李玉姚, 孫銀星, 程 堅(jiān), 敖桂珍*

(1. 蘇州大學(xué) a. 藥學(xué)院; b. 神經(jīng)科學(xué)研究所，江蘇 蘇州 215123)

新型二硫雜環(huán)戊烯硫酮化合物的合成及其對(duì)谷氨酸誘導(dǎo)損傷HT22細(xì)胞的保護(hù)作用

李玉姚1a, 孫銀星1a, 程 堅(jiān)1b, 敖桂珍1a*

(1. 蘇州大學(xué) a. 藥學(xué)院; b. 神經(jīng)科學(xué)研究所，江蘇 蘇州 215123)

在保留ADT- OH的3H- 1,2- 二硫雜環(huán)戊烯- 3- 硫酮結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，用芳乙烯基替換4- 羥基苯環(huán)，設(shè)計(jì)并合成了6個(gè)二硫雜環(huán)戊烯硫酮化合物(L1～L6,其中L2, L3, L5和L6為新化合物)，其結(jié)構(gòu)經(jīng)1H NMR,13C NMR和HR- MS(ESI)表征。采用MTT法研究了L1～L6對(duì)谷氨酸誘導(dǎo)損傷的海馬神經(jīng)元HT22細(xì)胞的影響。藥理初篩結(jié)果表明:給藥濃度為10～100 μmol·L-1時(shí)，L1, L2, L4和L6均能提高受損HT22細(xì)胞的存活率(P<0.01)；給藥濃度為1 μmol·L-1時(shí)，L3和L5均可提高損傷HT22細(xì)胞的存活率(P<0.01)。

5- 對(duì)羥基苯基- 3H- 1,2- 二硫雜環(huán)戊烯- 3- 硫酮; H2S供體; 二硫雜環(huán)戊烯硫酮化合物; 合成; 神經(jīng)保護(hù)作用

1996年，Kimmura發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性H2S在大腦中扮演了神經(jīng)調(diào)質(zhì)的角色[1]。此后，諸多研究結(jié)果表明H2S對(duì)神經(jīng)調(diào)節(jié)具有多方面的生物效應(yīng)，如血管松弛[2]、心肌缺血損傷保護(hù)[3-4]及氧化應(yīng)激細(xì)胞保護(hù)等[5]。新型H2S供體的研究已成為化學(xué)與神經(jīng)學(xué)交叉學(xué)科的熱點(diǎn)之一[6]。H2S供體釋放H2S的機(jī)制多樣，其對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的影響也不同。選擇合適的H2S供體對(duì)準(zhǔn)確開展藥理機(jī)制的研究具有重要意義。

Scheme 1

5- 對(duì)羥基苯基- 3H- 1,2- 二硫雜環(huán)戊烯- 3- 硫酮(ADT- OH)為一種重要的硫化氫緩釋供體。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，ADT- OH能夠保護(hù)谷氨酸損傷的HT22海馬神經(jīng)元細(xì)胞[7]；抑制脂多糖誘導(dǎo)的BV2小膠質(zhì)細(xì)胞的炎癥應(yīng)答[8]；ADT- OH衍生物ADT在小鼠腦中動(dòng)脈堵塞模型上能減少腦梗死體積，保護(hù)血腦屏障[9]。在此基礎(chǔ)上，本文在保留ADT- OH的3H- 1,2- 二硫雜環(huán)戊烯- 3- 硫酮結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，用芳乙烯基替換ADT- OH的4- 羥基苯環(huán)，設(shè)計(jì)并合成了6個(gè)二硫雜環(huán)戊烯硫酮化合物(L1～L6, Scheme 1)，其中L2, L3, L5和L6為新化合物，其結(jié)構(gòu)經(jīng)1H NMR,13C NMR和HR- MS(ESI)表征。采用MTT法研究了L1～L6對(duì)谷氨酸誘導(dǎo)損傷的海馬神經(jīng)元HT22細(xì)胞的影響。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

