王 曦， 周 巍， 陳 林

(1.上海市食品藥品檢驗(yàn)所, 上海 2012032.上海五色石醫(yī)學(xué)研究有限公司， 上海 2012033.上?；瞪锛夹g(shù)有限公司， 上海 201203)

基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)

HCV感染引起Hsp72的過(guò)度表達(dá)Hsp72在感染HCV肝癌細(xì)胞增殖中的作用

王 曦1， 周 巍2， 陳 林3

(1.上海市食品藥品檢驗(yàn)所, 上海 2012032.上海五色石醫(yī)學(xué)研究有限公司， 上海 2012033.上?；瞪锛夹g(shù)有限公司， 上海 201203)

目的：評(píng)價(jià)感染丙型肝炎病毒(HCV)后熱激蛋白72(Hsp72)的表達(dá)和其在肝癌細(xì)胞的增殖和生長(zhǎng)過(guò)程中的作用。方法：選取感染基因型為1a/1b的HCV慢性肝炎患者32例，HBV和HCV檢測(cè)為陽(yáng)性患者20例，感染慢性肝炎病毒C的患者8例和未感染HBV、HCV或者HIV的肝轉(zhuǎn)移瘤作為對(duì)照組肝3例，活組織檢查樣本來(lái)自感染慢性HCV的患者，通過(guò)ELISA、定量PCR和免疫組化的方法分析Hsp72的表達(dá)。運(yùn)用培養(yǎng)感染HCV/JFH1的肝細(xì)胞，通過(guò)siRNA和細(xì)胞增值的方法來(lái)評(píng)價(jià)Hsp72過(guò)度表達(dá)對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的作用。結(jié)果：①感染HCV后，細(xì)胞內(nèi)的Hsp72蛋白表達(dá)顯著上調(diào)。②HCV通過(guò)誘導(dǎo)NFAT5增加Hsp72的表達(dá)。③感染HCV后，Hsp72能促進(jìn)人肝癌細(xì)胞的增殖。④MEK抑制劑PD98095可以抑制Hsp72對(duì)MAPK/MEK活化和細(xì)胞增殖。結(jié)論：Hsp72在HCV感染的HCC中過(guò)度表達(dá)通過(guò)激活MEK/ERk1/2而促進(jìn)細(xì)胞增殖。應(yīng)該重視Hsp72在治療HCV感染的HCC患者中的作用及其重要性。

肝炎病毒C； 熱激蛋白72； 肝癌細(xì)胞； 增 殖

肝炎病毒C(HCV)通?？梢猿掷m(xù)感染患者而引起慢性肝炎，慢性間質(zhì)性肝炎和肝癌是全球性的健康問(wèn)題。然而，HCV引起肝細(xì)胞致癌的詳細(xì)機(jī)制和病毒感染腫瘤的過(guò)程依然不清楚。熱激蛋白(Hsp)家族是細(xì)胞內(nèi)高度保守的蛋白質(zhì)分子，是細(xì)胞凋亡和蛋白平衡過(guò)程中主要的分子伴侶和生化調(diào)節(jié)劑[1]。HSPs廣泛的在人類(lèi)腫瘤包括乳腺癌、卵巢癌、結(jié)腸癌、肺癌和前列腺癌中過(guò)量表達(dá)[2]。研究顯示，Hsp72在腫瘤組織中表達(dá)強(qiáng)烈，并可作為檢測(cè)腫瘤的生物標(biāo)志物，尤其是肝癌[3～7]。體外研究揭示，HCV編碼的蛋白和Hsp72相互作用能增加HCV擾亂細(xì)胞增殖或者損害DNA損傷后細(xì)胞的反應(yīng)[8,9]。本研究中，我們檢測(cè)了經(jīng)病毒感染后的細(xì)胞系和HCV感染的肝活組織檢查樣本中的Hsp72的表達(dá)，研究Hsp72對(duì)感染HCV的肝癌細(xì)胞系的生長(zhǎng)和增殖的影響,并闡明其可能的機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 患者材料及檢測(cè)指標(biāo)

