朱雪玲，趙 婧，李 蕭，種曉藝，鞏海鳳，楊生璽，蘇占海#

(1.青海大學(xué)研究生院；2.青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院；3.青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部，基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究中心，青海 西寧 810001)

青?；刈迮訟poB基因多態(tài)性與乳腺癌相關(guān)性

朱雪玲1，趙 婧1，李 蕭2，種曉藝2，鞏海鳳1，楊生璽3，蘇占海3#

(1.青海大學(xué)研究生院；2.青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院；3.青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部，基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究中心，青海 西寧 810001)

目的 探討青海地區(qū)回族女性ApoB基因516位C/T基因多態(tài)性與乳腺癌的相關(guān)性。方法 采用PCR方法擴增87例乳腺癌回族女性及50例正?；刈迮缘腁poB基因，用 EarⅠ限制性核酸內(nèi)切酶切割目的基因，鑒定乳癌組與對照組ApoB基因516位C/T基因的基因型并計算各組等位基因頻率，比較兩組基因型及等位基因頻率分布的差異，分析青海地區(qū)回族女性ApoB基因516位C/T基因多態(tài)性與其乳腺癌發(fā)生的相關(guān)關(guān)系。結(jié)果 乳癌組中CC、CT、TT型基因型頻率分別為69.0%、19.5%、11.5%，對照組中分別為90.0%、4.0%、6.0%，兩組中基因型分布存在差異(P<0.05)，乳癌組中TT、CT基因型的個體多于對照組；乳癌組中C、T等位基因頻率分別為78.7%、21.3%，對照組中C、T等位基因頻率分別為92.0%、8.0%，兩組中C、T等位基因頻率分布存在差異(P<0.05)，乳癌組T等位基因的頻率比對照組高。結(jié)論 青海地區(qū)回族女性ApoB基因516位C/T基因多態(tài)性與其乳腺癌的易感性有關(guān)。

ApoB基因 乳腺癌 回族 女性 基因多態(tài)性

近年來，乳腺癌發(fā)病率逐年上升且發(fā)病年齡提前[1～4]。有研究顯示，青海地區(qū)35歲以前回族乳腺癌的發(fā)病率高于漢族[5]。有研究發(fā)現(xiàn)脂代謝異?？纱龠M女性乳腺癌的發(fā)生[6～7]。載脂蛋白在脂代謝過程中起著重要的作用，血漿中存在多種載脂蛋白，以載脂蛋白B的作用最為突出，ApoB基因具有多態(tài)性，據(jù)報道ApoB基因第516位基因多態(tài)性與女性乳腺癌的發(fā)生有關(guān)[8]。本研究探討ApoB基因516位基因多態(tài)性與青海地區(qū)回族女性乳腺癌易感性的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 乳癌組與對照組外周血標(biāo)本

乳癌組為在青海大學(xué)附屬醫(yī)院、青海省人民醫(yī)院和青海省紅十字醫(yī)院確診為乳腺癌的回族女性，共87人。對照組為在青海大學(xué)附屬醫(yī)院體檢中心進行體檢的健康回族女性，共50人。兩組實驗對象均沒有乳腺癌的家族史，經(jīng)知情同意后，抽取外周靜脈血2 mL于含抗凝劑的血常規(guī)管中，于-80 ℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試劑與儀器

組織基因組DNA提取試劑盒、核酸染料(上海天根，中國)；無水乙醇、1×TAE緩沖液、低熔點DNA瓊脂糖(上海生工，中國)；TaqDNA酶、10×PCRBuffer[without Mg2+：100 mMTris-HClpH8.8 at 25 ℃，500 mM KCl，0.8 %(v/v) Nonidet ](北京康潤，中國)；MgCl2(25mM)、dNTP(10mM)、DNA Marker(BBI，加拿大)；6×DNA Loading Dye(上海賽默飛，中國)；PCR產(chǎn)物純化回收試劑盒(上海生工，中國)；EarⅠ限制性內(nèi)切酶(MBI，加拿大)；胎牛血清白蛋白(BSA，上海碧云天)。

PCR反應(yīng)擴增儀(BBI公司，加拿大)；DK-8D型電熱恒溫水槽(上海森信，中國)；DYY-8型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀(上海琪特，中國)；水浴鍋、搖床、震蕩器(北京六一，中國)；YXJ-2離心機(湖南湘儀，中國)；H6-1微型電泳槽(上海精益，中國)；Gene Genius-凝膠成像系統(tǒng)(Syngene公司，英國)。

1.3 方法

1.3.1 外周血基因組DNA提取

按組織基因組DNA提取試劑盒的操作步驟提取外周血基因組DNA，用核酸濃度測定儀檢測所提外周血基因組DNA的濃度與純度(A260/A280在1.8～2.0之間，DNA純度較高)，樣品于-20 ℃保存。

