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        白藜蘆醇處理對(duì)豬孤雌激活囊胚抗凍能力的影響

        2017-05-19 05:34:45陳亞寧吳彩鳳張樹山張德福戴建軍
        關(guān)鍵詞:玻璃化囊胚膜電位

        陳亞寧,吳彩鳳,張樹山,張德福,戴建軍

        (1上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院,上海 201306;2上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所,上海 201106;3上海市農(nóng)業(yè)遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物遺傳工程研究室,上海 201106)

        白藜蘆醇處理對(duì)豬孤雌激活囊胚抗凍能力的影響

        陳亞寧1,2,3,吳彩鳳2,3,張樹山2,3,張德福2,3,戴建軍2,3

        (1上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院,上海 201306;2上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所,上海 201106;3上海市農(nóng)業(yè)遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物遺傳工程研究室,上海 201106)

        為研究白藜蘆醇(Resveratrol,RES)處理對(duì)豬孤雌激活囊胚抗凍能力的影響,利用2μmol/L RES在卵母細(xì)胞體外成熟、玻璃化冷凍與解凍和隨后的胚胎培養(yǎng)過程中進(jìn)行全程添加,觀察其對(duì)豬孤雌激活囊胚凍后線粒體膜電位、TUNEL凋亡水平、多種Caspase活性、凋亡相關(guān)功能基因mRNA表達(dá)水平和體外發(fā)育能力的影響。結(jié)果顯示:體外成熟和胚胎培養(yǎng)過程中添加RES能顯著提高卵母細(xì)胞孤雌激活后的卵裂率和囊胚率(9518%vs.85.79%,51.85%vs.41.46%,P<0.05)。RES全程添加后其孤雌激活囊胚的抗凍能力顯著提高,表現(xiàn)為囊胚腔恢復(fù)率和囊胚細(xì)胞數(shù)增高(35.09%vs.31.25%,37.95 vs.31.81,P<0.05),線粒體膜電位升高(092 vs.0.46,P<0.05),囊胚細(xì)胞凋亡比例下降(8.24%vs.10.13%,P<0.05),Pan-caspase、Caspase-8、Caspase-9和Caspase-3的熒光強(qiáng)度值和Caspase-8,Caspase-9,TNF-α基因表達(dá)水平下降,Bcl-2和SOD-1表達(dá)水平升高(P<0.05)。與冷凍囊胚相比,新鮮囊胚的線粒體膜電位水平、Bcl-2和SOD-1基因表達(dá)量更高;細(xì)胞凋亡比例、Pan-caspase、Caspase-8、Caspase-9、Caspase-3熒光強(qiáng)度值以及Caspase-8、Caspase-9、TNF-α基因表達(dá)水平則更低(P<0.05)。因此,RES全程添加可通過改善凍后豬孤雌激活囊胚的線粒體功能,降低囊胚細(xì)胞凋亡水平,從而提高其抗凍能力。

        豬;孤雌激活;囊胚;線粒體;凋亡;玻璃化冷凍;白藜蘆醇

        目前,冷凍保存是哺乳動(dòng)物種質(zhì)資源保存的主要方法。自1985年Rall等[1]首次利用玻璃化冷凍法成功冷凍鼠8-細(xì)胞胚胎以來,玻璃化冷凍技術(shù)日益成熟,應(yīng)用已經(jīng)越來越廣泛。然而仍有許多因素影響玻璃化冷凍效率,如凍后出現(xiàn)細(xì)胞骨架損傷、線粒體功能下降和細(xì)胞凋亡等現(xiàn)象[2]。