1.1.1 肝炎患者材料：本實(shí)驗(yàn)使用的血清樣本來(lái)32例感染基因型為1a/1b的HCV慢性肝炎患者。這些患者均未接受過(guò)化療。另外20例血樣樣本來(lái)自上海長(zhǎng)征醫(yī)院的志愿者，并且HCV檢測(cè)為陽(yáng)性。肝臟樣本來(lái)自福州軍區(qū)總醫(yī)院2010年至2013年間接受過(guò)肝臟活組織檢查的感染慢性肝炎病毒C的患者(n=8)。未感染HBV、HCV或者HIV的肝轉(zhuǎn)移瘤作為對(duì)照組(n=3)。臨床和病理檢查結(jié)果信息來(lái)自患者體格檢查和病理報(bào)告(表1)。所有研究均獲得患者同意并且簽字。正常肝組織樣本取自有轉(zhuǎn)移腫瘤肝葉周?chē)恼＝M織。實(shí)驗(yàn)方案由長(zhǎng)征醫(yī)院和福州軍區(qū)總醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

表1 感染HCV患者臨床和病毒學(xué)參數(shù)

注：M,男性;F,女性。正常范圍:ALT,5-50U/L;AST,8-40U/L

1.1.2 檢測(cè)指標(biāo)及方法：用免疫吸收劑分析試劑盒(ELISA)(Xinfan Biotechnology, 上海)檢測(cè)HCV感染患者血清中Hsp72的表達(dá)。用多克隆抗體對(duì)Hsp72進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。肝組織片段切成4μm厚度，用濃度遞減的乙醇進(jìn)行脫水。微波加熱20min回收10nM檸檬酸鈉緩沖液(pH 6.0)中的抗原。組織片段用3%過(guò)氧化氫孵化阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化酶的活性，然后用1%BSA/PBS稀釋的一抗孵化。一抗孵化后，使用生物素標(biāo)記的二抗孵育，接著用ABC(抗生物素-生物素-過(guò)氧化酶復(fù)合物技術(shù))方法進(jìn)行檢測(cè)。

1.2 細(xì)胞系及檢測(cè)指標(biāo)

1.2.1 細(xì)胞系：Huh7.5.1是Huh7細(xì)胞HCV高感染的亞克隆細(xì)胞系，培養(yǎng)條件為：含10%胎牛血清(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)的DMEM培養(yǎng)基，在37℃，5% CO2的培養(yǎng)箱下培養(yǎng)。

1.2.2 檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.2.2.1 Huh7.5.1細(xì)胞感染：感染HCV的Huh7細(xì)胞(HCVcc)培養(yǎng)過(guò)程參照先前研究描述[10]。將含有全長(zhǎng)嵌合基因組cDNA的HCV J6和JFH1的pFLJ6/JFH1質(zhì)粒線(xiàn)性化，并作為模板用MEGAscript試劑盒(Promega)體外進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。用電穿孔的方法將體外轉(zhuǎn)錄的RNA轉(zhuǎn)到Huh7.5.1細(xì)胞中。通過(guò)收集轉(zhuǎn)染后8和18d的上清獲取病毒并且分裝保存在-80℃。參照先前研究中免疫染色的方法檢測(cè)Huh7.5.1細(xì)胞中的病毒滴度。Huh7.5.1細(xì)胞種植到24-孔板中，過(guò)夜培養(yǎng)，每孔加入50μL 5×105ffu/mL 的HCVcc上清，培養(yǎng)5h后除去上清，并用培養(yǎng)基清洗5次，最后用新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。siRNA處理組，經(jīng)HCVcc感染后第1天，細(xì)胞中分別加入20 nM目標(biāo)siRNA和陽(yáng)性對(duì)照siRNA進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。

