嚴子祎，孫 琪，王 娜，楊 康，汪順偉，孫 夢，岳順利，孫中桐，周佳勃*

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江省動物細胞與遺傳工程重點實驗室，哈爾濱150030）

稀釋液中添加還原型谷胱甘肽對豬精液液態(tài)保存效果的影響

嚴子祎，孫 琪，王 娜，楊 康，汪順偉，孫 夢，岳順利，孫中桐，周佳勃*

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江省動物細胞與遺傳工程重點實驗室，哈爾濱150030）

為了研究還原型谷胱甘肽對豬精液液態(tài)保存效果的影響，實驗通過在稀釋液中分別添加不同濃度的還原型谷胱甘肽，研究了它對豬精液液態(tài)保存后的精子活力、頂體完整率、質(zhì)膜完整率、DNA損傷率、體外受精卵裂率及囊胚率等影響。結(jié)果表明，向稀釋液中添加1 mmol/L，5 mmol/L，10 mmol/L GSH均能顯著提高精子保存質(zhì)量。其中添加1 mmol/L還原型谷胱甘肽效果最好，10 mmol/L效果較差，但大部分指標仍顯著高于對照組。證實了稀釋液中添加還原型谷胱甘肽有助于提高液態(tài)保存豬精液的質(zhì)量。

豬精液；還原型谷胱甘肽(GSH)；人工授精

隨著家畜人工授精技術(shù)的廣泛應(yīng)用，精液保存技術(shù)越來越受重視。目前，豬的人工授精精液主要使用液態(tài)保存方法，與凍精相比能夠獲得較高的受精率，從而提高遺傳資源利用率。從液態(tài)保存效果來看，常溫保存更有利于豬的繁殖，能產(chǎn)生更大的經(jīng)濟效益[1]。

人們發(fā)現(xiàn)使用長效稀釋液的精液在保存期是無法避免受精能力降低的。精子線粒體代謝活性氧(ROS)，氧自由基會造成氧化損傷，這是受精能力下降的重要原因。因此在稀釋液中添加抵抗自由基的成分是十分必要的[2]。

由于物種和抗氧化劑作用機理的不同，抗氧化劑在精液冷凍保存中的添加量和作用效果不盡相同。根據(jù)抗氧化劑化學(xué)性質(zhì)和作用機理可以分為維生素、酶類等幾種。

谷胱甘肽屬于非蛋白類巰基化合物，在哺乳動物細胞中發(fā)揮著重要的生物學(xué)活性作用[3]。谷胱甘肽在細胞外源性和內(nèi)源性化合物的解毒和抗氧化作用、細胞增殖、氨基酸轉(zhuǎn)運、蛋白質(zhì)和DNA合成、二硫化物及其它化學(xué)中起著重要的作用，同時還維持著細胞內(nèi)氧化還原反應(yīng)的正常進行。它是機體內(nèi)最主要的非蛋白巰基化合物。豬精子質(zhì)膜含有大量的不飽和脂肪酸，從而為精卵結(jié)合提供必要的條件。ROS可以導(dǎo)致精子細胞質(zhì)膜的脂類物質(zhì)發(fā)生過氧化，質(zhì)膜不可逆地喪失流動性，造成精子質(zhì)膜損傷，因而造成細胞內(nèi)酶缺失，還會引起DNA損傷。精液中消除自由基的非酶系統(tǒng)主要物質(zhì)就是谷胱甘肽。GSH廣泛分布于活細胞中，它可與ROS發(fā)生反應(yīng)，并作為谷胱甘肽過氧化物酶的輔助因子催化減少過氧化氫[4]。大量證據(jù)表明，精子中也存在GSH，但其濃度卻存在種屬差異。豬和兔精子中GSH的含量非常低，分別為0.3 nmol/109個精子及0.1 nmol/109個精子。但是豬的精液中存在較高水平的谷胱甘肽[5]。由于豬精液在液態(tài)保存過程需要稀釋，谷胱甘肽的濃度會發(fā)生變化，所以弄清楚最佳谷胱甘肽濃度對于改進液態(tài)保存液的配方，提高人工授精效率有重要意義。