XT- 5型顯微熔點(diǎn)儀(溫度未校正)；ABI Varian UNTIY INOVA 400 MHz型核磁共振儀(CDCl3為溶劑,TMS為內(nèi)標(biāo))；ALT Micromass TOF- MS型質(zhì)譜儀；Bio- Tek型酶標(biāo)儀。

5- 硫代- 5H- 1,2- 二硫雜環(huán)戊二烯- 3- 甲醛(5)按文獻(xiàn)[10]方法合成；RPMI- 1640培養(yǎng)基，MTT，Sigma公司；胰蛋白酶，吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司；其余所用試劑均為分析純。

1.2 合成

(1) 三苯基膦鹽(7)的合成

將6 4 mmol和三苯基膦1.049 g(4 mmol)加至乙腈(50 mL)中，回流反應(yīng)24～48 h。旋干得白色或淡黃色粉末狀固體7。

(2) L1～L6的合成(以L1為例)

將7 325 mg(0.75 mmol)和氫化鈉17 mg(0.7 mmol)加至無(wú)水THF(15 mL)中，氮?dú)獗Ｗo(hù)，攪拌下于0 ℃反應(yīng)1 h。加入5 80 mg(0.5 mmol)的無(wú)水THF(15 mL)溶液，反應(yīng)2 h。加水15 mL，用乙酸乙酯(3×30 mL)萃取，有機(jī)相減壓蒸干，殘余物經(jīng)硅膠柱層析(洗脫劑：石油醚/乙酸乙酯=10/1,V/V)純化得5- (2- 苯乙烯基)- 3H- 1,2- 二硫雜環(huán)戊二烯- 3- 硫酮(L1)。

用類似的方法合成L2～L6。

L1: 黃色固體，收率45%, m.p.117～120 ℃;1H NMRδ: 7.54(d,J=6.5 Hz, 2H, ArH), 7.45～7.40(m, 3H, ArH), 7.32(d,J=16.1 Hz, 1H, C=CH), 7.16(s, 1H, C=CH), 7.13(d,J=16.2 Hz, 1H, C=CH);13C NMRδ: 215.02, 169.78, 138.31, 137.61, 134.54, 130.45, 129.14, 127.76, 120.06; HR- MS(ESI)m/z: Calcd for C11H8S3{[M+H]+}236.986 6, found 236.986 9。

L2: 黃褐色固體，收率47%， m.p.207～210 ℃;1H NMRδ: 8.28(d,J=8.7 Hz, 2H, ArH), 7.70(d,J=8.8 Hz, 2H, ArH), 7.34(d,J=16.2 Hz, 1H, C=CH), 7.28(s, 1H, C=CH), 7.20(s, 1H, C=CH);13C NMRδ: 215.12, 167.58, 148.32, 140.59, 138.88, 134.92, 128.24, 124.42, 124.16; HR- MS(ESI)m/z: Calcd for C11H7NO2S3{[M+H]+}281.971 7, found 281.971 4。

L3: 黃色固體，收率51%， m.p.150～153 ℃;1H NMRδ: 7.48(d,J=8.5 Hz, 2H, ArH), 7.43(d,J=8.5 Hz, 2H, ArH), 7.30(d,J=16.1 Hz, 1H, C=CH), 7.15(s, 1H, C=CH), 7.10(d,J=16.1 Hz, 1H, C=CH), 1.34(s, 9H, CH3);13C NMRδ: 214.85, 170.22, 154.21, 138.29, 137.30, 131.80, 127.64, 126.12, 119.21, 34.96, 31.08; HR- MS(ESI)m/z: Calcd for C15H16S3{[M+H]+}293.049 2, found 293.048 6。