1.2.2.2 siRNA的準(zhǔn)備和轉(zhuǎn)染：Hsp72siRNA，NFAT5 siRNA和陽(yáng)性對(duì)照siRNA (si NC )購(gòu)自Santa Cluz 生物技術(shù) (Santa Cruz, CA, USA)。用FUGeneHD轉(zhuǎn)染試劑(Roche, Indianapolis, IN, USA)按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

1.2.2.3 實(shí)時(shí)定量PCR：用Trizol 試劑(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)按照說(shuō)明書(shū)操作分離得到總RNA。PCR得到RNA質(zhì)量的最低要求為A260 nm/A280 nm比值為1.9，28S/18S 比值為1.8。將2 μg總RNA用SuperScript Ⅲ 第一鏈合成系統(tǒng)帶有特異性反向引物或者Oligo (dT) (Invitrogen)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。用SYBR RT-PCR試劑盒 (Takara, Shiga, Japan)進(jìn)行擴(kuò)增。在96孔板中95℃孵育反應(yīng)5 min，接著95℃15 s 和 60℃1 min循環(huán)40次。在StepOne Plus 實(shí)時(shí)定量PCR儀 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)中進(jìn)行PCR反應(yīng)，用SDS v2.3軟件收集數(shù)據(jù)。β-actin作為內(nèi)標(biāo)。

1.2.2.4 Western蛋白印跡：在蛋白酶抑制劑cocktail (Complete mini, Roche)中加入含0.5%SDS的改良緩沖液用于提取Huh7.5.1細(xì)胞蛋白，將25mg細(xì)胞蛋白加入SDS-PAGE凝膠中進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用5%非脂牛奶進(jìn)行封閉，將膜放入一抗中4℃條件下過(guò)夜孵育，然后用HRP-偶聯(lián)羊抗兔或者羊抗鼠抗體 (1:10000 稀釋, KPL, Gaithersburg, MA,USA)室溫孵育1h。最后用Super Signal West Pico 化學(xué)發(fā)光底物 (Pierce)激發(fā)信號(hào)，在Gene Gnome HR 圖像撲捉系統(tǒng) (Syngene, Frederick, MD, USA)進(jìn)行觀(guān)察， Gene tools (Syngene) 進(jìn)行分析。一抗是：Hsp72, NFAT5, HSF1, RAF, phosphor-RAF(p-RAF), MEK, p-MEK, ERK1/2 和 p-ERK1/2 多克隆抗體 (Abcam, MA) 和 β-actin 單克隆抗體 (ImmunoGen, 上海，中國(guó))。

1.2.2.5 細(xì)胞增殖分析：siRNA在6-孔板中轉(zhuǎn)染細(xì)胞24h后，細(xì)胞重懸并接種到96-孔板，每孔1×104個(gè)，然后每孔加入10 μL 5mg/mL的MTT，37℃培養(yǎng)4 h后除去培養(yǎng)基，每孔加入100 μL DMSO，孵育10min，用微板閱讀儀(Model 550, Bio-Rad, Richmond, CA)讀取每孔細(xì)胞的吸光率。用重組Hsp72(Sigma)評(píng)價(jià)Hsp72對(duì)細(xì)胞增殖的影響和相關(guān)是信號(hào)通路。PD98095(Sigma)是MAP激活酶選擇抑制劑，用于抑制MEK/ERK信號(hào)通路。細(xì)胞用20μM PD98095預(yù)處理，然后用5μg/mL rHsp72孵育。

1.2.2.6 傷口愈合分析：將感染HCV J6/JFH1的Huh7.5.1 細(xì)胞接種到6-孔板中(2×105/孔)培養(yǎng)2d。確認(rèn)細(xì)胞鋪滿(mǎn)板底后，用塑料片在培養(yǎng)板上劃痕，立刻清洗掉殘?jiān)?，顯微鏡下觀(guān)察并拍照。然后37℃培養(yǎng)48 h，觀(guān)察細(xì)胞并顯微鏡下拍照[11]并計(jì)算細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的距離。傷口愈合計(jì)算方法：(劃痕寬度的平均值-剩下寬度的平均值)/劃痕寬度的平均值

