劉成倩，李 紅，易建中，孫曉云，2

（1上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，上海 201106；2上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306）

人工合成高效啟動(dòng)子用于基因治療及疫苗研制

劉成倩1，李 紅1，易建中1，孫曉云1，2

（1上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，上海 201106；2上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306）

為了制備可用于基因治療載體構(gòu)建及疫苗研制的啟動(dòng)子，根據(jù)高效啟動(dòng)子的特點(diǎn)，人工合成了一段特異啟動(dòng)子（SEP）序列，通過酶切連接將其插入到含有綠色熒光蛋白的pEGFP-C1載體內(nèi)，得到一新的啟動(dòng)子ESP，借助轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000將其和pEGFP-C1質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BHK21細(xì)胞，通過熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白表達(dá)情況。結(jié)果顯示：含有啟動(dòng)子ESP序列的pEGFP-ESP-C1熒光蛋白表達(dá)量明顯高于pEGFP-C1，而且表達(dá)穩(wěn)定。結(jié)果提示啟動(dòng)子ESP可以用于基因治療載體的構(gòu)建，將導(dǎo)入的基因在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)水平提高，為基因治療的最后成功打下基礎(chǔ)。

啟動(dòng)子；基因治療；疫苗研制

基因治療是指將外源正?；?qū)氚屑?xì)胞，以糾正或補(bǔ)償因基因缺陷和異常引起的疾病，達(dá)到治療目的的方法。它是伴隨著DNA重組技術(shù)的成熟而發(fā)展起來的，可以治療多種疾病，被譽(yù)為治療疾病的一種新手段。美國是最早嘗試進(jìn)行基因治療的國家，隨著1990年美國第一個(gè)臨床試驗(yàn)治療方案的批準(zhǔn)，其他國家也開始了基因治療的研究。在這些治療方案中，惡性腫瘤治療方案居多，還有心血管疾病、感染性疾病、神經(jīng)性疾病等。但是在眾多治療方案實(shí)施后發(fā)現(xiàn)有肯定療效者很少［1-2］，專家們提出，現(xiàn)在是基因治療回到基礎(chǔ)研究上來的時(shí)候了。

基因治療領(lǐng)域目前存在的主要問題是安全性和有效性。比如基因?qū)胂到y(tǒng)缺乏靶向性，這是基因治療有待解決的核心問題；還有導(dǎo)入基因的表達(dá)量太低，治療效果大打折扣，如果能將導(dǎo)入基因的表達(dá)量提高一倍甚至更多，則治療效果會(huì)大大提高［3-4］。自1995年以來，基因治療領(lǐng)域的學(xué)者們?cè)诟纳苹驅(qū)胂到y(tǒng)和載體方面做了很多的努力，新的技術(shù)和方法層出不窮［5］。目前在基因?qū)胼d體方面研究應(yīng)用較多的是病毒載體，然而基因治療成功的關(guān)鍵是載體攜帶目的基因的靶向高效表達(dá)［6］。隨著內(nèi)含子、增強(qiáng)子、特異的啟動(dòng)子等的發(fā)現(xiàn)，將會(huì)掀起基因治療新的熱潮。

本研究根據(jù)高效啟動(dòng)子的機(jī)構(gòu)特點(diǎn)，設(shè)計(jì)了一段特異啟動(dòng)子（SEP）序列，通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)新的啟動(dòng)子可以啟動(dòng)外源基因的高效表達(dá)，而且表達(dá)穩(wěn)定。此啟動(dòng)子可以用于基因治療載體的構(gòu)建，將導(dǎo)入的基因在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)水平提高，為基因治療的最后成功打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒、菌種及試劑

大腸埃希氏菌（E.coli）種TOP10、BHK21細(xì)胞和含有綠色熒光蛋白的pEGFP-C1質(zhì)粒，均由上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧所病毒課題組提供。小量質(zhì)粒抽提試劑盒購自上海嘉儀生物有限公司，轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000購自上海碩盟生物科技有限公司。

1.2 特異啟動(dòng)子SEP的合成

根據(jù)高效啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，設(shè)計(jì)了一對(duì)互補(bǔ)序列。標(biāo)記為SEP-F/R，5’和3’端均引入了酶切位點(diǎn)Nhe I。序列送往上海捷瑞生物工程有限公司合成。

