郭巍，強亞勇，賀曉龍，汪峰，張斌斌，馬亞東

(延安大學附屬醫(yī)院泌尿外科，延安 716000)

·基礎研究·

姜黃素聯(lián)合順鉑對人前列腺癌PC-3細胞株的影響

郭巍，強亞勇，賀曉龍，汪峰，張斌斌，馬亞東

(延安大學附屬醫(yī)院泌尿外科，延安 716000)

目的 觀察姜黃素聯(lián)合順鉑(DDP)對人前列腺癌PC-3細胞株抗腫瘤活性作用的影響，并探討其作用機制。方法 采用MTT法檢測姜黃素單獨或聯(lián)合順鉑對人前列腺癌PC-3細胞株的抑制率；采用流式細胞術檢測不同濃度姜黃素和順鉑單藥、聯(lián)合處理后對人前列腺癌PC-3細胞株凋亡率變化；RT-PCR檢測姜黃素單獨或聯(lián)合順鉑對人前列腺癌PC-3細胞株作用后P53的mRNA蛋白表達。結(jié)果 不同濃度的姜黃素組隨著藥物濃度增加、作用時間延長，細胞抑制率上升，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；聯(lián)合用藥組明顯高于單一用藥組(P<0.05)，兩藥聯(lián)合具有協(xié)同作用；姜黃素和順鉑均促進人前列腺癌PC-3細胞株凋亡，聯(lián)合用藥可顯著增加凋亡率；RT-PCR結(jié)果顯示聯(lián)合用藥組能使P53 mRNA蛋白表達水平較單藥組上升。結(jié)論 姜黃素對人前列腺癌PC-3細胞株具有生長抑制作用，且具有劑量和時間依賴性，其與順鉑聯(lián)合具有協(xié)同抑制作用，其協(xié)同作用可能與上調(diào)P53 mRNA表達有關。

前列腺腫瘤；順鉑；姜黃素；細胞凋亡

前列腺癌于60歲開始出現(xiàn)發(fā)病高峰，而我國人口老齡化持續(xù)增長與代謝綜合征異常(肥胖、高血糖、高血壓等)兩大因素導致在未來的10年內(nèi)前列腺癌的發(fā)病率將逐步升高[1-2]。前列腺癌患者的生存率與疾病的臨床分期和治療方法有關，在我國，初診前列腺癌的患者僅有1/3為局限性病變[3]，造成手術治愈率不高。順鉑(DDP)是傳統(tǒng)抗腫瘤藥物，抗癌作用強但不良反應明顯，易出現(xiàn)耐藥性。尋找到毒性低、抗癌作用強，并能與傳統(tǒng)抗腫瘤藥物起到協(xié)同作用的藥物，在治療前列腺癌發(fā)面具有良好的前景。

1 材料與方法

1.1 材料 人前列腺癌PC-3細胞株購自上海拜力生物公司。RPMI-1640培養(yǎng)基與胎牛血清購自GIBCO公司，姜黃素、MTT、DMSO及PI購自美國Sigma公司，Trizol與AnnexinV FITC細胞凋亡檢測試劑盒購自南京凱基生物公司，P53引物由北京三博遠志生物公司設計合成。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及實驗分組 人前列腺癌PC-3細胞用RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，培養(yǎng)液中加10%胎牛血清、100 μg/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞貼壁后實驗分組：(1)對照組：加5%血清培養(yǎng)液(2)單藥實驗組：姜黃素的濃度分別為5.0、10.0、20.0、40.0 μmol/L，DDP的濃度分別為0.5、1、2、4 μg/mL。(3)聯(lián)合組：姜黃素濃度為2.5 μmol/L不變，聯(lián)合單藥濃度DDP。(4)空白組：在無細胞的孔中加5%培養(yǎng)液。實驗組每個濃度設5個平行孔，溫育24 h、48 h。

1.2.2 MTT法 用0.25%胰蛋白酶消化對數(shù)生長期的人前列腺癌PC-3細胞，以每孔為3×103個細胞接種于96孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)24 h后分組。每孔加入濃度為5 mg/mL MTT溶液20 μL，培養(yǎng)4 h。吸凈上清液，每孔加DMSO 150 μL振蕩10 min，使用酶標儀測定波長為490 nm處的吸光度值，空白組調(diào)零。細胞增殖抑制率(%)=(對照組OD值-實驗組OD值)/對照組OD值×100%。采用金正均法判斷聯(lián)合用藥是否具有協(xié)同作用，公式：q=(Ea+b)〔Ea+(1-Ea)/Eb〕。公式中(Ea+b)為聯(lián)合用藥的抑制率，Ea、Eb分別為DDP和姜黃素單藥的抑制率。q=0.85-1.15表示兩藥作用相加，q<0.85表示兩藥有拮抗作用，q>1.15表示兩藥有協(xié)同作用。

