蔡 璐,馬培杰,王小利,陳 瑩,陸瑞霞,王 茜

(1.貴州省生物技術(shù)研究所,貴州 貴陽 550006；2.貴州省草業(yè)研究所,貴州 貴陽 550006)

百脈根根際高效溶磷菌LC15的特性研究及菌株鑒定

蔡 璐1,馬培杰2,王小利2,陳 瑩2,陸瑞霞2,王 茜2

(1.貴州省生物技術(shù)研究所,貴州 貴陽 550006；2.貴州省草業(yè)研究所,貴州 貴陽 550006)

研究了分離自百脈根(Lotuscorniculatus) 根際的溶磷菌LC15，通過對其進行生理生化特性及16S rDNA序列分析表明，其菌株具有較強的溶解無機磷和有機磷的能力，且對無機磷的溶解能力更強，D/d比值均超過3.00；振蕩培養(yǎng)7 d后其可溶性磷含量高達400.49 mg/L，分泌總有機酸量30.67 mmol/L，且菌懸液pH 4.39呈酸性；革蘭氏染色呈陰性，在厭氧生長、V-P、檸檬酸鹽利用、ONPG測定、精氨酸雙水解酶等生理生化試驗中均呈陽性；經(jīng)BIOLOG測定，可利用碳源占95種供試碳源種類的54%；結(jié)合菌株16S rDNA序列同源性比對分析，初步鑒定為檸檬酸桿菌屬(Citrobctersp.)。

溶磷菌；百脈根；溶磷能力；16S rDNA

磷元素是促進植物生長及高產(chǎn)的必需營養(yǎng)元素，但由于其95%在土壤中易與Ca2+、Fe2+、Fe3+、Al3+等金屬陽離子結(jié)合形成閉蓄態(tài)難溶性磷酸鹽，進而難被植物吸收利用，成為影響植物生長發(fā)育的重要限制因素[1]。植物根際土壤中含有大量微生物，這些微生物在有機質(zhì)分解、養(yǎng)分循環(huán)和植物養(yǎng)分利用等過程中發(fā)揮著重要的作用。其中，能夠促進植物生長、防治病害、增加作物產(chǎn)量的微生物被稱為植物根際促生菌(PGPR)。溶磷菌作為PGPR家族中的一類重要成員，在將難溶性的磷酸鹽轉(zhuǎn)化為可溶態(tài)，進而供植物吸收利用方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[2]。因此，研究與應用土壤溶磷菌可以提高土壤中磷資源的利用，并通過研制開發(fā)微生物菌肥，促進植物對土壤有效磷的吸收，對我國農(nóng)業(yè)發(fā)展具有重大意義[3-4]。

百脈根(Lotuscorniculatus) 屬豆科百脈根屬多年生草本植物，又名鳥趾草、烏足豆和五葉草，原產(chǎn)于歐、亞溫暖地區(qū)，現(xiàn)世界各國廣泛栽培利用[5]。我國西北、華北、華南、西南等地均有分布，是溫暖濕潤地區(qū)極具潛力的優(yōu)良牧草[6]。在我國貴州黔中、黔西北地區(qū)，已成為栽培利用和草山改良的首選優(yōu)良豆科牧草。百脈根根系發(fā)達，側(cè)根著生根瘤，具有增加土壤有機質(zhì)和提高氮素吸收、改良土壤和增加土壤肥力等效果。且其營養(yǎng)豐富，耐寒、抗旱、耐澇、蟲害少、皂素含量低、適口性好、采食率高、家畜飼用安全[7-8]。也是研究生物固氮機理及牧草品質(zhì)改良的豆科模式植物[9-10]。