1.3 增強(qiáng)啟動(dòng)子ESP的構(gòu)建

將合成好的SEP-F/R，各加入20μL ddH2O，用DNA寡核苷酸退火緩沖液進(jìn)行退火處理。

經(jīng)上述處理的SEP-F/R產(chǎn)物與pEGFP-C1質(zhì)粒分別用內(nèi)切酶Nhe I酶切，回收酶切后的目的片段，用T4連接酶連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli TOP10，篩選出的陽性克隆送北京六合華大基因上海分公司測序。通過測序驗(yàn)證將插入序列正確的克隆命名為pEGFP-ESP-C1。

1.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染試驗(yàn)

取出一瓶生長狀態(tài)良好的BHK21細(xì)胞，傳至24孔板中，轉(zhuǎn)染前確保每個(gè)孔內(nèi)貼壁細(xì)胞長至90%—95%。將質(zhì)粒及轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000按比例稀釋。質(zhì)粒pEGFP-C1和pEGFP-ESP-C1分別轉(zhuǎn)染0.25μg/孔，每個(gè)質(zhì)粒樣品設(shè)3個(gè)復(fù)孔。24 h后在熒光顯微鏡下觀察表達(dá)情況，并拍照。

1.5 綠色熒光蛋白GFP基因檢測

將轉(zhuǎn)染24 h的細(xì)胞取出，棄掉上清液，用PBS洗3次，加入100μL細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞。取出75μL用ModulusTM單管型多功能檢測儀檢測GFP熒光值。

1.6 W estern-blot分析

將1.5中的細(xì)胞裂解液跑SDS-PAGE電泳，按半干轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)PVDF膜，以抗GST標(biāo)簽鼠單克隆抗體為一抗孵育1.5 h，用PBST洗3次，每次5 min。再用HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG為二抗孵育1.5 h，用PBST洗3次，每次5 min，再用PBS洗1次。最后在暗室內(nèi)曝光顯影。

2 結(jié)果與分析

2.1 pEGFP-ESP-C1菌落PCR篩選結(jié)果

SEP基因PCR產(chǎn)物與pEGFP-C1酶切連接后，挑取2個(gè)單菌落進(jìn)行菌落PCR篩選，菌落PCR篩選結(jié)果見圖1。

2.2 pEGFP-ESP-C1測序結(jié)果

通過該序列結(jié)果可以看出，人工合成的特異啟動(dòng)子SEP已經(jīng)成功插入到質(zhì)粒pEGFP-C1 CMV啟動(dòng)子下游，得到一段689 bp新的增強(qiáng)啟動(dòng)子ESP，命名為pEGFP-ESP-C1。其序列如下：

2.3 熒光顯微鏡觀察結(jié)果

熒光顯微鏡下觀察可以發(fā)現(xiàn)：含有ESP啟動(dòng)子的綠色熒光較多，熒光蛋白表達(dá)量明顯高于只含CMV啟動(dòng)子的pEGFP-C1（圖2和3）。

圖2 質(zhì)粒pEGFP-C1轉(zhuǎn)染細(xì)胞熒光顯微鏡結(jié)果Fig.2 The fluorescencem icroscope observation of p lasm id pEGFP-C1 transfection cell

圖3 質(zhì)粒pEGFP-ESP-C1轉(zhuǎn)染細(xì)胞熒光顯微鏡結(jié)果Fig.3 The fluorescencem icroscope observation of p lasm id pEGFP-ESP-C1 transfection cell

2.4 綠色熒光蛋白GFP基因檢測

pEGFP-C1和pEGFP-ESP-C1轉(zhuǎn)染后表達(dá)細(xì)胞裂解液用Modulus TM單管型多功能檢測儀檢測的GFP熒光值分別為7 108.05和26 908.44。說明含有ESP啟動(dòng)子的pEGFP-ESP-C1熒光值明顯高于pEGFP-C1的熒光值，該結(jié)果和在熒光顯微鏡下觀察的結(jié)果明顯一致。

2.5 W estern-blot分析結(jié)果

裂解后的細(xì)胞經(jīng)SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)PVDF膜后，能與GST標(biāo)簽單克隆抗體發(fā)生特異性反應(yīng)，且GST蛋白表達(dá)量與2.3和2.4的結(jié)果一致（圖4）。