1.2.3 流式細胞儀檢測細胞凋亡率 將PC-3細胞制成細胞懸液以2×105mL-1的密度接種6孔板內(nèi)并分4組，對照組加5%血清培養(yǎng)液，實驗組為姜黃素組(5.0 μmol/L)、DDP組(1.0 μg/mL)及姜黃素與DDP聯(lián)合組。藥物作用48 h后收集細胞，嚴格遵守凋亡檢測試劑盒內(nèi)染色步驟染色，于流式細胞儀上檢測并計算細胞凋亡率。

1.2.4 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(RT-PCR) 按照Trizol試劑盒說明書操作抽提實驗組處理48 h的PC-3細胞總RNA,并合成cDNA于-80 ℃保存。按照RT-PCR試劑盒步驟操作并分析相對含量值。P53蛋白相對定量值為P53與β-actin灰度值的比值。引物序列、大小及退火溫度見表1。

表1 被檢測基因所使用的引物序列

2 結(jié)果

2.1 MTT實驗結(jié)果 與對照組相比，不同濃度的姜黃素、DDP對PC-3細胞作用24 h、48 h后均有抑制作用，PC-3細胞生長抑制作用隨著姜黃素、順鉑藥物濃度增加，作用時間延長，其產(chǎn)生的抑制作用越明顯，呈現(xiàn)出時間、劑量依賴性關系。不同濃度組、不同時間組之間抑制率相比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表2。5.0 μmol/L 的姜黃素與不同濃度的DDP聯(lián)用均對PC-3細胞的增值有抑制作用，其聯(lián)合用藥組抑制作用明顯強于單藥組(P<0.01)，按照聯(lián)合用藥公式推算，姜黃素與DDP聯(lián)合q均大于1.14，兩者之間呈協(xié)同作用。

表2 不同濃度的姜黃素和順鉑對PC-3細胞生長的 抑制率

注：與對照組比較，aP<0.05；同一試劑濃度內(nèi)，與24 h時比較，bP<0.05

2.2 流式細胞儀檢測細胞凋亡率 流式細胞儀結(jié)果顯示，對照組PC-3細胞凋亡率為1.53%；姜黃素組、DDP組單藥作用PC-3細胞24 h的凋亡率分別為5.45%、9.66%(P<0.05)；而姜黃素 5.0 μmol/L與DDP 1.0 μmol/L 聯(lián)合作用24 h的凋亡率明顯升高，為28.39%(P<0.05)。聯(lián)合用藥后，可形成明顯的凋亡峰，顯著高于單藥組，表明姜黃素、DDP均可以有效誘導PC-3的凋亡率，在PC-3細胞中姜黃素與DDP存在協(xié)同作用。

2.3 RT-PCR檢測P53的mRNA表達 姜黃素誘導PC-3細胞48 h后，P53蛋白對照組、姜黃素單藥組、DDP單藥組與聯(lián)合組的相對定量值為0.204、0.342、0.350和0.598。聯(lián)合組與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，單藥組與對照組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。提示姜黃素與順鉑聯(lián)合能一定程度上能上調(diào)P53基因mRNA表達。

3 討論

姜黃素是從中藥姜黃中提取的一種色素，具有多種藥理學作用。研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素通過清除羥基自由基、清除過氧化反應活性的自由基和增強抗氧化酶活性、減輕氧化應激損傷等途徑來實現(xiàn)抗氧化作用[4]；通過抑制核轉(zhuǎn)錄因子、環(huán)氧化酶-2、干擾素等炎性介質(zhì)和調(diào)控皮質(zhì)類固醇途徑來實現(xiàn)抗炎作用[5-7]；通過對總膽固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白膽固醇成分的影響降低血脂及血糖[8-9]；可以抑制肝星狀細胞(HSC)的活化和誘導受損肝細胞凋亡來阻止肝纖維化的發(fā)生[10]；通過降低p300/CBP和乙?；M蛋白H3/乙?；M蛋白H4的腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子，在神經(jīng)性疼痛治療中發(fā)揮了積極作用[11]；可以產(chǎn)生有效的神經(jīng)保護作用防止由于脊髓損傷[12]；通過調(diào)節(jié)多種細胞信號傳導通路和腫瘤相關因子發(fā)揮抗癌作用，并能增強化療藥物和放療的敏感性[13]。研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素對肺癌細胞[14]、胃癌細胞[15]、人成骨肉瘤細胞[16]等實驗中都具有抑制增殖、促進凋亡的作用。順鉑是一種廣譜的傳統(tǒng)抗癌藥物，在臨床應用殺腫瘤細胞效果好，但治療中不僅不良反應大，而且易產(chǎn)生耐藥性[17-18]。其通過兩方面導致耐藥的發(fā)生[19]：(1)防止鉑類藥物與脫氧核糖核酸(DNA)的結(jié)合，從而防止腫瘤細胞DNA的破壞。(2)修復系統(tǒng)對損傷的DNA進行修復并且腫瘤細胞逃逸機制的發(fā)生，使一直被破壞的細胞仍然不被殺滅。本實驗結(jié)果顯示，姜黃素及順鉑對人前列腺癌PC-3細胞的生長均有抑制增殖的作用，并且對時間、劑量具有明顯的依賴性。有學者發(fā)現(xiàn)，姜黃素聯(lián)合順鉑可以對膀胱癌T24細胞下調(diào)keapl-nrf2通路，使抗腫瘤作用增強[20]。本次研究也發(fā)現(xiàn)姜黃素聯(lián)合順鉑抑制PC-3細胞增殖起協(xié)同增效作用。