1 材料和方法

1.1 菌株來源

供試菌株分離自百脈根根際土壤，百脈根及土樣均采集于貴州省草業(yè)研究所獨山縣試驗地，菌株編號為LC15。

1.2 培養(yǎng)基及試劑

(1) LB液培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g，酵母粉5.0 g，NaCl 10.0 g，瓊脂15.0～20.0 g，蒸餾水定容至1 L，pH 7.0；(2) Pikovaslaia’s (PKO) 無機磷培養(yǎng)基：葡萄糖10.0 g，(NH4)2SO40.5 g，NaCl 0.2 g，KCl 0.2 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.003 g，MnSO4·4H2O 0.03 g，MgSO4·7H2O 0.1 g，Ca3(PO4)23.0 g，酵母粉0.5 g，瓊脂15.0～20.0 g，蒸餾水定容至1 L，pH 7.0；(3) 蒙金娜有機磷培養(yǎng)基[11]：葡糖糖10.0 g，(NH4)2SO40.5 g，NaCl 0.3 g，KCl 0.3 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.03 g，MnSO4·4H2O 0.03 g，Ca(CO3)25.0 g，酵母粉0.4 g，瓊脂15.0～20.0 g (液體培養(yǎng)基不加)，蛋黃卵磷脂0.2 g，蒸餾水定容至1 L，pH 7.0；(4) 無色氨酸King液體培養(yǎng)基[12]：蛋白胨20.0 g，甘油15 mL/L，K2HPO41.15 g，MgSO4·7H2O 1.5 g，蒸餾水定容至1 L，pH 6.8；(5) 無氮液體培養(yǎng)基(NFM)[13]：蘋果酸5.0 g，K2HPO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，CaCl2·2H2O 0.02 g，NaCl 0.1 g，NaMoO4·2H2O 0.002 g，溴麝香草酚藍(0.5%) 5 mL，KOH 4.5 g，維生素H 10 μg，蒸餾水定容至1 L，pH 7.0；(6) Spot比色液[14]：0.5 mol/L FeCl31 mL，10.8 mol/L濃硫酸30 mL，蒸餾水定容至50 mL；(7) S2 (Salkowski) 比色液體[14]：由FeCl34.5 g，10.8 mol/L濃硫酸定容至1 L。

1.3 溶磷能力的測定

(1) 定性測定采用溶磷圈法。將活化后的LC15菌株點接種于PKO無機磷及蒙金娜有機磷平板上，于28℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)5，10和15 d，觀察并測量菌株形成的溶磷圈大小。記錄并計算溶磷圈直徑(D) 和菌落直徑(d) 比值(D/d)；(2)定量測定采用鉬藍比色法。將50 mL液體PKO無機磷培養(yǎng)基裝入150 mL三角瓶，120℃滅菌20 min，冷卻后，將0.5 mL菌懸液(108cfu/mL) 接種至三角瓶中重復3次，以基礎(chǔ)培養(yǎng)基不接種菌株為對照。并將三角瓶置于28℃、150 r/min搖床培養(yǎng)7 d，用酸度計測定培養(yǎng)液pH。第8 d將培養(yǎng)液10 000 r/min、4℃離心10 min，取1 mL上清液測定有效磷增量。同時，取5 mL上清液，以酚酞為指示劑，用0.1 mol/L NaOH滴定，測定LC15菌株分泌的總有機酸量。

1.4 分泌IAA能力的測定

(1)定性判斷。將50 mL液體King培養(yǎng)基裝于150 mL三角瓶，120℃滅菌20 min，冷卻后將0.5 mL菌懸液(108cfu/mL) 接種至三角瓶中重復3次 ，以基礎(chǔ)培養(yǎng)基不接種菌株為對照。將三角瓶置于28℃，150 r/min搖床培養(yǎng)7 d，取菌株懸浮液1 mL滴置于檢測板上，加入等量Spot比色液，同時在比色液中加1 mL 50、30、10 mmol/L的植物生長激素(3-吲哚乙酸) 作對照；將檢測板置室溫下，在15 min內(nèi)觀察其顏色變化，顏色變粉紅者表示能分泌IAA，顏色越深表示分泌IAA能力越強；不變色為陰性，即不分泌IAA[15]。