圖4 W estern-blot分析結(jié)果Fig.4 W estern-blot analysis results

3 討論

基因治療涉及靶基因、靶基因載體和靶基因的表達(dá)調(diào)控，其中靶基因載體的選擇是基因治療的關(guān)鍵之一［7］。目前，病毒載體主要用于基因治療，同樣對(duì)于疫苗的研制，表達(dá)載體的選擇也至關(guān)重要，特別是遇到一些基因不易于表達(dá)而且純化困難，直接導(dǎo)致疫苗的生產(chǎn)成本高［8-10］。相比于載體系統(tǒng)的選擇，治療基因或者目的基因的表達(dá)調(diào)控的研究較為滯后，所以新的方法能使外源基因的表達(dá)水平提高，不僅對(duì)基因治療有影響，而且對(duì)疫苗的研制也會(huì)帶來新突破。

本研究設(shè)計(jì)和合成的特異啟動(dòng)子，屬于首創(chuàng)。通過一系列試驗(yàn)也證明了該啟動(dòng)子可以啟動(dòng)外源基因的高效表達(dá)，而且表達(dá)穩(wěn)定。此研究成果對(duì)基因治療領(lǐng)域及疫苗研制方面都起到一定的推動(dòng)作用。

［1］GURA T H.After a setback，gene therapy progresses gingerly［J］.Science，2001，291（5509）：1692-1697.

［2］WANG G，DONG X Y，TIANW H，et al.Evaluation ofmiR-122-regulated suicide gene therapy for hepatocellular carcinoma in an orthotopic mousemodel［J］.Chinese Journal of Cancer Research，2013，25（6）：646-655.

［3］鄧洪新，田聆，魏子全.基因治療的發(fā)展現(xiàn)狀、問題和展望［J］.生命科學(xué)，2005，17（3）：196-199.

［4］林清凡，傅增順.基因治療的發(fā)展現(xiàn)狀與展望［J］.醫(yī)藥前沿，2012，2（3）：133-134.

［5］MAJHEN D，AMBRIOVIC-RISTOV A.Adenoviral vectors—How to use them in cancer gene therapy？［J］.Virus Res，2006，119（2）：121-133.

［6］王振發(fā)，王列，衛(wèi)立新.基因治療病毒載體的研究進(jìn)展［J］.醫(yī)學(xué)綜述，2007，13（7）：490-492.

［7］曹明媚，戚中田.基因治療載體的研究進(jìn)展［J］.國外醫(yī)學(xué)（腫瘤學(xué)分冊(cè)），2004，31（1）：22-26.

［8］劉成倩，王靜，李紅，等.雞干擾素-α基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建及高效表達(dá)［J］.中國畜牧獸醫(yī)，2014，41（4）：47-50.

［9］賀靈芝，曾慶友，許瑞安.基因治療中高分子載體的發(fā)展現(xiàn)狀［J］.高分子通報(bào)，2010（10）：46-52.

［10］LIAN M，WANG Q，F(xiàn)ANG J，et al.Antagonism between gene therapy and epigenetic therapy on human laryngeal carcinoma tumor-bearingmice［J］.Chinese Medical Journal，2013，126（2）：248-253.

（責(zé)任編輯：張睿）

Preparation of artificial synthetic promoter for gene therapy and vaccine development

LIU Cheng-qian1，LIHong1，YIJian-zhong1，SUN Xiao-yun1，2
（1Animal Husbandry and Veterinary Research Institute，Shanghai Academy of Agricultural Sciences，Shanghai 201106，China；2College of Fisheries and Life Science，ShanghaiOcean University，Shanghai201306，China）

A promoter was constructed by this experiment，which could be used for the construction of gene therapy vector and vaccine development.According to the characteristics of the promoter，a sequence of specific promoter（SEP）was synthesized，which was inserted into pEGFP-C1 containing green fluorescent protein.The pEGFP-C1 plasmid containing a new promoter ESP was transfected into BHK-21 cells，the green fluorescent protein expression was observed by using a fluorescence microscopy.The results showed that the protein expression of pEGFP-ESP-C1 was significantly higher than that of pEGFP-C1，and the expression was stability.The results indicated that the promoter ESP could be used in the construction of gene therapy vector，and the expression level of the gene transferred into the cellwas improved，which laid the foundation for the final success of gene therapy.

Promoter；Gene therapy；Vaccine development

S852.65；R392

：A

1000-3924（2017）02-085-04

10.15955j.issn1000-3924.2017.02.16

2016-06-06

上海市科學(xué)技術(shù)委員會(huì)重點(diǎn)科技攻關(guān)項(xiàng)目（12391901900）

劉成倩（1984—），女，碩士，助理研究員，主要從事動(dòng)物疾病的分子生物學(xué)及免疫學(xué)研究。E-mail：liuchengqian306＠sohu.com

，E-mail：lihong20061029＠163.com