        培養(yǎng)液是胚胎體外發(fā)育直接接觸的液體環(huán)境,可直接影響胚胎的質(zhì)量和抗凍能力[3-4]。氧化應(yīng)激是造成體外生產(chǎn)胚胎發(fā)育能力下降的一個(gè)重要原因,研究表明在培養(yǎng)液中添加抗氧化劑如β-巰基乙醇、半胱氨酸、巰基乙胺等可以顯著提高胚胎的體外發(fā)育質(zhì)量[3]。白藜蘆醇(Resveratrol,RES)是一種植物抗毒素,具有抗氧化作用,其廣泛存在于花生、李子、葡萄等70多種植物中,在紅葡萄酒預(yù)防人類心血管疾病的功能上發(fā)揮主要作用。近年來有將RES應(yīng)用于哺乳動(dòng)物胚胎體外發(fā)育上的研究,如Wang等[5]發(fā)現(xiàn)在牛卵母細(xì)胞培養(yǎng)液中添加RES,卵母細(xì)胞第一極體排出率和囊胚數(shù)量明顯提高。Abdel-Wahab等[6]在牛胚胎體外培養(yǎng)過程中添加0.5μmol/L的RES,發(fā)現(xiàn)RES具有抵抗胚胎細(xì)胞冷凍損傷的作用。然而RES對(duì)豬孤雌激活囊胚抗凋亡能力影響的研究還未見報(bào)道。

        本研究通過比較在豬卵母細(xì)胞體外成熟(In vitromaturation,IVM)、孤雌激活囊胚體外培養(yǎng)、玻璃化冷凍解凍和凍后恢復(fù)培養(yǎng)的全部過程中添加2μmol/L的RES,研究RES對(duì)豬孤雌激活囊胚凍后線粒體功能、凋亡水平和體外發(fā)育的影響。

        1 材料與方法

        1.1 化學(xué)試劑

        本研究所用試劑除標(biāo)注外均購自美國Sigma公司。

        1.2 卵母細(xì)胞的采集和體外成熟

        豬卵巢由屠宰場(chǎng)提供,卵巢取出后迅速置于35—37℃,0.9%的NaCl溶液(含75μg/mL青霉素和50μg/mL鏈霉素)中,并盡快運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。用18號(hào)針頭的10 mL注射器,選取直徑為2—8 mm的卵泡抽取其中的卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體(Cumulus oocyte complexes,COCs)。放入39℃預(yù)溫的15 mL離心管中,沉淀至少15 min后棄上清。在顯微鏡下挑選胞質(zhì)均勻且有3層以上顆粒細(xì)胞的COCs,在臺(tái)式液和M199(Gibco,美國)中分別洗滌3次,移入提前2 h預(yù)溫平衡的體外成熟培養(yǎng)液中培養(yǎng)44 h,培養(yǎng)條件為385℃,5%CO2,飽和濕度。IVM用M199加10 IU/mL孕馬血清促性腺激素(Pregnant mare serum gonadotropin)(寧波市第三激素制品有限公司)、10 IU/mL人絨毛膜促性腺激素(Human chorionic gonadotropin)(寧波市第三激素制品有限公司)、10%(V/V)豬卵泡液PFF(實(shí)驗(yàn)室自制)、10%(V/V)胎牛血清(Fetal bovine serum,F(xiàn)BS)(Gibco,美國)、0.1 mg/mL的L-半胱氨酸、10 IU/mL雙抗、10 ng/m L表皮生長因子(Epidermal growth factor)配得。成熟過程中如進(jìn)行RES添加,其終濃度為2μmol/L。

        1.3 卵母細(xì)胞的孤雌激活和體外培養(yǎng)

        IVM培養(yǎng)44 h后的COCs經(jīng)0.1%的透明質(zhì)酸酶消化,M199洗滌后用于電激活,電激活參數(shù)為1.2 kV/cm、30μs、一次脈沖。激活液為0.3mol/L甘露醇、50μmol/LCaCl2和0.1mmol/LMgCl2。激活后的卵母細(xì)胞在PZM-3(自制)+5μmol/L細(xì)胞松弛素B(Cytochalasin B)中培養(yǎng)4 h,然后用PZM-3洗3次,移入每孔含有500μL PZM-3和500μL礦物油的四孔板(NUNC,丹麥)中培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為38.5℃,5% CO2,飽和濕度。培養(yǎng)48 h統(tǒng)計(jì)卵裂率,168 h統(tǒng)計(jì)囊胚率。體外培養(yǎng)過程中如進(jìn)行RES添加,其終濃度為2μmol/L。

