劉川川，劉輝琦，曹學(xué)鋒，劉 杰，吳 穹，王生蘭

(青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院，青海，西寧 810001)

慢病毒介導(dǎo)RNA干擾沉默OPN基因抑制低氧引起的SD大鼠肺動脈血管平滑肌細(xì)胞增殖※

劉川川，劉輝琦，曹學(xué)鋒，劉 杰，吳 穹，王生蘭*

(青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院，青海，西寧 810001)

目的 觀察慢病毒介導(dǎo)RNA干擾沉默骨橋蛋白(Osteopontin，OPN)基因?qū)Φ脱醮碳は耂D大鼠肺動脈平滑肌細(xì)胞增殖的影響。方法 SD大鼠肺動脈平滑肌細(xì)胞分為四組：常氧對照組、低氧對照組、低氧+空病毒組、低氧+ OPN沉默組，分別采用MTT法檢測各組細(xì)胞的增殖能力，實時熒光定量法檢測各組細(xì)胞OPN mRNA的表達(dá)情況，Western Blotting法檢測各組細(xì)胞OPN蛋白表達(dá)水平。結(jié)果 2%低氧環(huán)境培養(yǎng)PASMCs細(xì)胞48 h，可使OPN的mRNA和蛋白表達(dá)量較常氧對照組增高，細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)，差異有顯著性(P<0.05)；肺動脈平滑肌細(xì)胞慢病毒感染72 h后低氧培養(yǎng)48 h，可使OPNmRNA相對表達(dá)量和蛋白表達(dá)量均低于低氧對照組和低氧+空病毒組，且細(xì)胞的增殖能力降低，差異有顯著性(P<0.05)。結(jié)論 低氧刺激可使OPN表達(dá)量增加、肺動脈平滑肌細(xì)胞增殖；慢病毒介導(dǎo)RNA干擾沉默OPN基因可抑制低氧刺激引起的大鼠肺動脈平滑肌細(xì)胞增殖。

RNA干擾 低氧 骨橋蛋白 肺動脈平滑肌細(xì)胞

高原低壓低氧環(huán)境是誘發(fā)多種高原病發(fā)生的主要原因，長期慢性低氧刺激可引起內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能紊亂，造成多種血管活性因子的釋放，成為HPH(Hypoxic Pulmonary Hypertension，HPH)發(fā)生的潛在因素。HPH是因長期慢性低氧刺激，引起持續(xù)肺血管收縮、血管重塑甚至微血管血栓的形成，導(dǎo)致肺動脈壓力和肺血管阻力升高，最終引發(fā)肺動脈高壓，甚至造成右心負(fù)荷增加、右心衰竭的綜合病癥。目前對于HPH的發(fā)生機(jī)制仍不清楚，低氧刺激引起的肺血管重塑和中層肺動脈平滑肌細(xì)胞(Pulmonary Artery Smooth Muscle Cells，PASMCs)的異常增殖是有關(guān)機(jī)制的討論熱點[1-4]。

骨橋蛋白(Osteopontin，OPN)是一種多功能的磷酸化糖蛋白，在上皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等多種細(xì)胞及組織中均廣泛表達(dá)。OPN作為一種參與機(jī)體重要功能的黏附及趨化因子，被認(rèn)為是血管平滑肌細(xì)胞增殖表型的標(biāo)志性蛋白[5]，血管平滑肌細(xì)胞表型改變是HPH形成的重要原因。有研究表明[6，7]，低氧刺激OPN表達(dá)升高，可顯著促進(jìn)肺血管重塑。林全等在整體動物實驗發(fā)現(xiàn)[8]，OPN在低氧刺激時在中層肺動脈平滑肌中表達(dá)明顯增加。然而OPN在低氧引起的PASMCs增殖中有何作用尚缺乏研究。本文以此為切入點進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與試劑選擇

SPF級雄性SD大鼠[約180g，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，動物合格證號：SCXK(京)2012-0001，NO．11400700149469]。

OPN shRNA試劑(廣州賽業(yè)生物科技有限公司)；Trizol(Thermo Fisher Scientific公司)；qPCR試劑盒(takara公司)；引物[生工生物工程(上海)股份有限公司合成]；α-SMA抗體(Sigma公司)；DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清(Gibco公司)；OPN一抗(Abcam)；二抗(北京中杉金橋)；二甲基亞砜、RIPA、十二烷基磺酸鈉、四甲基乙二胺、30%丙烯酰胺(北京索萊寶公司)。