(2)定量測定。將50 mL液體King培養(yǎng)基裝于150 mL三角瓶，120℃滅菌20 min，冷卻后將0.5 mL菌懸液(108cfu/mL) 接種至三角瓶中重復3次，以基礎(chǔ)培養(yǎng)基不接種菌株為對照。將三角瓶置于28℃，150 r/min搖床培養(yǎng)7 d，取菌株懸浮液1 mL滴置于檢測板上，加入等量S2比色液，在黑暗下靜置30 min后，迅速用波長530 nm紫外分光光度計測定OD值，根據(jù)標準曲線計算菌液中IAA含量，標準曲線采用純的3-吲哚乙酸制作。

1.5 酸堿性能的測定

將50 mL液體NFM培養(yǎng)基裝于150 mL三角瓶，120℃滅菌20 min，冷卻后將0.5 mL菌懸液(108cfu/mL) 接種至三角瓶中重復3次 ，以基礎(chǔ)培養(yǎng)基不接種菌株為對照。將三角瓶置于28℃，125 r/min恒溫搖床上振蕩培養(yǎng)72 h。隨后，觀察并記錄培養(yǎng)基顏色變化。

1.6 菌株的鑒定

(1) 菌落特征及生理生化特性參照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》及《伯杰氏細菌鑒定手冊》對菌株LC15的菌落特征及各項生理生化特性進行試驗鑒定[16-17]；(2)菌株的16S rDNA序列分析由寶生物(大連) 公司提供DNA基因組提取試劑盒提取菌株LC15基因組DNA。所用引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成，上游引物：5′-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；下游引物：5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′。25 μL PCR反應體系包括：10×buffer2.5 μL，dNTP Mixture (10 mmol/L) 2.0 μL，TaqDNA酶(2.5 U/μL) 0.25 μL，MgCl2(25 mmol/L) 5.0 μL，上游與下游引物(10 μmol/μL) 各1.0 μL，模板(20 ng/μL) 1.0 μL，ddH2017.25 μL。空白對照為含有除模板核算外的所有組分。反應條件：94℃ 5 min；94℃ 30 s，45℃ 30 s，72℃ 2 min，進行30個循環(huán)。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳，使用OMEGA BIO-TEK公司提供的Get Extraction Kit(50)D-2500-01試劑盒回收目的片段，以T載體法克隆PCR產(chǎn)物，將陽性克隆送上海英駿生物技術(shù)有限公司進行測序，測序結(jié)果在GenBank中的Blast數(shù)據(jù)庫進行同源性比對，最終，利用Clustal 1.8和Mega 4.0軟件繪制其系統(tǒng)進化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株LC15溶磷能力

2.1.1 菌株LC15溶磷能力的定性測定 將從百脈根根際分離到的20株溶磷菌在PKO無機磷固體培養(yǎng)基平板上涂板。經(jīng)篩選，得到一株具有較大溶磷圈的溶磷菌，標記為LC15。進一步將LC15用無菌牙簽分別點接種于PKO無機磷及蒙金娜有機磷平板上，于28℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)5，10和15 d。結(jié)果顯示，菌株LC15在蒙金娜有機磷培養(yǎng)基上的D/d比值隨培養(yǎng)天數(shù)的延長逐漸增加；而在PKO無機磷培養(yǎng)基上的D/d比值隨培養(yǎng)天數(shù)的延長逐漸下降，但其D/d比值均超過3.00。并且菌株LC15在PKO無機磷培養(yǎng)基上溶磷圈D/d比值始終高于在蒙金娜有機磷培養(yǎng)基上。菌株LC15具有較強的溶解無機磷及有機磷的能力，且其對無機磷的溶解能力更強(圖1)。

圖1 菌株LC15在培養(yǎng)基上溶磷圈的D/d比值Fig.1 Dynamic variation of phosphate-solubilizing zone D/d value of strain LC15 on PKO culture medium and Mengjinna culture medium,respectively