1.2.2.7 細(xì)胞周期分析：處理48h后，用胰酶消化細(xì)胞后，每組收集2×106細(xì)胞用PBS洗2次，用冷70%乙醇在4℃下過(guò)夜固定。然后用PBS清洗細(xì)胞一次，用200μL RNase (1 mg/mL) 37℃消化30 min，在用800 μL碘化丙啶(50 μg/mL)室溫下染色30min，最后用EPICS Elite ESP 流式細(xì)胞儀(USA)分析細(xì)胞周期。

2 結(jié) 果

2.1 HCV感染上調(diào)Hsp72的表達(dá)：為了評(píng)價(jià)HCV感染后對(duì)Hsp72的表達(dá)作用，我們用ELISA的方法評(píng)價(jià)了32例來(lái)自臨床慢性HCV感染患者血清中的Hsp72水平。20例健康患者血清作為對(duì)照用于比較。與正常相比，患者血清中Hsp72水平顯著增加(圖1-a)。實(shí)時(shí)定量PCR分析感染HCV的肝組織活檢樣本中Hsp72mRNA水平。8例中有5例肝組織活檢樣本Hsp72mRNA水平(>3倍)顯著高于正常肝組織(圖1-b)，用柱形圖(圖1-c)比較對(duì)照組和HCV感染組肝組織活檢樣本中mRNA表達(dá)水平的平均值進(jìn)一步證明與前面結(jié)果一致。接下來(lái)，我們用免疫組化染色評(píng)價(jià)HCV感染后Hsp72的表達(dá)情況。8例患者有6例患者肝細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)Hsp72聚集，而對(duì)照組肝臟中只檢測(cè)到一點(diǎn)。在HCV感染患者的肝臟中，Hsp72定位主要在肝血竇和分散在肝葉的單個(gè)肝細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)里(圖1-d)。

為了證明Hsp72上調(diào)是否與HCV感染有關(guān)，對(duì)感染HCVcc J6/JFH1的細(xì)胞系Huh7.5.1中Hsp72的表達(dá)進(jìn)行評(píng)價(jià)。收集不同時(shí)間點(diǎn)感染HCVcc的Huh7.5.1細(xì)胞，用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)Hsp72 的表達(dá)。在感染24h后Hsp72 的表達(dá)穩(wěn)定增加(圖1-e)。相反，沒(méi)有感染組的Hsp72表達(dá)在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中沒(méi)有顯著的變化(數(shù)據(jù)沒(méi)有列)。Western蛋白印記法分析結(jié)果同樣表明，Huh7.5.1感染HCVcc后每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的Hsp72均過(guò)量表達(dá)(圖1-f)。以上結(jié)果表明，HCV感染能上調(diào)Hsp72的表達(dá)。

圖1 HCV感染上調(diào)Hsp72表達(dá)

(a) 比較感染HCV患者血清 (n=32) 與正常血清 (n=20) 中總Hsp72 的表達(dá)情況。 (b和c) 用實(shí)時(shí)定量PCR的方法比較感染HVC肝臟活組織檢查樣本與未感染HCV對(duì)照肝臟組織樣本 (C1-3) 中Hsp72 mRNA 表達(dá)情況。(d) 感染HCVcc J6/JFH1的Huh7.5.1細(xì)胞Hsp72免疫組化染色結(jié)果。(e) 感染HCVcc J6/JFH1 的Huh7.5.1細(xì)胞中Hsp72 mRNA 表達(dá)情況。(f) 感染HCVcc J6/JFH1的Huh7.5.1細(xì)胞中Hsp72蛋白表達(dá)情況。***P<0.001