1.3.2 目的基因PCR擴增

通過查閱文獻，確定上游引物序列為5′-GCTGGGGTTTCTTGAAGACA-3′，下游引物序列為5′-CAAGCGTCTTCAGTGCTCTG-3′，目的片段長度為422 bp[8]。引物由上海生工生物公司合成。擴增目的片段，PCR反應(yīng)體系見表1。PCR反應(yīng)條件是95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃ 30 s，67.5 ℃ 45 s，72 ℃ 60 s，循環(huán)20次，72 ℃ 5 min。瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，凝膠成像系統(tǒng)記錄結(jié)果。

表1 PCR反應(yīng)體系Table 1 PCR reaction system

1.3.3 基因型檢測

取PCR產(chǎn)物10 μL，加入無菌水5 μL、10×PCR Buffer2 μL、0.1%BSA 2 μL、限制性核酸內(nèi)切酶EarⅠ2 μL，37 ℃水浴16 h，對PCR產(chǎn)物進行酶切。酶切產(chǎn)物上樣于1%瓊脂糖凝膠電泳，置于凝膠成像系統(tǒng)記錄結(jié)果。

1.3.4 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用spss19.0軟件，采用χ2檢驗比較乳癌組與對照組基因型及等位基因頻率分布的差異，檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴增目的基因電泳檢測

提取的乳癌組與對照組外周血基因組DNA經(jīng)PCR擴增后，電泳檢測擴增產(chǎn)物。422 bp的目的基因片段擴增成功(條帶清晰，圖1)。

A：對照組；B：乳癌組；M：Marker；1-15、1-10：DNA樣本

圖1 ApoB基因PCR產(chǎn)物電泳圖
Figure 1 Electrophoresis of ApoB gene PCR products

2.2 基因型鑒定

PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)EarⅠ限制性核酸內(nèi)切酶切割后，用凝膠呈像系統(tǒng)檢測記錄結(jié)果。結(jié)果只顯示一條422 bp的條帶，則基因型為CC型；顯示306 bp和116 bp兩條條帶，則基因型為TT型；顯示422 bp、306 bp和116 bp三條條帶，則基因型為CT型(圖2-3)。

M：Marker；1-9：DNA樣本

圖2 對照組ApoB基因型分析圖
Figure 2 Analysis diagram of ApoB genotype in control group

M：Marker；1-8：DNA樣本

2.3 ApoB基因-516位基因型頻率分析

乳癌組中基因型為CC、TT、CT型的個體分別有60例、10例、17例，各基因型的頻率分別為69.0%、11.5%和19.5%。對照組中基因型為CC、TT和CT型的個體分別有45例、3例、2例，各基因型的頻率分別為90.0%、6.0%、4.0%。兩組中ApoB基因516位基因型頻率分布存在差異(P<0.05)，乳癌組中TT、CT基因型頻率高于對照組(表2)。

表2 乳癌組與對照組ApoB基因516位基因型頻率分布Table 2 Frequency distribution of ApoB gene 516 genotype in breast cancer group and control group

2.4 ApoB基因516位C、T等位基因頻率分析

乳癌組中C、T等位基因頻率分別為78.7%、21.3%，對照組中C、T等位基因頻率分別為92.0%、8.0%(表3)。兩組中C、T等位基因頻率的分布存在差異(P<0.05)。

表3 乳癌組與對照組ApoB基因516位C、T等位基因頻率分布Table 3 Frequency distribution of ApoB gene 516 C，T allele in breast cancer group and control group

3 討論

統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示乳腺癌的發(fā)病率位列女性惡性腫瘤的首位，居全國惡性腫瘤的第二位[9]。近年來我國乳腺癌的發(fā)病率和死亡率均呈現(xiàn)上升趨勢，城市的增加幅度高于農(nóng)村[2]。霍新龍研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌發(fā)生和遠處轉(zhuǎn)移與血脂異常有關(guān)[10]。美國德克薩斯大學(xué)西南醫(yī)學(xué)中心的科研人員發(fā)現(xiàn)膽固醇的代謝產(chǎn)物具有雌激素樣的作用，可促進乳腺癌細胞的增殖[11]。載脂蛋白(apoprotein)主要參與體內(nèi)脂質(zhì)的結(jié)合、轉(zhuǎn)運及代謝等過程。目前從人血漿中分離出的載脂蛋白達20余種，主要分為ApoA、ApoB、ApoC、ApoD、ApoE五大類。其中ApoB在體內(nèi)主要以ApoB48和ApoB100兩種形式存在，二者分別是乳糜微粒(CM)和低密度脂蛋白(LDL)的組成成分。ApoB100與LDL代謝有關(guān)，LDL主要通過受體介導(dǎo)的途徑代謝，LDL與LDL受體(LDLR)結(jié)合后與ApoB100結(jié)合形成復(fù)合物被轉(zhuǎn)運至溶酶體中進行降解，從而實現(xiàn)LDL的代謝。金吉鐘等發(fā)現(xiàn)體內(nèi)LDL含量增高可刺激機體分泌雌激素、胰島素等激素而導(dǎo)致乳腺癌的發(fā)生[12]。蔣圣早等研究發(fā)現(xiàn)血清中ApoB和LDL的水平與乳腺癌的發(fā)生成正相關(guān)[13]。