2.1.2 菌株LC15溶磷能力的定量測定 菌株LC15經(jīng)7 d振蕩培養(yǎng)后，定量測定其菌液中可溶性磷含量及pH。其可溶性磷含量高達400.49 mg/L，可見該溶磷菌在生長代謝過程中需要大量的磷素。同時，試驗測得菌液中總有機酸量高達30.67 mmol/L，且該菌懸液pH 4.39，與對照pH 7.00相比，下降超過2個單位，可見菌株LC15具有很強的溶磷能力，且其在溶磷過程中產(chǎn)生了大量的有機酸(表1)。

表1 菌株LB15溶磷能力及其相關(guān)特性Table 1 Phosphate-solubilizing ability and relevant characteristics of strain LC15

2.2 菌株LC15分泌IAA能力及酸堿性能

對菌株LC15分泌IAA能力的定性測定結(jié)果顯示，菌株LC15無明顯顯色反應(表2)。通?！?++”表示深粉紅色；“++”表示粉紅色；“+”表示淺粉紅色；“-”表示無色，且顯色程度與菌株分泌IAA能力正相關(guān)[15]。進一步定量測定結(jié)果與定性測定結(jié)果一致，檢測到菌株LC15分泌的IAA量為0。與多數(shù)植物根際微生物不同，百脈根根際溶磷菌LC15可能不具有分泌IAA的能力。菌株在NFM液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)72 h后，菌懸液顏色為綠色或草綠色，為中性菌株；變成黃色，表明其為產(chǎn)酸菌株；變成藍色為產(chǎn)堿菌株。菌株LC15使原本為綠色的菌懸液變成藍色(表2)，因此，確定該菌株為產(chǎn)堿菌株。

表2 菌株LC15分泌IAA及酸堿性能Table 2 The characteristics of IAA secretion and acid-base property from strain LC15

2.3 菌株鑒定

2.3.1 菌株LC15菌落形態(tài)及革蘭氏染色特征 將菌株LC15培養(yǎng)于LB固體培養(yǎng)基上，2 d后觀察其菌落形態(tài)學特征(圖2)。菌落大、表面光滑，不規(guī)則、呈淡白色、半透明、濕潤、中間凸起、邊緣整齊光滑。革蘭氏染色結(jié)果呈陰性，顯微鏡下觀察為桿狀。

2.3.2 菌株LC15生理生化特性 溶磷菌LC15厭氧生長、接觸酶、V-P、硝酸鹽還原、檸檬酸鹽利用、ONPG測定及精氨酸雙水解酶試驗結(jié)果均呈陽性；而氧化酶、吲哚、丙二酸利用、硫化氫、賴氨酸脫羧酶及鳥氨酸脫羧酶試驗結(jié)果均呈陰性。碳源利用試驗采用BIOLOG微生物全自動鑒定系統(tǒng)完成。試驗結(jié)果表明，菌株LC15可利用的碳源占95種供試碳源種類的54%(表3)。

表3 菌株LC15生理生化特性Table 3 The physiological-biochemical characteristics of strain LC15

注：“+”表示為陽性反應，“-”表示為陰性反應

參照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》及《伯杰氏細菌鑒定手冊》，菌株LC15理化特性與楊氏檸檬酸桿菌(Citrobacteryoungae) 最為相似。

圖2 菌株LC15在LB培養(yǎng)基上的菌落Fig.2 The colonyof strain LC15 on LB culture medium

2.3.3 菌株LC15的16S rDNA序列分析 菌株LC15的基因組DNA經(jīng)PCR擴增后的產(chǎn)物，由1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，最終獲得約1 500 bp大小的片段(圖3左)。隨后，將菌株DNA PCR擴增產(chǎn)物進行回收，再次經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測(圖3右)，回收產(chǎn)物條帶明亮，無雜帶，片段長度在1 500 bp左右。