2.2 HCV通過(guò)誘導(dǎo)NFAT5增加Hsp72 的表達(dá)：Hsp72的表達(dá)的是由HSF1和NFAT5轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控[12]。為了調(diào)查這兩個(gè)因子是否參與HCV感染增加Hsp72 的表達(dá)，我們分析了感染HCVcc的肝癌細(xì)胞中NFAT5和HSF1蛋白表達(dá)水平。我們發(fā)現(xiàn)NFAT5水平增加，而HSF1總蛋白水平卻沒(méi)有改變(圖2-a)，并且NFAT5mRNA的水平也顯著增加(圖2-b)。為了進(jìn)一步證明在NFAT5依賴(lài)轉(zhuǎn)錄激活中Hsp72水平是否由HCV的調(diào)控，對(duì)模擬感染和HCVcc感染的細(xì)胞轉(zhuǎn)染抗NFAT5 siRNA敲出內(nèi)源性NFAT5。NFAT5沉默后，不但NFAT5mRAN的水平減少而且Hsp72mRNA的水平也減少圖 (2-c) 。同時(shí)HCVcc感染細(xì)胞中Hsp72 蛋白水平上調(diào)也在NFAT5沉默后降低(圖2-d)，這說(shuō)明，HCV感染后通過(guò)誘導(dǎo)NFAT5上調(diào)Hsp72的表達(dá)。

圖2 HCV通過(guò)誘導(dǎo)NFAT5增加Hsp72表達(dá)水平

(a) Western blot 分析感染HCVcc的Huh7.5.1細(xì)胞溶解物中NFAT5 和HSF1 的表達(dá)情況。(b) NFAT5 mRNA 表達(dá)情況。 (c) NFAT5 siRNA下調(diào)NFAT5和Hsp72 mRNA 的表達(dá)。 (d) Huh7.5.1轉(zhuǎn)染NFAT5 siRNA后Hsp72蛋白表達(dá)情況。 *P<0.05

2.3 Hsp72沉默抑制HCV感染人肝癌細(xì)胞的增殖：Hsp72涉及腫瘤發(fā)生并可能通過(guò)各種致瘤產(chǎn)物相互作用介導(dǎo)致瘤性蛋白的形成，最后促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖。用細(xì)胞增殖來(lái)評(píng)價(jià)感染HCV的HCC中Hsp72過(guò)量表達(dá)的意義。細(xì)胞層傷口愈合實(shí)驗(yàn)表明，HCVcc感染細(xì)胞敲出Hsp72后傷口愈合的恢復(fù)比轉(zhuǎn)染對(duì)照siRNA的細(xì)胞慢(圖3-a、b)。此外，用MTT評(píng)價(jià)細(xì)胞增殖情況。經(jīng)Hsp siRNA敲出Hsp72后，細(xì)胞增殖顯著降低(圖3-c)。接著，考察Hsp72過(guò)量表達(dá)對(duì)細(xì)胞周期的影響。如表3-c所示，Hsp72顯著抑制G1/S期。流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果顯示，G2和S期細(xì)胞百分比降低，G0/G1期細(xì)胞百分比增加。而這些發(fā)現(xiàn)在對(duì)照中卻沒(méi)有出現(xiàn)。

圖3 Hsp72 沉默抑制感染HCV的Huh7.5.1細(xì)胞增殖并且是細(xì)胞周期阻滯在S期

(a) 轉(zhuǎn)染48h后熒光顯微鏡下觀(guān)察EDU標(biāo)記的復(fù)制細(xì)胞。(b)EDU陽(yáng)性細(xì)胞百分比。(c)轉(zhuǎn)染48h后流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期分別情況。(d)細(xì)胞周期結(jié)果圖譜。*P<0.05,**P<0.001