1 材料

1.1 實驗動物

實驗公豬為東北農(nóng)業(yè)大學(xué)實驗基地的36月齡健康可育的公豬。公豬在標準化的管理條件下根據(jù)標準化的飼喂程序飼養(yǎng)。所有試劑除非特殊說明均為Sigma公司出品并嚴格按照使用說明使用。

1.2 主要試劑

稀釋液、卵母細胞成熟液、受精液和胚胎培養(yǎng)液的配制參見文獻[2]。還原型谷胱甘肽等所有藥品均來源于Sigma公司。

1.3 主要儀器

倒置熒光顯微鏡，熒光顯微系統(tǒng)由Olympus（日本）生產(chǎn)。恒溫精子保存箱由余姚市福瑞杰電器廠（中國）生產(chǎn)。醫(yī)用超凈臺由蘇州凈化儀器有限公司生產(chǎn)。高壓濕熱滅菌鍋MLS-3020由SANYO公司生產(chǎn)。

2 方法

2.1 精液采集與處理

公豬經(jīng)過人工方法采集精液。采集精液后用保溫瓶在50 min內(nèi)運回實驗室。當(dāng)精子活力不低于0.7的情況下方能進行實驗。將來自3～5頭公豬的精液經(jīng)過混合用于實驗。取回的豬精液加入等體積的稀釋液中混勻，30℃、150 g離心7 min。離心后去上清，用保存液1∶10稀釋下層精子塊，2 ml凍存管分裝，每管分裝1.8 ml稀釋液，精子終密度約為4×107個/ml。

2.2 精液的降溫與保存

裝入凍存管中的精液放入30℃含有100 ml水的200 ml燒杯中，并將燒杯放入17℃恒溫箱內(nèi)降溫保存。將分裝有精子的保存稀釋液凍存管插在泡沫漂浮板上，之后把泡沫漂浮板放到裝有30℃水的200 ml燒杯中，確定保存稀釋液液面在水面以下，放入17℃恒溫箱中儲存，150 min后取出200 ml燒杯，每8 h上下輕輕搖晃凍存管，避免精子沉淀。

2.3 精子質(zhì)量檢測

先將凍存管中精液振蕩混勻，然后再從小瓶中吸取50 μl的精液，檢測精子活力、質(zhì)膜及頂體完整率。每天檢查一次，共計10 d。

精子活力的檢測。取50μl精液用1 ml稀釋液稀釋，在37℃下培養(yǎng)20 min。然后取20μl滴到37℃預(yù)熱的血球計數(shù)板上，蓋上蓋玻片，在40倍相差顯微鏡下觀察，計算精子活力。

精子頂體狀態(tài)檢測。頂體完整性采用考馬斯亮藍染色方法檢測：將50μl的精液加入到1 ml的PBS鹽溶液中，迅速混合然后2 000 g離心5 min。沉淀物加入1 mL多聚甲醛溶液重懸固定30 min。2 000 g離心5 min，使用PBS重懸，平鋪在載玻片上，室溫下干燥。將載玻片在考馬斯亮藍G-250中處理5 min，使用蒸餾水清洗掉多余染劑。室溫下干燥，相差顯微鏡下觀察頂體完整性。

精子質(zhì)膜的完整性檢測。采用低滲腫脹法檢測。從各實驗組的精液振蕩混勻取出50μl，放入37℃ 1 ml 低滲液中，混勻，30 min后取出20 μl滴在干凈的血球計數(shù)板上，40倍相差顯微鏡下觀察5個視野，計算質(zhì)膜完整（腫脹和彎尾精子）的百分率。