        1.4 囊胚的玻璃化冷凍和解凍

        冷凍方法:培養(yǎng)所得的囊胚用PZM-3洗3遍,移入平衡液(PZM-3含7.5%EG、7.5%DMSO、20% FBS)中平衡5 min,然后移入冷凍液(PZM-3含0.4 mol/L蔗糖、15%EG、15%DMSO、20%FBS)中,20 s后立即用實(shí)驗(yàn)室自制的OPS管吸取囊胚,并迅速投入液氮中。

        解凍方法:取出液氮中的OPS管,將含有囊胚的一端迅速放入37℃預(yù)溫的解凍液Ⅰ(PZM-3含0.3 mol/L蔗糖、20%FBS)中,置于恒溫培養(yǎng)箱中平衡3 min,然后移入同樣預(yù)溫的解凍液Ⅱ(PZM-3含015 mol/L蔗糖、20%FBS)中,在恒溫培養(yǎng)箱中平衡3 min后,用PZM-3洗3遍,置于PZM-3(或PZM-3+2μmol/L RES)中培養(yǎng)備用。

        培養(yǎng)24 h后統(tǒng)計(jì)囊胚腔恢復(fù)率(即:囊胚腔恢復(fù)的囊胚數(shù)占解凍囊胚總數(shù)的比例)。

        1.5 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

        本試驗(yàn)所用囊胚共分3組,新鮮組:卵母細(xì)胞經(jīng)過IVM培養(yǎng)、孤雌激活、PZM-3培養(yǎng)所得的囊胚;冷凍組:新鮮組囊胚經(jīng)玻璃化冷凍解凍后在PZM-3中孵育24 h所得的囊胚;RES冷凍組:卵母細(xì)胞經(jīng)IVM+2μmol/L RES成熟培養(yǎng)、孤雌激活后在PZM-3+2μmol/L RES培養(yǎng)的囊胚再經(jīng)過冷凍解凍后在PZM-3+2μmol/L RES中孵育24 h所得的囊胚。

        對(duì)上述3組囊胚進(jìn)行線粒體膜電位(ΔΨm)、TUNEL凋亡水平、多種Caspase活性、凋亡相關(guān)基因表達(dá)和體外發(fā)育能力檢測(cè)。

        1.6 線粒體膜電位(ΔΨm)的JC-1檢測(cè)

        使用含10μg/m L JC-1(5,5’,6,6’-tetrachloro-1,1’,3,3’-tetraethyl-imidacarbocyanine iodide)(碧云天,中國)的PZM-3溶液對(duì)上述3組囊胚進(jìn)行線粒體膜電位檢測(cè),染色條件為37℃,避光孵育20 min,然后用PZM-3洗滌3次,用激光共聚焦顯微鏡(TCSSP2,Leica,德國)進(jìn)行檢測(cè)。在囊胚細(xì)胞最大橫截面處,分別觀察和記錄紅色和綠色熒光信號(hào)強(qiáng)度。紅色(RITC)和綠色(FITC)熒光強(qiáng)度的比值即為ΔΨm。每組試驗(yàn)重復(fù)3次,每次約20個(gè)囊胚。

        1.7 TUNEL凋亡染色

        使用一步法TUNEL檢測(cè)試劑盒(碧云天,中國)進(jìn)行凋亡檢測(cè)。3組囊胚經(jīng)4%的多聚甲醛固定60 min,用PZM-3洗3遍,再用含0.1%Triton X-100的PZM-3重懸囊胚,冰浴2 min。PZM-3洗3遍后移入事先配好并預(yù)溫平衡的50μL TUNEL檢測(cè)液(2μL TdT酶+48μL熒光標(biāo)記液)中37℃避光孵育60 min,然后用PZM-3洗3遍。用5μg/mL的Hoechst33342染色液37℃避光孵育10 min,進(jìn)行細(xì)胞核染色,PZM-3洗3遍后放于載玻片上壓片,在倒置熒光顯微鏡(IX71,OLYMPUS,日本)下觀察。分別記錄囊胚的細(xì)胞數(shù)和凋亡細(xì)胞數(shù)。每組重復(fù)3次,每次約20個(gè)囊胚。