2.4 Hsp72通過(guò)激活MEK/ERK信號(hào)通路誘導(dǎo)HCV感染肝癌細(xì)胞增殖：為了確定Hsp72誘導(dǎo)了哪條信號(hào)通路而促進(jìn)細(xì)胞增殖，HCV感染的肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染Hsp72 siRAN或者siNC后，檢測(cè)細(xì)胞蛋白中RAF, MEK, phosphor-MEK (p-MEK), ERK1/2 和 p-ERK1/2的表達(dá)。結(jié)果表明RHsp72顯著誘導(dǎo)細(xì)胞增值和p-MEK的表達(dá)(圖4-a、b)，Hsp72敲除后顯著下調(diào)p-MEK和p-MEK1/2的表達(dá)(圖4-a)。通過(guò)在細(xì)胞中加入MEK抑制劑PD98095來(lái)研究MEK/ERK1/2通路參與的過(guò)程。PD98095能顯著減少rHsp72誘導(dǎo)的HCV感染后Huh7.5.1細(xì)胞的增加(圖4-c)。這些結(jié)果說(shuō)明MEK/ERK1/2信號(hào)通路介導(dǎo)Hsp72誘導(dǎo)HCV感染后的肝癌細(xì)胞增殖。

圖4 MEK/ERK信號(hào)通路參與Hsp72誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖。

(a)處理24h后CK8分析不同劑量rHSP72對(duì)細(xì)胞增殖的影響。(b)處理60h后RAF,MEK,ERK1/2蛋白表達(dá)水平和其磷酸化形式(對(duì)照,5μg/mL rHsp72,陽(yáng)性對(duì)照siRNA和20nM Hsp72 siRNA)。(c)細(xì)胞經(jīng)5μg/mL rHsp72 或者20μM MEK 抑制劑(PD98095)孵育24h后 CCK8 分析表明，Hsp72誘導(dǎo)細(xì)胞增值是由MEK/ERK1/2信號(hào)通路介導(dǎo)的。。*P<0.05, ** P<0.01

3 討 論

熱激蛋白能防止蛋白經(jīng)過(guò)熱激或者其他刺激后變性[13]。HCV感染能引起細(xì)胞應(yīng)答包括應(yīng)激反應(yīng)蛋白如Hsp72。本研究發(fā)現(xiàn)，慢性感染HCV患者的血清及肝活組織檢查樣本中Hsp72均顯著增加。同時(shí)，對(duì)感染HCV的肝細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)細(xì)胞中Hsp72的表達(dá)也顯著增加。Hsp72的表達(dá)是受兩種不同的轉(zhuǎn)錄因子HSF1和NFAT5調(diào)控。我們發(fā)現(xiàn)HSF1蛋白水平不受HCV感染的影響。然而，NFAT5蛋白水平和mRNA水平卻顯著增加。將NFAT5沉默后，Hsp72表達(dá)水平顯著降低。結(jié)果說(shuō)明，經(jīng)HVC感染后，Hsp72上調(diào)是受NFAT5誘導(dǎo)介導(dǎo)的。

眾所周知Hsp72是細(xì)胞內(nèi)分子伴侶，協(xié)助細(xì)胞中蛋白折疊特別是在應(yīng)激的時(shí)候[14]。在對(duì)應(yīng)激和損傷應(yīng)答時(shí)，Hsp72可能會(huì)從已經(jīng)溶解的細(xì)胞和通過(guò)受體介導(dǎo)胞吐作用從肝臟細(xì)胞中釋放出來(lái)[15]。很多體內(nèi)外研究已經(jīng)證明細(xì)胞外Hsp72可能擔(dān)任應(yīng)激應(yīng)答的調(diào)節(jié)子[16-19]。一些研究認(rèn)為，Hsp72涉及到腫瘤的發(fā)生，并且可能與一些致瘤產(chǎn)物(c-myc,p53,scr,c-fos,Rb)相互作用而調(diào)節(jié)致瘤蛋白的構(gòu)成，最后促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖[20-23]。另外，Hsp72被證明能是大量刺激引起凋亡的蛋白抑制劑[24]。癌組織細(xì)胞中大量表達(dá)Hsp72可能會(huì)使細(xì)胞抵抗環(huán)境應(yīng)激而提高活性。