將回收產(chǎn)物插入PMD18載體，重組質(zhì)粒DNA，并送交上海英駿生物技術(shù)有限公司進行正反向測序，最終序列長度為1 441 bp。將其序列輸入Genbank中Blast搜索相近序列進行同源性比對。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，菌株LC15的16S rDNA序列與多株檸檬酸菌屬(Citrobactersp.)、腸桿菌屬(Enterobactersp.) 及勒克氏菌屬(Leclerciasp.) 的16S rDNA核苷酸序列具有較高的同源性。其中與檸檬酸桿菌(Citrobactersp.) 菌株CH-65 (登錄號：KR149007) 及CH-51 (登錄號：KR148996) 的同源性分別為96.21%和96.35%，與阿氏腸桿菌(Enterobacterasburiae) 菌株DK20 (登錄號：JQ271799) 的同源性為97.23%，與非脫酸勒克氏桿菌(Leclerciaadecarboxylata) 菌株H3-31 (登錄號：KC252602) 的同源性為97.98%；而與泛菌屬(Pantoeasp.)和根瘤菌屬(Rhizobiumsp.) 的同源性相對較遠，約94%(圖4)。依據(jù)比對結(jié)果及菌株的主要生理生化特征，將菌株LC15初步歸屬為檸檬酸菌屬(Citrobactersp.) 細菌。

圖3 菌株LC15基因組PCR擴增電泳圖(左) 和PCR擴增產(chǎn)物回收電泳圖(右)Fig.3 The amplification of PCR (light) and recycled product of PCR(right) from strains LC15注：M:DNA Marker DL 2000;1:LC15)

圖4 基于菌株的16S rDNA序列同源性構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹Fig.4 The pbylogenetic tree based on 16S rDNA sequences homology of strains

3 討論

目前，測定溶磷微生物溶磷能力的方法有4種：一是采用固體平板溶磷圈法；二是對菌株進行液體培養(yǎng)，經(jīng)過一定時間的發(fā)酵培養(yǎng)，測定培養(yǎng)液上清液中所含的可溶性磷含量；三是同位素示蹤法；四是土培法，即測定土壤中有效磷含量[2]。其中前兩種方法被廣泛使用，分別在定性和定量的水平上測定了溶磷菌的溶磷能力[18,19]。已有研究報道，溶磷菌產(chǎn)生溶磷圈的大小與其分解無機磷能力的強弱有關(guān)，從而可初步判斷溶磷菌溶磷能力[20]。研究結(jié)果中，LC15在PKO無機磷培養(yǎng)基上溶磷圈D/d比值在5～15 d中均大于3.00 (圖1)，經(jīng)進一步定量分析，7 d振蕩培養(yǎng)后，菌液中可溶性磷含量高達400.49 mg/L，且呈酸性(表1)。這些酸性物質(zhì)的產(chǎn)生可能在LC15溶磷過程中發(fā)揮重要作用。已有研究報道，溶磷菌對難溶無機磷酸鹽的溶磷機理之一是菌體生長過程中分泌有機酸，溶磷菌能夠分泌甲酸、乳酸、葡萄糖酸、檸檬酸、丙酸、丁二酸等多種有機酸[21-22]，這些酸一方面使培養(yǎng)液的pH下降，另一方面還與Ca2+、Mg2+、Fe3+、Al3+等離子以多種形式結(jié)合，從而使難溶磷轉(zhuǎn)化為有效磷[23]。Park等[24]研究發(fā)現(xiàn)，溶磷菌通過釋放有機酸降低土壤pH，促進作物的生長。

除此之外，有研究者認為多數(shù)植物根際微生物具有分泌IAA的能力[25-26]，該過程不僅對植物有直接促生作用，如改變細胞內(nèi)環(huán)境、促進RNA及蛋白質(zhì)的合成，還可抑制幾丁質(zhì)酶等的活性，使有益細菌更易定殖于植物[27]。研究發(fā)現(xiàn)，與多數(shù)植物根際微生物不同，百脈根根際溶磷菌LC15可能不具有分泌IAA的能力，定量與定性測定結(jié)果均檢測到其分泌的IAA量為0 (表2)。與李顯剛等[27]研究結(jié)果相似，百脈根菌株LC15與葛藤菌株GTR15均為產(chǎn)堿菌株，可能與協(xié)調(diào)貴州偏酸性的黃壤土結(jié)構(gòu)有關(guān)。