        1.8 Caspase染色

        對(duì)3組囊胚分別進(jìn)行Pan-caspase、Caspase-8、Caspase-9和Caspase-3熒光染色。采用Promega(美國)公司生產(chǎn)的Pan-caspase原位熒光染色試劑盒進(jìn)行染色。用PZM-3將FITC-VAD-FMK稀釋至10μmol/L,囊胚在染色液中37℃避光孵育15 min后用PZM-3洗3遍,然后在熒光顯微鏡下觀察拍照。Caspase-8、Caspase-9和Caspase-3原位熒光染色參照對(duì)應(yīng)的說明書(BioVision,美國)進(jìn)行,用PZM-3進(jìn)行1∶300稀釋配成染色液,然后將囊胚移入染色液中37℃避光孵育15 min。用PZM-3洗3遍,置于熒光顯微鏡下觀察拍照。使用Image-Pro Plus 6.0軟件對(duì)熒光照片進(jìn)行量化并記錄熒光強(qiáng)度值,結(jié)果用熒光平均相對(duì)密度表示。每組重復(fù)3次,每次約25個(gè)囊胚。

        1.9 凋亡相關(guān)基因的表達(dá)檢測(cè)

        在冰上進(jìn)行RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng),同時(shí)要盡量減少操作時(shí)間。(1)總RNA提?。?組囊胚分別以150枚為一組進(jìn)行一次反應(yīng)。使用RNA prep Pure Micro Kit試劑盒(TIANGEN,中國)提取總RNA,得到的RNA溶液其OD260/OD280應(yīng)在1.9—2.1。(2)cDNA的制備:采用TIANGEN(中國)公司生產(chǎn)的Fast Quant RT Kit試劑盒,將抽提所得的RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄,獲得cDNA。從NCBI中獲得豬GAPDH、Caspase-8、Caspase-9、TNF-α、BCL-2、SOD-1的cDNA序列并設(shè)計(jì)引物,引物信息如表1所示。(3)實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Real-time RT-PCR);反應(yīng)體系為2μL cDNA、0.8μL引物、10μL SYBR Premix Ex Taq(TaKaRa,日本)、0.4μL ROX Reference DayⅡ(50X)、6μL ddH2O。每個(gè)反應(yīng)重復(fù)3次,在PCR儀(Biosystems7500 Fast Real-Time PCR System,美國)上進(jìn)行反應(yīng),反應(yīng)條件為95℃30 s,95℃5 s,60℃34 s,95℃15 s,60℃1 min,95℃15 s,60℃15 s,40個(gè)循環(huán),循環(huán)結(jié)束后完成溶解曲線圖。以GAPDH作為內(nèi)參基因,2-ΔΔCt為統(tǒng)計(jì)量比較組間差異。每組重復(fù)3次,每次150枚囊胚。

        表1 qRT-PCR所需基因引物信息Table 1 Information of primers for qRT-PCR

        1.10 數(shù)據(jù)分析

        采用SPSS 13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,每組至少重復(fù)3次。結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,P<0.05為差異顯著性標(biāo)準(zhǔn)。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 RES添加對(duì)豬卵母細(xì)胞孤雌激活胚胎體外發(fā)育能力的影響

        培養(yǎng)過程添加RES,豬卵母細(xì)胞孤雌激活卵裂率和囊胚率與新鮮組相比顯著增高(表2)。

        表2 RES添加對(duì)豬卵母細(xì)胞孤雌激活發(fā)育能力的影響Table 2 Effect of RES addition on developmental capacity of porcine parthenogenetic oocytes