1.2 組織塊貼壁法培養(yǎng)PASMCs及鑒定

大鼠用10%水合氯醛行腹腔注射麻醉(0.2mL/kg)，75%乙醇浸泡10 s消毒后在超凈臺內(nèi)迅速取出心肺組織，放入盛有4 ℃預(yù)冷PBS緩沖液的培養(yǎng)皿中，剔除心臟，沿肺動脈主干分離肺動脈，保留3～4級肺動脈。去除內(nèi)外膜后將平滑肌剪成約1×1×1 mm大小的組織塊，放入含20%FBS+DMEM/F12完全培養(yǎng)基中浸潤后平鋪于培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)瓶底部加入3 mL完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)箱(37℃，5% CO2)中直立培養(yǎng)3 h后平放培養(yǎng)[9]。用α-SMA免疫組化法(1：100)鑒定。原代培養(yǎng)3～7代的細(xì)胞用于實驗。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及有效轉(zhuǎn)染病毒篩選

生長良好的細(xì)胞傳代于6孔板，待細(xì)胞達(dá)到30%～50%融合時轉(zhuǎn)染(干擾序列見表1)。

表1 干擾序列Table 1 Interference sequence

將病毒稀釋至同一濃度，總體積為1 mL。細(xì)胞分6組：(1)常氧對照組：加無血清DMEM/F12培養(yǎng)基20 μL；(2)低氧對照組：加無血清DMEM/F12培養(yǎng)基20 μL；(3)低氧48 h+shRNA control組：加空病毒20 μL；(4)低氧48 h+shRNA 1組：加OPN shRNA1慢病毒20 μL；(5)低氧48 h+shRNA 2組：加OPN shRNA2慢病毒20 μL；(6)低氧48 h+shRNA 3組：加OPN shRNA3慢病毒20 μL。轉(zhuǎn)染12 h后換液，轉(zhuǎn)染后72 h將正常對照組細(xì)胞置于常氧培養(yǎng)箱(37℃，5% CO2，21%O2)，其余各組放入低氧培養(yǎng)箱(37℃，5% CO2，2%O2)中培養(yǎng)48 h用于后續(xù)qPCR實驗，培養(yǎng)72 h用于western blot實驗。

1.4 實時熒光定量PCR檢測

細(xì)胞轉(zhuǎn)染低氧培養(yǎng)48 h后，用Tirzol提取總RNA，用紫外分光光度計檢測RNA濃度，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測純度。取1 μg總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。梯度PCR獲取引物適宜退火溫度(表2)。以18S為內(nèi)參，按下列反應(yīng)條件進(jìn)行擴(kuò)增：50 ℃ 2 min(1個循環(huán))；94 ℃ 15 min(1個循環(huán))；94 ℃變性10 s，退火溫度根據(jù)引物不同設(shè)定，退火34 s(40個循環(huán))。數(shù)據(jù)以2-ΔΔCT法統(tǒng)計分析。

表2 引物序列Table 2 The primer sequences

1.5 Western Blotting法檢測OPN蛋白的表達(dá)

轉(zhuǎn)染后細(xì)胞用Ripa(加入10%PMSF)裂解，提取細(xì)胞總蛋白，用BCA法測定裂解液中蛋白濃度。標(biāo)化各組蛋白濃度后經(jīng)SDS-PAGE電泳分離后，將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用5%脫脂奶粉(TBS，0.1% Tween-20)封閉1 h，加人OPN一抗(1：1000)，4 ℃孵育過夜(15h)，用TBST(TBS，0.1% Tween-20)漂洗5次，加入HRP標(biāo)記的二抗(1：5000)，室溫孵育1 h，用ECL化學(xué)發(fā)光顯影。

1.6 細(xì)胞增殖能力檢測

對數(shù)期生長的細(xì)胞，用0.25%無EDTA胰酶消化后計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105/mL接種于96孔板中，每孔加入完全培養(yǎng)基100 μL，每組5個復(fù)孔，置于培養(yǎng)箱(37℃，5% CO2)中培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后吸出各孔內(nèi)培養(yǎng)液，加入不含血清培養(yǎng)基同步20 h后，加入100 μL新配制完全培養(yǎng)基，并加入1 μL篩選合格慢病毒轉(zhuǎn)染12 h，換液后放入低氧培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，各孔加入MTT(5mg/mL)10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，用酶標(biāo)儀檢測各孔吸光值(570nm)。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 PASMCs細(xì)胞鑒定

免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，98%的細(xì)胞均能表達(dá)α-SMA(圖1)，培養(yǎng)細(xì)胞為平滑肌細(xì)胞。

圖1 α-SMA免疫組織化學(xué)染色鑒定(左100×，右400×)
Figure 1 α-SMA immunohistochemical staining(left 100×，right 400×)