精子DNA狀態(tài)檢測。進行彗星電泳法檢測精子DNA狀態(tài)。按照文獻[2]的方法進行，計算DNA發(fā)生斷裂的精子比例。

精子體外受精能力檢測。按照文獻[2]的方法進行，取出成熟培養(yǎng)42～44 h的卵母細胞，去卵丘細胞。挑選胞質(zhì)飽滿均勻，有極體的卵母細胞移入預(yù)平衡過的受精液中洗3～5次。然后移入到50 μl受精滴中，加入50μl精液，在39℃、5% CO2培養(yǎng)箱中共同孵育6 h。將共孵育6 h的卵母細胞在胚胎培養(yǎng)液(PZM-3)中洗滌3～5次，移入平衡過的500 μl胚胎培養(yǎng)液中培養(yǎng)。培養(yǎng)24～48 h檢查卵裂率，培養(yǎng)6～7 d檢查囊胚率。2.4 統(tǒng)計分析

用SPSS13.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)經(jīng)過LSD轉(zhuǎn)變后用ANOVA模塊進行分析，P<0.05認為差異顯著，所有實驗均至少重復(fù)3次。

3 結(jié)果與分析

3.1 添加不同濃度谷胱甘肽對精子活力的影響

表2 添加不同濃度還原型谷胱甘肽對精子頂體完整率的影響Table 2 Effects of supplemented with different concentrations reduced glutathione on percentages of acrosome-integrated sperm

表1 添加不同濃度還原型谷胱甘肽對精子活力的影響Table 1 Effects of supplemented with different concentrations reduced glutathione on sperm motility

（相同符號之間差異不顯著，p＞0．05）

3.2 稀稀釋液中添加不同濃度谷胱甘肽對精子頂體完整率的影響

（相同符號之間差異不顯著，p＞0．05）

由表2可知，添加GSH保存10 d后頂體完整率仍維持在60%以上，頂體完整率下降趨勢并未像活力下降一樣明顯。其中添加1 mmol/L效果最好，與添加5 mmol/L、10 mmol/L組別差異不顯著。

3.3 稀釋液中添加不同濃度還原型谷胱甘肽對精子質(zhì)膜完整性的影響。

由表3可知，添加1 mmol/L、5 mmol/L GSH均能顯著提高精子質(zhì)膜的完整率，保存8 d后仍能維持60%，二者差異不顯著，但1 mmol/L效果更好。添加10 mmol/L GSH結(jié)果略好于對照組，但差異不顯著。

表3 添加不同濃度還原型谷胱甘肽對精子質(zhì)膜完整性的影響Table 3 Effects of supplemented with different concentrations GSH on percentages of sperm tail coiling

（相同符號之間差異不顯著，p＞0．05） 3.4 稀釋液中添加不同濃度還原型谷胱甘肽對精子DNA損傷率的影響

煤礦地面主要通風(fēng)機是礦井通風(fēng)系統(tǒng)的心臟，為地面新鮮空氣源源不斷地進入井下，到達用風(fēng)地點及排出地面提供動力，礦井主要通風(fēng)機性能測試是保障通風(fēng)機安全運行的必要條件之一。為了確保礦井主要通風(fēng)機的安全穩(wěn)定運行，《煤礦安全規(guī)程》規(guī)定煤礦新安裝的主要通風(fēng)機在投入使用前需要進行1次通風(fēng)機性能測試，以后每5年至少進行1次風(fēng)機性能測試[1]，礦井通風(fēng)機性能測試工作中最為重要的就是風(fēng)機風(fēng)量測試工作，目前常用的風(fēng)量測量方法有靜壓差法和動壓法。

表4 添加不同濃度還原型谷胱甘肽對精子DNA損傷率的影響Table 4 Effects of supplemented with different concentrations reduced glutathione on percentages of sperm DNA damage

由表4可知，添加1 mmol/L、5 mmol/L GSH均能顯著降低精子DNA損傷率，二者差異在前6 d不顯著，其中1 mmol/L效果略好。添加10 mmol/L GSH則與對照組無顯著差異。