        2.2 RES添加對(duì)豬孤雌激活囊胚凍后存活與發(fā)育的影響

        冷凍組和RES冷凍組囊胚解凍孵育24 h后囊胚腔恢復(fù)率和囊胚細(xì)胞數(shù)的結(jié)果如表3所示,RES冷凍組的囊胚腔恢復(fù)率和囊胚細(xì)胞數(shù)(35.09%,37.95±6.88)與冷凍組(31.25%,31.81±4.59)相比均顯著增高(P<0.05)。RES冷凍組的囊胚細(xì)胞數(shù)(37.95±6.88)比新鮮囊胚的囊胚細(xì)胞數(shù)(38.17±5.78)略低,差異不顯著(P>0.05)。圖1為解凍孵育24 h后各實(shí)驗(yàn)組的囊胚恢復(fù)照片。

        表3 RES添加對(duì)冷凍后囊胚腔恢復(fù)率和囊胚細(xì)胞數(shù)的影響Table 3 Effects of RES addition on blastocoel recovery rate and blastula’s cell num ber

        圖1 新鮮囊胚、冷凍解凍后孵育24 h囊胚和RES處理的冷凍解凍后孵育24 h囊胚(100×)Fig.1 Fresh blastulas,24 h incubated blastulas after freeze-thaw and 24 h incubated blastulas after freeze-thaw under RES treatment(100×)

        2.3 RES添加對(duì)豬孤雌激活囊胚凍后線粒體功能和凋亡水平的影響

        如表4和圖2所示,玻璃化冷凍后RES冷凍組囊胚的線粒體膜電位顯著高于冷凍組,但低于新鮮囊胚。經(jīng)過JC-1染色后新鮮囊胚顯示黃色或橘黃色,冷凍組囊胚顯示綠色,RES冷凍組囊胚顯示淡黃色。TUNEL染色檢測(cè)囊胚中細(xì)胞的凋亡水平發(fā)現(xiàn):添加RES后冷凍囊胚的細(xì)胞凋亡比例雖然高于新鮮囊胚,但是顯著低于未添加RES的冷凍組凋亡比例。

        表4 RES添加對(duì)冷凍后孤雌激活囊胚線粒體膜電位(ΔΨm)和凋亡水平的影響Table 4 Effects of RES addition on m itochondrialm embrane potential(ΔΨm)and apoptosis level of vitrified parthenogenetic blastulas

        圖2 三組囊胚(新鮮囊胚、冷凍囊胚和培養(yǎng)過程添加RES的冷凍囊胚)的JC-1染色(100×)Fig.2 JC-1 staining of fresh blastocysts,vitrified blastocysts and vitrified blastocystswith RES addition(100×)

        2.4 RES添加對(duì)冷凍后豬孤雌激活囊胚Pan-caspase、Caspase-8、Caspase-9、Caspase-3活性的影響

        3組囊胚分別經(jīng)多種Caspase原位熒光染色,結(jié)果如表5和圖3所示。RES冷凍組囊胚Pan-caspase、Caspase-8、Caspase-9、Caspase-3熒光強(qiáng)度值(表5)顯著低于冷凍組,但均高于新鮮囊胚。熒光強(qiáng)度越高,Caspase活性就越高。圖3中RES冷凍組囊胚熒光強(qiáng)度明顯低于冷凍組,但高于新鮮囊胚的熒光強(qiáng)度。

        表5 RES添加對(duì)冷凍后孤雌激活囊胚Caspase活性的影響Table 5 Effects of RES addition on caspase activities of vitrified parthenogenetic blastocysts

        圖3 新鮮囊胚、冷凍囊胚和RES處理的冷凍囊胚凋亡相關(guān)Caspase熒光強(qiáng)度的比較(100×)Fig.3 Comparison of caspase fluorescence intensities related to apoptosis of fresh blastulas,vitrified blastulas and vitrified blastulas w ith RES treatment(100×)

