李疆 趙珊 張晶 丁曉靜

脫氫乙酸是廣譜性的一種低毒高效食品防腐劑，尤其對(duì)霉菌和酵母的抑菌能力強(qiáng)，為苯甲酸鈉的2～10倍，常以鈉鹽的形式用在果汁、腐乳、醬菜、糕點(diǎn)中進(jìn)行防腐［1］，然而過(guò)量使用對(duì)人和動(dòng)物都有一定的危害性，許多國(guó)家對(duì)該防腐劑的使用都有嚴(yán)格的規(guī)定，美國(guó)規(guī)定食品中最高殘留限量為65 mg/kg，日本和我國(guó)臺(tái)灣允許用于食品的最高殘留限量為0.5 g/kg，我國(guó)也規(guī)定了脫氫乙酸在黃油、糕點(diǎn)、熟肉制品和發(fā)酵豆制品等產(chǎn)品中添加量不得超過(guò) 0.3～1.0 g/kg［2］，而且禁止用于牛奶防腐。因此，為防止脫氫乙酸違規(guī)添加在牛奶中進(jìn)行防腐，有必要建立牛奶中脫氫乙酸的分析方法。目前，測(cè)定脫氫乙酸最常用的方法包括分光光度法［1］、離子色譜法(IC)［3］、高效液相色譜法(HPLC)［4］、氣相色譜法(GC)以及高效毛細(xì)管電泳法(HPCE)［5－8］。其中，分光光度法、GC 法和 HPLC 法是在酸性條件下進(jìn)行測(cè)定，樣品前處理較為繁瑣。IC法需固相萃取凈化，前處理程序冗長(zhǎng)，操作復(fù)雜。本實(shí)驗(yàn)室在上述文獻(xiàn)基礎(chǔ)上，建立了簡(jiǎn)單、快速測(cè)定牛奶中脫氫乙酸的膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜法，并用于牛奶樣品的測(cè)定，獲滿意結(jié)果。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器和試劑 Beckman P/ACE MDQ型毛細(xì)管電泳儀，具二極管陣列檢測(cè)器;Beckman P/ACE Station工作站(美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司);未涂層熔融石英毛細(xì)管(30.2 cm×50 mm i．d．，河北永年瑞灃色譜器件有限公司)。KQ－100E醫(yī)用超聲波清洗器(江蘇昆山市超聲儀器有限公司);Milli-Elix/RiOs超純水儀(美國(guó)Millipore公司);F－50 A酸度計(jì)(北京屹源電子儀器科技公司);德國(guó)Hettich Universal 32離心機(jī)高速離心機(jī);電子天平(AL 204-IC，METTLER TOLEDO公司，精度:0.1 mg);500 mL低密度聚乙烯塑料瓶(low-density polyethyl，LDPE，美國(guó) Cole-Parmer公司)。1.5、15和 50 mL塑料離心管(Greiner，德國(guó))。硼砂(Na2B4O7，分析純，中國(guó)醫(yī)藥公司北京采購(gòu)供應(yīng)站);硼酸(H3BO3，優(yōu)級(jí)純，鐵嶺地區(qū)開(kāi)原化工廠);氫氧化鈉(NaOH，優(yōu)級(jí)純，北京化工廠);十二烷基硫酸鈉(SDS，純度≥99%，Sigma-Aldrich);冰醋酸(CH3COOH，純度≥99.8%，北京化學(xué)試劑公司);甲醇(色譜純，F(xiàn)isher Scientific，USA);乙腈(色譜純，F(xiàn)isher Scientific，USA);標(biāo)準(zhǔn)品:脫氫乙酸(DA，純度≥98%，Sigma-Aldrich)。6件樣品來(lái)自市售。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制 準(zhǔn)確稱取已折算純度的脫氫乙酸86 mg，置于15 mL塑料離心管中，用移液器加入8.6 mL乙腈，渦旋混勻，制得質(zhì)量濃度為10 g/L標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于4℃冰箱中冷藏保存。

1.3 電泳條件 毛細(xì)管:30.2 cm(有效長(zhǎng)度:20 cm)×50 μm i．d．;分離電壓:13 kV;進(jìn)樣壓力及時(shí)間:0.5 psi、4 s;操作溫度25℃;檢測(cè)波長(zhǎng):228 nm。分離緩沖溶液:15 mmol/L硼砂 +60 mmol/L H3BO3+100 mmol/L SDS;樣品提取液:將分離緩沖溶液用超純水稀釋10倍，并保證含5%乙腈，用于處理牛奶樣品。新毛細(xì)管在使用前分別用1 mol/L NaOH沖洗20 min，超純水沖洗5 min，分離緩沖液沖洗5 min。每次進(jìn)樣前依次用1 mol/L NaOH沖洗1 min，超純水沖洗1 min，分離緩沖液沖洗1.5 min，以保證遷移時(shí)間和校正峰面積的重現(xiàn)性。

1.4 樣品前處理 牛奶樣品;稱取0.020 g，置于1.5 mL離心管中，加入樣品提取液980μL，超聲提取10 min，4°C 14 000 r/min 離心 10 min，取上清液直接進(jìn)樣測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 毛細(xì)管長(zhǎng)度的選擇 本研究?jī)H對(duì)脫氫乙酸單一成分進(jìn)行分析，綜合考慮分離效果、分離時(shí)間，選用較短的石英毛細(xì)管30.2 cm(有效長(zhǎng)度:20 cm)×50μm i．d．進(jìn)行分析，3 min內(nèi)即可完成分離。