3.5 稀釋液中添加不同濃度還原型谷胱甘肽對卵裂率和囊胚率的影響

表5 添加不同濃度谷胱甘肽對卵裂率和囊胚率的影響Table 5 Effects of supplemented with different concentrations reduced glutathione on rates of cleavage and blastocyst

由表5可知，各組別在前4 d卵裂率和囊胚率均無顯著差異。添加1 mmol/L、5 mmol/L GSH均能較好地維持精子體外受精后的卵裂率和囊胚率，前者效果稍好于后者。10 mmol/L與對照組無顯著差異。

4 討論

谷胱甘肽廣泛分布于活細胞中，它可與ROS發(fā)生反應(yīng)，并作為谷胱甘肽過氧化物酶的輔助因子催化減少過氧化氫[2]。大量研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，精子中存在GSH，但其濃度因物種不同而存在差異[6]。

本試驗在常溫保存稀釋液中添加還原型GSH，以期得到保護豬精子的作用。結(jié)果顯示，向稀釋液中添加1 mmol/L、5 mmol/L、10 mmol/L還原型GSH均能提高精子活力、頂體完整率、質(zhì)膜完整率、卵裂率和囊胚率。而且精子在10 d后活力依然能維持在30%以上，也就是仍具備人工授精的條件。并且添加GSH同樣降低了精子的DNA損傷率。其中添加1 mmol/L GSH效果最佳，這可能由于GSH是GPX和GR系統(tǒng)的輔助因子，能夠調(diào)節(jié)酶的活性，保護精子膜上多不飽和脂肪酸免受氧化，在抵抗脂質(zhì)過氧化中起到了重要作用。Gadea J等和Donelly ET等則發(fā)現(xiàn)GSH能夠提高山羊和人精子活力，保護精子DNA免受ROS損傷[7,8]。有報道發(fā)現(xiàn)，一定濃度的GSH能夠提高人精子體外受精能力，并能保護DNA鏈的完整性[9]。這些研究結(jié)果以及我們的實驗結(jié)果都可以說明，在豬精子常溫保存方面，還原型GSH能夠具有同樣的功能。另外，添加10 mmol/L 還原型GSH雖然提高了精子保存的各項指標，但在精子質(zhì)膜完整率、DNA損傷率和體外受精率沒有顯著提高。說明即使添加高濃度的還原型GSH并不能夠進一步提高精液保存效果。

本實驗通過研究還原性谷胱甘肽對豬精液液態(tài)保存效果的影響，發(fā)現(xiàn)添加1 mmol/L的還原型GSH有助于維持豬精液的還原狀態(tài)，減輕自由基對精子的損傷，還能夠提高精子的受精能力。這些結(jié)果對于豬精液液態(tài)保存和保存液研發(fā)具有指導(dǎo)性意義。

[ 1 ]張春龍, 周佳勃,岳順利，等． 添加N-乙酰半胱氨酸對豬精子常溫保存的影響[J]． 黑龍江畜牧獸醫(yī),2016, 85-87．

[ 2 ]孫琪． 不同抗氧化劑對豬精液常溫保存的影響[D]． 東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 碩士學(xué)位論文， 2004

[ 3 ]Kovacs-Nolan J, Rupa P, Matsui T, et al． In vitro and exvivo uptake of glutathione (GSH) aczross the intestinal epithelium and fate of oral GSH after in vivo supplementation[J]． J Agric Food Chem． 2014,62(39):9499-9506．

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S828.3

A

1005-2739（2017）03-0006-05

2017-01-13

國家自然科學(xué)基金項目（編號:31372-311）；東北農(nóng)業(yè)大學(xué)人才基金項目（編號:2012RCB18; 2012RCA03）；哈爾濱市科技創(chuàng)新人才項目（編號:2013R FLXJ005）

嚴子祎(1996 － ) ，女，本科。

E-mail:1027664580@qq．com

周佳勃(1974－) ，博士，副教授。

E-mail: chowjb@163．com