        2.5 RES添加對(duì)豬孤雌激活囊胚凍后基因表達(dá)的影響

        通過qRT-PCR對(duì)3組囊胚凋亡相關(guān)基因的mRNA表達(dá)水平進(jìn)行分析,結(jié)果如圖4所示,RES冷凍組Caspase-8、Caspase-9、TNF-α基因的表達(dá)量顯著低于冷凍組(4.80 vs.9.96,3.57 vs.10.29,4.09 vs.9.47;P<0.05),但均顯著高于新鮮組(1,1,1;P<0.05)。RES冷凍組BCL-2和SOD-1基因的表達(dá)量(0.72,071)與冷凍組(0.30,0.34)相比顯著升高(P<0.05),但均顯著低于新鮮組(1,1;P<0.05)。

        圖4 RES添加對(duì)冷凍后孤雌激活囊胚凋亡相關(guān)基因表達(dá)量的影響Fig.4 Effects of RES addition on expression levels of apoptosis-related genes from vitrified parthenogenetic blastulas

        3 討論

        眾所周知,玻璃化冷凍會(huì)造成胚胎的冷凍損傷和發(fā)育能力下降。研究發(fā)現(xiàn)RES具有一定的抗冷凍損傷的作用,Comizzoli等[7]在貓的卵母細(xì)胞冷凍中發(fā)現(xiàn)未成熟卵母細(xì)胞經(jīng)過RES處理后會(huì)顯著提高凍后胚胎的發(fā)育能力和胚胎質(zhì)量。Salzano等[8]在進(jìn)行牛胚胎冷凍時(shí)發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)過程中添加0.5μmol/L的RES能顯著增加凍后胚胎的發(fā)育率和孵化率。RES的生物學(xué)作用具有劑量依賴效應(yīng),高濃度和低濃度RES往往具有相反的生物學(xué)效應(yīng)[9-10]。Kwak等[11]在豬,Mukherjee等[12]在山羊和Abdel-Wahab等[6]在牛上的研究結(jié)果表明,RES的最佳工作濃度為2μmol/L。本研究結(jié)果與上述研究結(jié)果相似,在豬孤雌激活胚胎培養(yǎng)以及胚胎冷凍解凍后的孵育過程中添加2μmol/L RES,顯著提高了囊胚腔恢復(fù)率及囊胚細(xì)胞數(shù)。本研究結(jié)果進(jìn)一步說明了RES具有一定的抗冷凍損傷的能力。

        線粒體是細(xì)胞的能量工廠,在胚胎發(fā)育過程中具有重要作用。線粒體膜電位是線粒體功能的一個(gè)重要指標(biāo)。Dai等[13]在豬和Lei等[14]在鼠的卵母細(xì)胞冷凍時(shí)發(fā)現(xiàn)冷凍會(huì)造成線粒體膜電位下降。Sang等[15]在研究玉米烯酮誘導(dǎo)HEK293細(xì)胞毒性試驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)RES預(yù)處理后細(xì)胞中線粒體的膜電位高于未處理的細(xì)胞。Takeo等[16]在牛卵母細(xì)胞培養(yǎng)過程中添加RES后檢測(cè)線粒體膜電位,發(fā)現(xiàn)添加RES的卵母細(xì)胞線粒體膜電位顯著增高。與上述結(jié)果相似,本研究在進(jìn)行豬孤雌激活囊胚冷凍時(shí)發(fā)現(xiàn),添加RES后冷凍胚胎的線粒體膜電位顯著增高,由此推測(cè),RES能抵抗冷凍造成的線粒體膜電位的下降。