研究中，碳源利用試驗采用BIOLOG微生物全自動鑒定系統(tǒng)完成。該系統(tǒng)利用細菌對95種不同碳源的代謝情況來鑒定菌種，即每種菌種形成各自特有的代謝指紋圖譜，選用四唑紫作為細菌能否利用供試碳源的指示劑，其中，碳源包括糖、醇、酸、胺、酯和大分子聚合物。該方法在于分析鑒定細菌代謝的氧化還原過程而不是他們的代謝副產(chǎn)物(如產(chǎn)酸、產(chǎn)氣)。試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，百脈根菌株LC15在95種供試碳源中，可利用的種類高達54%，可見，該菌株能夠利用多類碳源為自身生長提供能量，進而能夠在多種生境下發(fā)揮溶磷作用，適用性廣泛。

綜合生理生化特征及16S rDNA序列分析結(jié)果，研究的溶磷細菌LC15屬于目前全世界已知30屬89種溶磷微生物中的檸檬酸菌屬(Citrobactersp.) 細菌。通過對該菌株溶磷能力及生理生化特性的探討，為下一步研制高效生物菌肥奠定了基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

菌株LC15對磷酸鈣的溶磷量為400.49 mg/L，分泌總有機酸量30.67 mmol/L，其菌懸液呈明顯酸性(pH 4.39)，結(jié)合生理生化特征及16S rDNA序列分析為檸檬酸桿菌屬(Citrobactersp.)，是一株優(yōu)良的溶磷菌株。

[1] 王光華,周可琴,金劍.不同碳源對三種溶磷真菌溶解磷礦粉能力的影響[J].生態(tài)學雜志,2004,23(2):32-36.

[2] 李云海,孔維寶,達文燕,等.土壤溶磷微生物研究進展[J].生物學通報.2013,48(7):1-5.

[3] 馮月紅,姚拓,龍瑞軍.土壤解磷菌研究進展[J].草原與草坪,2003(1):3-7.

[4] Pérez E,Sulbarán M,Ball M M,etal.Isolation and characterization of mineral phosphate-solubilizing bacteria naturallycolonizing a limonitc crust in the south-eastern Venezuelanregion[J].Soil Biology and Biochemistry,2007,39(11):2905-2914.

[5] 孫艷香,楊紅梅,耿云紅,等.南開大學學報(自然科學版)[J].2006,39(2):51-57.

[6] 趙麗麗，陳超，王普昶.百脈根種子萌發(fā)期抗旱性綜合評價[J].貴州農(nóng)業(yè)科學，2012(9):50-56.

[7] Duke J A.Handbookof legumesof world economicimportance[M].London:Plenum Press,1981.

[8] 陳燕,李聰,蘇加楷.發(fā)根農(nóng)桿菌介導的百脈根的基因轉(zhuǎn)化[J].草地學報,1996,4(2):116-120.

[9] 佳耀林,馬誠.植物組織培養(yǎng)[M].北京:科學出版社,1985：101-107.

[10] 趙海明,孫桂枝,王學敏,等.百脈根種質(zhì)苗期抗旱性鑒定及綜合評價[J].草原與草坪，2011,31(6):18-26.[11] 林啟美,趙小蓉,孫炎鑫,等.四種不同生態(tài)系統(tǒng)中的解磷細菌數(shù)量及種群分布[J].土壤與環(huán)境,2000,9(1):34-37.

[12] 李玉娥,姚拓,榮良燕.溶磷菌溶磷和分泌IAA特性及對苜蓿生長的影響[J].草地學報,2010(1):84-88.

[13] Hafeez F Y,Malik K A.Manual on biofertilizertechnology[M].Pakistan:Nibge,2000:132-135.

[14] 姚拓.飼用燕麥和小麥根際促生菌特性研究及其生物菌肥初步研制[D].蘭州：甘肅農(nóng)業(yè)大學,2002.[15] 席琳喬,姚拓,楊俊基,等.聯(lián)合固氮菌株分泌能力及其對燕麥的促生效應測定[J].草原與草坪,2005(3):23-27.

