Pingshan New District People's Hospitalof Shenzhen,Shenzhen 518118,Guangdong,CHINA

ObjectiveTo explore the feasibility and clinical value of isothermal RNA amplification in the detection of Mycoplasma pneumoniae.MethodsA total of 200 patients with acute respiratory tract infection,who admitted to our hospital from May 2016 to July 2016,were selected as the research subjects.Mycoplasma pneumoniae was detected by the method of isothermal RNA amplification and PCR fluorescence probe respectively.The detection rate of Mycoplasma pneumoniae of the two methods was calculated.The sensitivity and specificity were statistically analyzed according to the specific formula.ResultsSeventeen cases of Mycoplasma pneumoniae were detected by isothermal RNA amplification method with 8.5%of detection rate;eighteen cases of Mycoplasma pneumoniae were detected by PCR fluorescence probe method with 9.0%of detection rate;there was no significant difference between the two methods in the detection rate(P>0.05).Compared to PCR fluorescence probe,the sensitivity and specificity of isothermal RNA amplification were respectively 88.9%and 99.5%.ConclusionIsothermal RNA amplification has nearly equivalent detection rate with PCR fluorescence probe buthigher sensitivity and specificity,which can be used as a new method for detecting Mycoplasma pneumoniae clinically.

Isothermal RNA amplification;PCR fluorescentprobe;Mycoplasma pneumoniae

R563.1

A

1003—6350（2017）09—1433—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.09.021

2016-11-16)

廣東省深圳市坪山新區(qū)醫(yī)療衛(wèi)生發(fā)展孵化資助項目(編號：201328)

張莉。E-mail：doudouding722@126.com