表1 L1～L6對(duì)谷氨酸誘導(dǎo)損傷的小鼠海馬神經(jīng)元HT22細(xì)胞的保護(hù)作用

*10 mmol·L-1;**P<0.01vsglutamate group。

L4: 黃褐色固體，收率46%， m.p.126～128 ℃;1H NMRδ: 7.44(d,J=8.1 Hz, 2H, ArH), 7.29(d,J=16.1 Hz, 1H, C=CH), 7.22(d,J=8.0 Hz, 2H, ArH), 7.15(s, 1H, C=CH), 7.09(d,J=16.1 Hz, 1H, C=CH), 2.39(s, 3H, CH3);13C NMRδ: 214.91, 170.20, 141.08, 138.43, 137.29, 131.85, 129.89, 127.78, 119.06, 29.69; HR- MS(ESI)m/z: Calcd for C12H10S3{[M+H]+}250.978 8, found 250.978 5。

L5: 黃色固體，收率42%， m.p.195～198 ℃;1H NMRδ: 8.10(d,J=8.2 Hz, 1H, ArH), 7.87(d,J=16.0 Hz, 1H, C=CH), 7.73～7.68(m, 2H, ArH), 7.61～7.56(m, 1H, ArH), 7.19(s, 1H, C=CH), 7.07(d,J=16.0 Hz, 1H, C=CH);13C NMRδ: 215.26, 168.02, 138.76, 133.78, 133.19, 130.69, 130.36, 128.84, 125.32, 124.65; HR- MS(ESI)m/z: Calcd for C11H7NO2S3{[M+H]+}281.971 7, found 281.972 1。

L6: 黃色固體，收率55%， m.p.178～181 ℃;1H NMRδ: 7.80(d,J=15.4 Hz, 1H, C=CH), 7.45(d,J=15.4 Hz, 1H, C=CH), 7.24(s, 1H, C=CH), 2.62(s, 3H, CH3), 2.55(s, 3H, CH3), 2.54(s, 3H, CH3);13C NMRδ: 215.17, 169.09, 152.65, 150.16, 148.65, 142.47, 138.44, 131.86, 124.61, 22.07, 21.74, 20.70; HR- MS(ESI)m/z: Calcd for C12H12N2S3{[M+H]+}281.024 1, found 281.024 2。

1.3 化合物對(duì)谷氨酸誘導(dǎo)的HT22細(xì)胞損傷的保護(hù)作用測(cè)定[7]

空白組只加培養(yǎng)基。谷氨酸組HT22細(xì)胞用10 mmol·L-1谷氨酸處理；樣品測(cè)試組用10 mmol·L-1谷氨酸和終濃度分別為1, 10, 50和100 μmol·L-1的受試化合物處理。用酶聯(lián)測(cè)試儀測(cè)定波長(zhǎng)570 nm處每孔的吸收度(OD值)，計(jì)算細(xì)胞存活率α(α=實(shí)驗(yàn)組平均OD值/空白組OD值×100%)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，采用SPSS進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

2 結(jié)果與討論

2.1 合成

合成L2時(shí)，最開始采用的是Knoevenagel縮合法，即2與對(duì)硝基苯甲醛在哌啶催化下，回流進(jìn)行縮合反應(yīng)。化合物經(jīng)1H NMR鑒定為L(zhǎng)2順反異構(gòu)體的混合物，M(反式) ∶M(順式)=3 ∶1，反應(yīng)產(chǎn)率也較低(<20%)。采用該方法合成其他目標(biāo)化合物時(shí)，立體選擇性也較差。最后改用Wittig縮合法，5與7反應(yīng)所得產(chǎn)物均為反式，立體選擇性較好。