2.2 分離緩沖溶液及濃度的選擇 磷酸鹽緩沖體系和硼砂緩沖體系因紫外吸收低而成為毛細(xì)管電泳分析中最常用的分離緩沖體系。本實(shí)驗(yàn)室以前的研究表明硼砂緩沖體系可實(shí)現(xiàn)食品中10種防腐劑的分離與測(cè)定［9］，故本研究仍采用該緩沖體系。分離緩沖溶液中100 mmol/L SDS，60 mmol/L H3BO3(pH 8.31)不變，對(duì)硼砂的濃度(10，15和20 mmol/L)進(jìn)行了研究，隨硼砂濃度的增加，遷移時(shí)間延長(zhǎng)。綜合考慮遷移時(shí)間與分離度，15 mmol/L硼砂為最佳。

2.3 分離緩沖溶液pH值的選擇 分離緩沖溶液pH值不僅影響分析物的遷移時(shí)間和分離效率，而且對(duì)分析物的穩(wěn)定性產(chǎn)生影響，可能造成峰變形。保持分離緩沖液中其余組分濃度不變，本研究考察了硼酸濃度分別為30、60及90 mmol/L，相應(yīng) pH分別為8.56、8.31及8.15時(shí)對(duì)分離和峰形的影響，pH為8.31即60 mmol/L硼酸時(shí)，脫氫乙酸的峰沒(méi)有變形。

2.4 分離緩沖溶液中SDS濃度的選擇 保持分離緩沖溶液中15 mmol/L硼砂及60 mmol/L硼酸(pH 8.31)不變，考察了分離緩沖溶液中 50、80和100 mmol/L SDS對(duì)脫氫乙酸遷移時(shí)間的影響。隨著SDS濃度的增加，遷移時(shí)間逐漸延長(zhǎng)，但靈敏度越來(lái)越高，當(dāng) SDS濃度為100 mmol/L時(shí)效果最佳。故SDS最佳濃度為100 mmol/L

2.5 分離電壓的選擇 分離電壓對(duì)遷移時(shí)間、靈敏度和分離度等產(chǎn)生影響，但是過(guò)高的電壓會(huì)導(dǎo)致工作電流增加，因此產(chǎn)生過(guò)多的焦耳熱，導(dǎo)致區(qū)帶展寬。除此之外，本實(shí)驗(yàn)采用了高濃度的表面活性劑SDS，電壓過(guò)高會(huì)導(dǎo)致斷電，為避免斷電，本實(shí)驗(yàn)采用13 kV電壓(35μA)進(jìn)行分離。

2.6 進(jìn)樣時(shí)間的選擇 進(jìn)樣時(shí)間對(duì)待測(cè)物的分離效果和靈敏度有顯著影響。受毛細(xì)管柱容量的限制，高濃度大體積進(jìn)樣易造成超載，使峰形展寬，分離度減小，然而小體積進(jìn)樣時(shí)將導(dǎo)致靈敏度太低。本實(shí)驗(yàn)考察了進(jìn)樣時(shí)間分別為2、4、6和8 s時(shí)的分離效果，隨進(jìn)樣時(shí)間的增長(zhǎng)，各峰靈敏度明顯升高。進(jìn)樣時(shí)間為6 s時(shí)的峰開(kāi)始展寬，因此最終選擇進(jìn)樣時(shí)間為4 s。

2.7 標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍及檢出限 在上述最佳電泳條件下，將脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(10 g/L)用乙腈逐級(jí)稀釋，配制成質(zhì)量濃度分別為 30、60、100、200、500、1 000、2 000，然后取每個(gè)質(zhì)量濃度的混標(biāo)10μL，再加入190μL樣品提取液;將以上質(zhì)量濃度的脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)分別稀釋成 1.5、3、5、10、25、50、100 mg/L 的工作液，確保每個(gè)質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液中含5%乙腈。采用校正峰面積外標(biāo)法定量，校正峰面積(y)與質(zhì)量濃度(x，mg/L)線性回歸方程A=78.6x+31.99，相關(guān)系數(shù)(r)為0.999 9，具有良好線性關(guān)系。檢出限(LOD)0.5 mg/L，定量限(LOQ)1.5 mg/L。

2.8 加標(biāo)回收率 本實(shí)驗(yàn)用不含脫氫乙酸的牛奶樣品做加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)的本底。分別在低、中、高三個(gè)質(zhì)量濃度水平進(jìn)行加標(biāo)回收率試驗(yàn)。脫氫乙酸分別加標(biāo)10、50和100 mg/L(每個(gè)加標(biāo)濃度的樣品平行處理5份)，回收率在95.2% ～98.6%，相應(yīng)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.6%～3.4%。加標(biāo)電泳圖見(jiàn)圖1，由圖可見(jiàn):3.5 min之內(nèi)即可實(shí)現(xiàn)脫氫乙酸的分離測(cè)定，加上進(jìn)樣前的清洗時(shí)間為3.5 min，則每個(gè)樣品僅需7 min即可完成分析。

圖1 脫氫乙酸加標(biāo)電泳圖

2.9 實(shí)際樣品分析 按1.4樣品前處理方法對(duì)市場(chǎng)采購(gòu)6件牛奶樣品進(jìn)行處理，均未檢測(cè)到脫氫乙酸。

3 結(jié)論

本文建立的膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜法，具有樣品前處理簡(jiǎn)單、分離效率高，試劑消耗少，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠，適用于牛奶樣品中脫氫乙酸的快速測(cè)定。

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