研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌與肥胖的發(fā)生密切相關(guān)，脂肪組織可分泌芳香化酶將體內(nèi)的雄激素轉(zhuǎn)化為雌激素，使體內(nèi)雌激素水平升高，進而增加乳腺癌的發(fā)生風(fēng)險[14～17]。ApoB基因是一種肥胖相關(guān)基因，位于2號染色體短臂，由28個內(nèi)含子和29個外顯子組成，全長43 kb，含6個ALΜ重復(fù)序列。該基因存在多態(tài)性，共有75處核苷酸突變位點，可發(fā)生有意義突變的位點有54處，其多態(tài)性是以堿基的缺失或插入為基礎(chǔ)的[18]。Xiaoyi Liu等研究發(fā)現(xiàn)，ApoB基因rs693位點和rs1042031位點的多態(tài)性可增加中國女性乳腺癌的發(fā)生風(fēng)險[19]。Pandey SN等研究結(jié)果顯示，ApoB基因及單體型信號肽的多態(tài)性與膽囊癌的發(fā)生沒有直接的關(guān)系，但是用最大期望值法可得到四種單體型的基因型個體，基因型為X(+)，D的單體型個體不論是否有膽囊結(jié)石的病史，其發(fā)生膽囊癌的風(fēng)險都會增加[20]。有研究發(fā)現(xiàn)，ApoB基因XbaI位點的多態(tài)性是膽囊癌發(fā)生的一個危險因素[21]。目前關(guān)于ApoB基因516位C/T基因多態(tài)性與腫瘤發(fā)生關(guān)系的研究較少。本研究通過分析青海地區(qū)回族女性ApoB基因516位C/T基因的基因型及等位基因頻率分布的差異，揭示乳癌的發(fā)生與ApoB基因516位C/T基因多態(tài)性的關(guān)系。

在青?；刈迮灾蠥poB基因516位C/T基因具有多態(tài)性，乳癌組與對照組中該基因的基因型及等位基因頻率分布均存在差異。此外，乳癌組中基因型為TT、CT型個體多于對照組且乳癌組中T等位基因的頻率高于對照組，ApoB基因516位T等位基因可能使青海地區(qū)回族女性乳腺癌的發(fā)生風(fēng)險增加(P<0.05)。這與霍慧霞在漢族人群中的研究結(jié)果一致[8]，提示該基因位點的多態(tài)性與乳腺癌的易感性的聯(lián)系可能不存在民族差異。本研究的結(jié)論是在僅分析了該基因的基因型及等位基因頻率分布的基礎(chǔ)上得出的，并未結(jié)合組織病理學(xué)特征進行分析。要將研究結(jié)果推廣到不同民族，還需結(jié)合臨床病理資料進一步研究包括藏族、土族等不同民族ApoB基因516位C/T基因多態(tài)性與女性乳腺癌的相關(guān)性。

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Association of ApoB gene polymorphism with breast cancer in the Hui ethnic female in Qinghai region

ZHU Xue-ling1，ZHAO Jing1，LI Xiao2，ZHONG Xiao-yi2，GONG Hai-feng1，YANG Sheng-xi3，SU Zhan-hai3#

(1.Department of Postgraduate，Qinghai University；2. Qinghai University Medical College； 3.Department of Basic Medical Sciences and Basic Medical Research Center， Qinghai University Medical College，Xining，Qinghai，810001)

Objective To investigate the association of the ApoB gene 516 C/T polymorphism with breast cancer in Hui ethnic female in Qinghai region.Methods ApoB gene was amplified by PCR method in 87 cases of breast cancer and 50 normal female.By using EarⅠrestriction enzyme to cleavage ApoB gene and identify 516 C/T gene polymorphism.Breast cancer group and control group were identified，and calculate the allele frequencies in each group.To compare the difference of the frequency distribution of genotype and allele between the breast cancer group and the control group.To analyze the relationship between the polymorphism of ApoB gene 516 C/T gene and breast cancer in Hui ethnic female in Qinghai region.Results The frequency of CC，CT and TT genotype in breast cancer group was 69.0%，19.5% and 11.5%，respectively.The frequency of CC，CT and TT genotype in control group was 90.0%，4.0% and 6.0%，respectively.There showed a difference in genotype distribution between the breast cancer group and the control group(P<0.05)，and the TT and CT genotype in the breast cancer group were more than those in the control group；The frequency of C and T allele in breast cancer group were 78.7% and 21.3%，respectively.The frequency of C and T allele in control group weres 92.0% and 8.0%，respectively.In the breast cancer group and the control group，C，T allele frequency distribution were different(P<0.05)，the frequency of T allele in breast cancer group was higher than that in control group.T allele increased the risk of breast cancer in Hui ethnic female in Qinghai region.Conclusion The ApoB gene 516C/T gene polymorphism is associated with the susceptibility of breast cancer in Hui ethnic female in Qinghai region.

ApoB gene Breast cancer Hui ethnic Female Gene polymorphism

R730.4

A

10.13452/j.cnki.jqmc.2017.01.008

2016-06-02

朱雪玲(1992～)，女，漢族，天津籍，在讀碩士. #：通訊作者，教授，碩士生導(dǎo)師，suzhanhai@qhu.edu.cn