2.2 OPN shRNA轉(zhuǎn)染效率檢測

PASMCs細(xì)胞經(jīng)OPN shRNA轉(zhuǎn)染后，通過實時熒光定量PCR檢測OPN mRNA表達(dá)水平，低氧對照組和低氧48 h+shRNA control組其表達(dá)量高于常氧對照組(P<0.05)，表明低氧刺激能促進(jìn)PASMCs細(xì)胞中OPN的表達(dá)；低氧48 h+shRNA 1組、低氧48 h+shRNA 2組、低氧48 h+shRNA 3組其表達(dá)量顯著低于48 h+shRNA control組(P<0.05)，同時也顯著低于常氧對照組(P<0.05)，表明合成的三對OPN shRNA均能明顯抑制PASMCs中OPN的表達(dá)(表3)。

表3 各組qPCR法檢測的OPN mRNA相對表達(dá)量Table 3 The relative expression quantity of OPN mRNA detected by qPCR in each ±s)

a為P<0.05，與常氧對照組比較；b為P<0.05，與低氧48 h對照組比較；c為P<0.05，與低氧48 h+空病毒組比較.

Western blotting法檢測六組細(xì)胞OPN蛋白表達(dá)水平，低氧對照組和低氧48 h+shRNA control組OPN蛋白表達(dá)量明顯高于常氧對照組(P<0.05)，表明低氧刺激能明顯刺激OPN蛋白的表達(dá)上升；低氧48 h+shRNA 1組、低氧48 h+shRNA 2組、低氧48 h+shRNA 3組OPN蛋白表達(dá)量均低于低氧48 h+shRNA control組(P<0.05)；低氧48 h+shRNA 1組、低氧48 h+shRNA 2組相對于常氧組OPN蛋白表達(dá)升高(P<0.05)，低氧48 h+shRNA 3組相對于常氧組OPN蛋白表達(dá)無差異(P>0.05)(表4，圖2)。

通過分析OPN shRNA轉(zhuǎn)染PASMCs細(xì)胞后對其mRNA和蛋白表達(dá)的影響，OPN shRNA3序列干擾效果較好，可用于后續(xù)實驗。

表4 不同shRNA干擾低氧誘導(dǎo)的肺動脈平滑肌細(xì)胞OPN蛋白表達(dá)的變化值±s)Table 4 Protein expression of OPN in PASMCs induced by hypoxia after interference with different ±s)

a與常氧對照組比較P<0.05；b與低氧對照組比較P<0.05；c與低氧48 h+shRNA control組比較P<0.05.

圖2 siRNA干擾對OPN蛋白表達(dá)的影響Figure 2 Effect of siRNA interference on the expression of OPN protein

2.3 OPN shRNA 3轉(zhuǎn)染對PASMCs增殖的影響

MTT法檢測OPN shRNA 3轉(zhuǎn)染對PASMCs增殖的影響，低氧對照組和低氧+空病毒組PASMCs細(xì)胞增殖能力高于常氧對照組(P<0.05)，低氧+OPN沉默組細(xì)胞增殖能力明顯低于低氧+空病毒組(P<0.05)。同時，低氧+OPN沉默組細(xì)胞增殖能力也明顯低于常氧對照組(P<0.05)，表明經(jīng)OPN shRNA 3轉(zhuǎn)染對PASMCs細(xì)胞的增殖有明顯的抑制作用(表5)。

同時，低氧對照組和低氧+空病毒PASMCs細(xì)胞OPN mRNA表達(dá)量明顯增高(P<0.05)，低氧+OPN沉默組OPN mRNA表達(dá)量明顯低于低氧+空病毒組(P<0.05)，也明顯低于常氧對照組(P<0.05)(表5)。低氧+OPN沉默組OPN蛋白表達(dá)明顯低于低氧+空病毒組(P<0.05)(表6，圖3)。

表5 各組MTT檢測的OD值和qPCR法檢測的OPNmRNA相對表達(dá)量Table 5 OD value and OPNmRNA expression level in each group detected by MTT and ±s)

a與常氧對照組比較P<0.05；b與低氧24 h對照組比較P<0.05；c與低氧24 h+空病毒組比較P<0.05.

表6 OPN shRNA 3干擾對OPN蛋白表達(dá)的影響Table 6 Effect of OPN shRNA 3 interference on the expression of OPN protein

a與常氧對照組比較P<0.05；b與低氧對照組比較P<0.05；c與低氧+空病毒組比較P<0.05.