        多項(xiàng)研究證實(shí),玻璃化冷凍是造成細(xì)胞凋亡的原因之一。Wu等[17]和Inaba等[18]分別在玻璃化冷凍豬孤雌激活早期胚胎和牛胚胎時(shí)發(fā)現(xiàn),冷凍后其胚胎的細(xì)胞凋亡比例顯著增高。RES是芳烴受體拮抗劑,研究發(fā)現(xiàn)在雄性動(dòng)物中,RES能夠?qū)咕拥腄NA損傷和凋亡[19],在雌性哺乳動(dòng)物中,RES能延緩卵巢退化、抑制原始卵泡分化和凋亡、維持規(guī)律性的發(fā)情周期,推遲更年期[20]。Giaretta等[21]在豬卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)以及冷凍解凍過程中添加RES,發(fā)現(xiàn)RES能調(diào)節(jié)卵母細(xì)胞的凋亡程序,提高抵抗冷凍損傷的能力。本研究發(fā)現(xiàn)冷凍可導(dǎo)致豬孤雌激活囊胚細(xì)胞凋亡比例的顯著提高,RES的添加則可顯著降低其凋亡水平,該結(jié)果與上述研究相一致。然而也有不一樣的報(bào)道,Jeong等[22]在鼠的胚胎培養(yǎng)過程中添加0.5μmol/L的RES,發(fā)現(xiàn)RES會(huì)誘導(dǎo)2-細(xì)胞期胚胎的DNA損傷。不同的物種,不同的發(fā)育階段和不同的RES添加濃度可能導(dǎo)致了該結(jié)果的發(fā)生。

        細(xì)胞凋亡是由Caspase家族介導(dǎo)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)共同完成的,當(dāng)細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)各種Caspase的活性會(huì)顯著升高。在人卵母細(xì)胞慢速冷凍研究中發(fā)現(xiàn),凍后卵母細(xì)胞的Pan-caspase水平顯著升高[23]。在豬上,Vallorani等[24]利用Cryotop法對(duì)豬MII期卵母細(xì)胞進(jìn)行玻璃化冷凍,結(jié)果冷凍后的卵母細(xì)胞Pan-caspase水平也顯著提高。本試驗(yàn)與上述研究結(jié)果相似,冷凍解凍后囊胚的Pan-caspase水平顯著升高,表明冷凍可引起細(xì)胞凋亡。但是RES冷凍組的Pan-caspase水平雖然高于新鮮囊胚,但與未添加RES的冷凍囊胚相比顯著降低。由此推斷,胚胎培養(yǎng)以及冷凍解凍過程中添加RES可以通過降低Caspase活性而影響凍后囊胚的凋亡水平。

        SOD-1是銅鋅超氧化物歧化酶,其表達(dá)在一定程度上反應(yīng)了線粒體的功能,可清除因線粒體損傷而造成的氧化損傷,抑制線粒體途徑介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。Caspase-9是線粒體凋亡途徑的重要激發(fā)蛋白,Caspase-3是兩者共同作用途徑的執(zhí)行蛋白。本研究發(fā)現(xiàn)添加RES后冷凍囊胚的SOD-1表達(dá)水平比未添加組的冷凍囊胚顯著增高,而Caspase-3活性和Caspase-9表達(dá)水平顯著降低。由此說明RES能通過抑制線粒體內(nèi)源性凋亡途徑而降低冷凍囊胚的細(xì)胞凋亡。

        腫瘤壞死因子(TNF-α)是細(xì)胞凋亡死亡受體途徑中重要的細(xì)胞因子而Caspase-8是死亡受體途徑的重要激發(fā)蛋白。Etewa等[25]的研究表明,鼠血清中的TNF-α水平與細(xì)胞的凋亡程度相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)冷凍后的豬孤雌激活囊胚TNF-α、Caspase-8基因的表達(dá)量比新鮮囊胚顯著升高,這與Niu等[26]在豬卵母細(xì)胞上的研究結(jié)果相似。但在囊胚培養(yǎng)以及冷凍解凍過程中添加RES后TNF-α、Caspase-8基因的表達(dá)量會(huì)顯著降低。由此推斷,RES也能通過抑制死亡受體凋亡途徑而降低冷凍囊胚的細(xì)胞凋亡。