實驗證實，姜黃素的抗癌作用與對腫瘤細胞凋亡途徑的調(diào)節(jié)密不可分[21-22]。姜黃素促進凋亡可能機制與姜黃素可以激活caspase-3、caspase-8、caspase-9[23]、調(diào)控Bax/Bcl-2比值[24]，并釋放細胞色素C等因素有關。本實驗結(jié)果顯示，姜黃素與順鉑兩藥聯(lián)合后，凋亡率明顯高于單藥組和對照組，表明姜黃素可以協(xié)同增強順鉑對PC-3細胞的凋亡途徑。

P53蛋白是一種可以抑制細胞分裂的蛋白質(zhì)，在細胞信號傳導途徑中的作用有[25]：(1)對細胞周期的G1期和G2/M期有阻止作用；(2)可以調(diào)控Bax/ Bcl-2、Fas/Apol等蛋白影響細胞凋亡；(3)參與DNA重組和修復功能。Binhua等[26]學者發(fā)現(xiàn)姜黃素作用肺癌A549細胞48 h后，能夠調(diào)節(jié)P53，Bax、Bcl-2，Caspase-3的表達水平，抑制肺癌細胞的增殖；Weir等[27]學者發(fā)現(xiàn)姜黃素通過激活Caspase-3、 PARP降解、促進p53的磷酸化和細胞凋亡來抑制順鉑耐藥的人卵巢癌細胞的增殖；另有馮冰霜等[28]發(fā)現(xiàn)姜黃素聯(lián)合順鉑可能通過增加p53基因的表達來增加宮頸癌Hela細胞化療敏感性。本實驗結(jié)果顯示，姜黃素與順鉑兩藥聯(lián)合后與單藥相比，可以協(xié)同增強促凋亡基因P53的表達，提示姜黃素可能通過P53途徑調(diào)節(jié)PC-3細胞的增殖、凋亡作用和提高順鉑的敏感性。

姜黃素有多條細胞信號轉(zhuǎn)導途徑，與腫瘤生長轉(zhuǎn)移、腫瘤細胞凋亡、腫瘤免疫和腫瘤藥物耐受有著密切的關系，對傳統(tǒng)化療藥來說可能是一種可靠的增敏藥。

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The influence of Curcumin combined with Cisplatin on human prostate cancer cell line PC-3

GuoWei,QiangYayong,HeXiaolong,WangFeng,ZhangBinbin,MaYadong

(DepartmentofUrology，theAffiliatedHospitalYan′anUniversity，Yan′an716000,China)

Objective To observe the effect of Curcumin combined with Cisplatin (DDP) on human prostate cancer cell line PC-3 and explore the mechanism.Methods MTT assay was used to detect the inhibition rate of Curcumin alone or combination with Cisplatin on human prostate cancer cell line PC-3.Flow cytometry was used to detect the apoptosis rate.RT-PCR method was used to analyze the mRNA expression level of p53.Results The cell inhibition rate increased with the increase of concentration and action time of Curcumin.The effect of the combined treatment group was significantly higher than that of each single medication group (P<0.05).The combination had a synergistic effect.Both Curcumin and Cisplatin induced the apoptosis of human prostate cancer cell line PC-3,and the combination could significantly increase the apoptosis rate (P<0.05).RT-PCR results showed that the expression level of P53 mRNA was increased more in the combination group compared with that in the single drug group (P<0.05).Conclusion Curcumin can inhibit the growth of human prostate cancer cell line PC-3 with a dose- and time-dependent manner.The combination with Cisplatin have a synergistic inhibitory effect,which may be related to the upregulation of P53 expression.

Prostatic neoplasms；Cisplatin；Curcumin；Apoptosis

郭巍，副主任醫(yī)師，Email：15756560@qq.com

R737.25

A

10.3969/J.issn.1672-6790.2017.02.019

2016-05-26)