圖3 shRNA 3干擾對OPN蛋白表達(dá)的影響Figure 3 Effect of shRNA 3 interference on the expression of OPN protein

3 討論

OPN作為帶負(fù)電的非膠原性骨基質(zhì)糖蛋白，廣泛存在于多種組織和細(xì)胞中[9，10]，其相對分子質(zhì)量約為44 kDa，其編碼基因位于染色體4q13位點，約含300個氨基酸殘基，富含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)序列、凝血酶裂解位點、整合素結(jié)合位點、鈣結(jié)合域基質(zhì)金屬蛋白酶結(jié)合域等功能性位點。其作為一種細(xì)胞因子參與組織重塑、免疫調(diào)控、炎癥反應(yīng)以及腫瘤的發(fā)生發(fā)展等病理過程。Wang AP等人研究發(fā)現(xiàn)[11]，低氧刺激可以促進(jìn)PASMCs細(xì)胞的增殖；Li XW等人研究同樣發(fā)現(xiàn)[4]，低氧可以促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞的增殖和血管內(nèi)膜的增生。

本研究通過分離大鼠肺動脈平滑肌細(xì)胞，研究OPN對大鼠肺動脈平滑肌細(xì)胞增殖的影響。qPCR和western blotting檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)設(shè)計三對慢病毒均能較好地干擾PASMCs中OPN的表達(dá)，且在單純低氧刺激下PASMCs中OPN的表達(dá)明顯升高，此結(jié)果與其他學(xué)者的實驗結(jié)果相一致[3]。

MTT檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在低氧刺激下PASMCs的增殖能力明顯增強(qiáng)，在使用慢病毒干擾后，能明顯抑制低氧引起的大鼠肺動脈平滑肌細(xì)胞的增殖，且空病毒對PASMCs的增殖無影響；低氧刺激后的OPN mRNA和OPN蛋白表達(dá)明顯增加，特異性shRNA干擾后OPN mRNA和OPN蛋白的表達(dá)均明顯減少，該變化和MTT結(jié)果具有相似的變化趨勢。由此可推測低氧誘導(dǎo)OPN表達(dá)增加對PASMCs的增殖有促進(jìn)作用。

肺動脈平滑肌細(xì)胞作為構(gòu)成肺動脈的主要結(jié)構(gòu)，在參與肺血管重構(gòu)中起重要作用。OPN作為平滑肌細(xì)胞合成型的標(biāo)志蛋白[12]，其表達(dá)量增高標(biāo)志著平滑肌細(xì)胞的增殖能力提高，參與肺動脈血管重塑及HPH的形成。因此通過本實驗的研究，推測OPN表達(dá)與低氧刺激肺血管平滑肌細(xì)胞的增殖有關(guān)，這一結(jié)果為低氧刺激所致肺血管重塑及HPH的分子靶向治療給予了某種提示，但OPN表達(dá)與PASMCs增殖的具體分子機(jī)制尚待進(jìn)一步探討。

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Lentivirus RNA Interference OPN Inhibiting PASMCs Proliferation of SD Rats under Hypoxia Condition

LIU Chuan-chuan，LIU Hui-qi，CAO Xue-feng，LIU Jie，WU Qiong，WANG Sheng-lan*

(Qinghai University Medical College，Xining，Qinghai，810001，China)

Objective To observe the effect of lentivirus RNA interference osteopontin(OPN)gene silence of SD rats on pulmonary artery smooth muscle cell proliferation under hypoxia condition.Methods SD rats’ pulmonary artery smooth muscle cells(PASMCs)were divided into four groups：normal group，hypoxia group，hypoxia+empty virus group and hypoxia+OPN shRNA group.The proliferation，OPN expression at mRNA and protein level in each group was detected by MTT，real-time PCR and Western Blotting，respectively.Results OPN of PASMCs expression at mRNA and protein level were all increased significantly after 48 h cultured at 2% low oxygen condition(P<0.05)；Compared with low oxygen group and hypoxia+empty virus group，mRNA and protein expression of OPN of PASMCs was decreased and the proliferation decreased as well after 48 h hypoxia culturing，which has been infected with lentivirus 3 days(P<0.05).Conclusion Hypoxia promotes expression of OPN and proliferation of PASMCs of rat.Lentivirus RNA interference of OPN has the effect of inhibiting PASMCs proliferation induced by hypoxia.

RNAi Hypoxia Osteopontin PASMCs

※：國家自然科學(xué)基金資助項目(81160031)；*：通信作者，教授，E-mail-zlw6996@163.com。 劉川川(1990～)，男，漢族，四川籍，碩士在讀

R363

A

10.13452/j.cnki.jqmc.2017.01.005

2016-12-12