[16] 東秀珠,蔡妙英.常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊[M].北京:科學出版社,2001.

[17] 中國科學院微生物研究所.伯杰氏細菌鑒定手冊[M].北京:科學出版社,1994.

[18] Morrison I M.Asemi-micro method from the determination of lignin and its use in predicting the digestibility of forage crops[J].J Sei Food Agric,1972,23:455-463.

[19] Rosas S B,Andrrs J A,Rovera M,etal.Phosphate-solubilizing Pseudomonas putidacan influence the rhizobia-legume symbiosis[J].Soil Biology and Biochemistry,2006,38:3502-3505.

[20] 李文紅,施積炎.西湖沉積物中解磷菌的分離純化及其解磷能力[J].應用生態(tài)學報,2006,17(11):2112-2116.

[21] Chen Y P,Renkha P D,Arun A B,etal.Phosphate solubilizing bacteria from subtropical soil and their tricalcium phosphate solubilizing abilities[J].Applied Soil Ecology,2006,34(1):33-41.

[22] Rodrguez H,Fraga R,Gonzalez T,etal.Genetics of phos-phatesolubilization and its potential applications for improving plant growth promoting bacteria[J].Plant Soil,2006,287:15-21.

[23] 舒健虹,王普昶,王小利,等.鴨茅根際溶磷菌溶磷性和分泌植物生長素能力的研究[J].草原與草坪,2012,32(6):23-30.

[24] Park J H,Bolan N,Megharaj M,etal.Isolation of phosphate solubilizing bacteria and their potential for lead immobilization in soil[J].Journal of Hazardous Materials,2011,185(2-3):829-836.

[25] Gibson A H.Genetic variation in the effectiveness of nodulation of Lucerne varieties[J].Aust J Agic Res,1962,13:388-399.

[26] 姚拓.高寒地區(qū)燕麥根際聯(lián)合固氮菌研究Ⅱ.固氮菌的溶磷性和分泌植物生長素特性測定[J].草業(yè)學報,2004,13(3):85-90.

[27] 李顯剛,姚拓,王小利,等.一株分離自葛藤根際高效溶磷細菌特性研究及菌株鑒定[J].中國土壤與肥料,2012(2):87-91.

Characteristics and identification of phosphate-solubilizing bacteria LC15 isolated from rhizosphere ofLotuscorniculatus

CAI Lu1,MA Pei-jie2,WANG Xiao-li2,CHEN Ying2,LU Rui-xia2,WANG Qian2

(1.GuizhouInstituteofPrataculture,Guiyang550006,China;2.GuizhouInstituteofBiologicalTechnology,Guiyang550006,China)

Phosphate-dissolving bacteria strain LC15 was isolated from the rhizosphere ofLotuscorniculatus,and the physiological and biochemical characters and 16S rDNA sequence were analyzed.The results showed that LC15 had the strong ability of dissolving both inorganic and organic phosphorus,especially for inorganic phosphorus (D/d values were over 3.00);After 7 days incubation,the release of maximal available soluble phosphorus and organic acid reached to 400.49 mg/L and 30.67 mmol/L,respectively;The bacterial suspension was significantly acid (pH 4.39);Based on different measures,including Gram stain negative,anaerobic growth,V-P,citrate utilization,ONPG,arginine dihydrolase,BIOLOG et al.,as well as 16S rDNA sequence analysis,the strain LC15 was identified asCitrobctersp..The strain has the great potential for developing the efficient microbial phosphate inoculant and microbial fertilizer.

phosphate-dissolving bacteria;Lotuscorniculatus;capacity of phosphate solubilization;16S rDNA

2016-04-05；

2016-10-25

貴州牧草根際溶磷菌庫建立與溶磷機理研究 (黔科合J字[2013]2152號)資助

蔡璐(1987-)，女，貴州貴陽人，助理研究員，從事生物技術(shù)研究工作。 E-mail：cys0801@163.com

S 541；S 144

A

1009-5500(2017)02-0029-06

王茜為通訊作者。