        眾所周知,BCL-2是凋亡抑制基因,具有抗凋亡和促進(jìn)細(xì)胞存活的能力。本研究發(fā)現(xiàn)冷凍后囊胚BCL-2表達(dá)量顯著降低,這與之前在小鼠[27]和人類[28]胚胎中的研究結(jié)果相似,說明凍后囊胚的BCL-2抗凋亡能力顯著下降。但是在添加RES的冷凍囊胚中其表達(dá)量比未添加RES的冷凍囊胚顯著升高。由此推測(cè),添加RES后能顯著提高抗凋亡基因BCL-2的表達(dá),抑制冷凍造成的囊胚細(xì)胞凋亡。

        4 結(jié)論

        在豬孤雌激活囊胚培養(yǎng)及冷凍解凍過程中添加2μmol/L的RES能顯著提高胚胎發(fā)育能力,抵抗冷凍造成的胚胎線粒體損傷以及抑制冷凍造成的線粒體途徑和死亡受體途徑引起的細(xì)胞凋亡。

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        (責(zé)任編輯:程智強(qiáng))

        Effect of resveratrol on freezing tolerance of porcine parthenogenetic blastulas

        CHEN Ya-ning1,2,3,WU Cai-feng2,3,ZHANG Shu-shan2,3,ZHANG De-fu2,3,DAIJian-jun2,3
        (1College of Fisheries and Life Science,Shanghai Ocean University,Shanghai201306,China;2Animal Husbandry and Veterinary Research Institute,Shanghai Academy of Agricultural Sciences,Shanghai201106,China;3Division of Animal Genetic Engineering,Shanghai Key Laboratory of Agri-Genetics and Breeding,Shanghai201106,China)

        In order to evaluate the freezing tolerance of porcine parthenogenetic blastulas as influenced by resveratrol(RES)treatment,2μmol/L RESwas added in the whole courses of oocyte in vitromaturation,freeze-thaw and embryo culture,and the mitochondrial membrane potentials of thawed porcine parthenogenetic blastulas,TUNEL apoptosis level,activities of several caspases,mRNA expression levels of genes related to apoptotic pathways and in vitro developmental capacity were investigated.The results showed that RES addition during in vitro maturation and embryo culture could significantly increase both cleavage and blastula rates(9518%vs.85.79%,51.85%vs.41.46%,P<0.05).RES addition significantly increased the freezing tolerance of porcine parthenogenetic blastulas,i.e.,the recovery rate of blastocoeles and the cell number of blastulas increased(35.09%vs.31.25%,37.95 vs.31.81,P<0.05),the mitochondrialmembrane potential improved(0.92 vs.0.46,P<0.05),the apoptosis rate decreased(8.24%vs.10.13%,P<0.05),thefluorescence intensities of Pan-caspase,Caspase-8,Caspase-9 and Caspase-3 and the expression levels of Caspase-8,Caspase-9 and TNF-αgenes decreased(P<0.05),and the expression level of Bcl-2 and SOD-1 genes increased(P<0.05).Compared with vitrified blastulas,the fresh blastulas were higher in the mitochondrialmembrane potentialand the expression levels of Bcl-2 and SOD-1 genes,and lower in the apoptosis rate and the fluorescence intensities of Pan-caspase,Caspase-3,Caspase-8,Caspase-9 as well as the expression levels of Caspase-8,Caspase-9,TNF-αgenes(P<0.05).Itwas concluded that RES addition could improve the mitochondrial function of vitrified porcine parthenogenetic blastulas,decrease their apoptosis level,and so enhance their freezing tolerance.

        Pig;Parthenogenetic activation;Blastulas;Mitochondria;Apoptosis;Vitrification;Resveratrol

        S828

        :A

        1000-3924(2017)02-096-08

        10.15955j.issn1000-3924.2017.02.18

        2016-11-02

        國家自然科學(xué)基金(31372315);國家轉(zhuǎn)基因生物新品種培育科技重大專項(xiàng)(2014ZX08006-005);上海市自然科學(xué)基金(15ZR1430100)

        陳亞寧(1990—),男,在讀碩士,主要從事動(dòng)物胚胎工程研究。E-mail:chenyaning1102@hotmail.com

        ,張德福E-mail:zhangdefuzd f@163.com;戴建軍E-mail:blackman0520@126.com

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