2.2 化合物對(duì)谷氨酸誘導(dǎo)損傷的HT- 22細(xì)胞保護(hù)作用

表1為L(zhǎng)1～L6對(duì)谷氨酸誘導(dǎo)損傷的小鼠海馬神經(jīng)元HT22細(xì)胞的保護(hù)作用。由表1可見，空白對(duì)照組的細(xì)胞存活率為100%。 glutamate組的HT- 22細(xì)胞單獨(dú)經(jīng)10 mmol·L-1谷氨酸處理后，存活率<25%，說(shuō)明10 mmol·L-1谷氨酸已對(duì)HT- 22細(xì)胞造成了損傷。樣品組的HT- 22細(xì)胞經(jīng)10 mmol·L-1谷氨酸和不同濃度的目標(biāo)化合物處理后，細(xì)胞存活率均能夠明顯提高，說(shuō)明L1～L6可以保護(hù)谷氨酸誘導(dǎo)損傷的HT- 22神經(jīng)細(xì)胞。其中，L1, L2, L4和L6的給藥濃度為10～100 μmol·L-1時(shí)，均可提高受損HT22細(xì)胞的存活率(40.64%～79.57%)(P<0.01)，具有較好的神經(jīng)保護(hù)作用，但低于ADT- OH。 L5只在低濃度(1 μmol·L-1)時(shí)才表現(xiàn)出神經(jīng)保護(hù)作用，細(xì)胞存活率為35.38%(P<0.01)。 L3在用藥濃度為1 μmol·L-1時(shí)，HT22細(xì)胞存活率為56.57%，高于ADT- OH(33.42%),P<0.05，神經(jīng)保護(hù)作用較強(qiáng)。

合成了6個(gè)二硫雜環(huán)戊烯硫酮化合物(L1～L6,其中L2, L3, L5和L6為新化合物)。采用MTT法研究了L1～L6對(duì)谷氨酸誘導(dǎo)損傷的海馬神經(jīng)元HT22細(xì)胞的影響。藥理初篩結(jié)果表明:給藥濃度為10～100 μmol·L-1時(shí)，L1, L2, L4和L6均能提高受損HT22細(xì)胞的存活率(P<0.01)；給藥濃度為1 μmol·L-1時(shí)，L3和L5均可提高損傷HT22細(xì)胞的存活率(P<0.01)。 L1～L6具有較好的神經(jīng)保護(hù)作用，對(duì)神經(jīng)保護(hù)作用的研究具有一定意義。

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Synthesis of Novel 3H- 1,2- dithiole- 3- thione Compounds and Their Protective Effects on Glutamic Acid- induced Damage of HT22 Cells

LI Yu- yao1a, SUN Yin- xing1a, CHENG Jian1b, AO Gui- zhen1a*

(a. College of Pharmaceutical Science; b. Institute of Neuroscience, 1. Soochow University, Suzhou 215123, China)

The structure of ADT- OH was modified by replacing 4- OH phenyl with aryl vinyl, based on retaining its 3H- 1,2- dithiocyclopentene- 3- thione. Six 3H- 1,2- dithiole- 3- thione compounds(L1～L6) were designed and synthesized. Among them, L2, L3, L5and L6were novel compounds. The structures were characterized by1H NMR,13C NMR and HR- MS(ESI). Effects of L1～L6on glutamic acid- induced damage of HT22 cells were investigated by MTT method. The primary pharmacological results displayed that L1, L2, L4and L6significantly improved the survival rates of damaged HT22 cells at the concentration of 10～100 μmol·L-1(P<0.01), L3and L5increased the survival rates of damaged HT22 cells at the concentration of 1 μmol·L-1(P<0.01).

ADT- OH; hydrogen sulfide donor; 3H- 1,2- dithiole- 3- thione compound; synthesis; neuroprotection

2016- 11- 01；

2017- 01- 16

蘇州市科技計(jì)劃項(xiàng)目(N313202713)

李玉姚(1989-)，男，漢族，山東濰坊人，碩士研究生，主要從事藥物合成的研究。 E- mail: 18896587664@163.com

敖桂珍，副教授, E- mail: aoguizhen2007@sohu.com

O626.2

A

10.15952/j.cnki.cjsc.1005- 1511.2017.05.16278