本研究證明，感染HCV后Hsp72過(guò)度表達(dá)能促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖。將Hsp72沉默后，HCV感染的Huh7.5.1細(xì)胞增殖顯著被抑制，G0/G1期細(xì)胞數(shù)量也顯著增加，G2期和S-期細(xì)胞數(shù)量顯著降低。細(xì)胞周期在調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和凋亡中起著重要的作用。目前研究[25]已經(jīng)提出，HSPs可能通過(guò)與某些原癌基因產(chǎn)物結(jié)合參與細(xì)胞生成和增殖從而調(diào)節(jié)一些如信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)或者細(xì)胞周期的進(jìn)程。Hsp72是細(xì)胞進(jìn)入S期的必需蛋白。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Hsp72沉默誘導(dǎo)HCV感染的Huh7.5.1細(xì)胞滯留在G0/G1期，從而不能進(jìn)入S期。這些結(jié)果證明，Hsp72和HCV-HCC之間的功能和機(jī)制關(guān)系，強(qiáng)調(diào)Hsp72在HCV-HCC分子病因方面對(duì)惡性增殖調(diào)控的重要作用。

Hsp72在保護(hù)細(xì)胞免受損失調(diào)節(jié)的各種靶點(diǎn)包括Bax，細(xì)胞色素C釋放，磷脂酶A2抑制劑和p38/MAPK與細(xì)胞增殖有關(guān)[26]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，MEK/ERK1/2信號(hào)通路參與Hsp72誘導(dǎo)HCV感染后的肝癌細(xì)胞的增殖。Hsp72敲出后，p-MEK和P-ERK1/2表達(dá)水平顯著下調(diào)。加入抑制劑PN98095后，rHSp72誘導(dǎo)的經(jīng)HCVcc感染的Huh7.5.1細(xì)胞增殖也減少?？傊?，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，Hsp72通過(guò)MEK/ERK信號(hào)通路促進(jìn)HCV感染的肝癌細(xì)胞增殖。然而，我們也應(yīng)該考慮HCV對(duì)MEK/ERK信號(hào)通路的直接影響。我們之前的報(bào)告提出，HCV蛋白能通過(guò)沿著信號(hào)通路的多個(gè)步驟介導(dǎo)MAPK(ERK)信號(hào)。說(shuō)明，HCV E2蛋白激活MAPK(ERK)通路促進(jìn)人肝癌細(xì)胞Huh7細(xì)胞增殖。最近研究提出，Hsp72可能直接通過(guò)磷酸化作用激活MEK/ERK1/2。我們之前的報(bào)告沒(méi)有描述上游刺激因子表達(dá)，也有可能HCV蛋白通過(guò)激活各種刺激因子調(diào)節(jié)MAPK(ERK)通路，包括Hsp72。正如該研究報(bào)告，我們進(jìn)一步闡明了Hsp72參與MEK/ERK1/2信號(hào)通路，并且促進(jìn)HCV感染的肝癌細(xì)胞增殖。

綜上所述，最近研究結(jié)果證明，Hsp72在HCV感染的肝癌細(xì)胞中過(guò)度表達(dá)可以通過(guò)激活MEK和Erk1/2促進(jìn)細(xì)胞增殖。Hsp72過(guò)度表達(dá)的結(jié)果對(duì)感染HCV的HCC患者的治療有負(fù)影響。Hsp72過(guò)度表達(dá)可以作為治療感染HCV的HCC患者的潛在靶標(biāo)，以后的研究將研究該可能性。

[1] Morimoto RI. Cells in stress: transcriptional activation of heat shock genes[J].Science,1993,259: 1409～1410.

[2] Ciocca DR, Calderwood SK. Heat shock proteins in cancers: diagnostic, prognostic, predictive, and treatment implications[J].Cell Stress Chaperones,2005,10: 86～103.

[3] Zhang L, Fok JJ, Mirabella F, et al. Hsp70 inhibition induces myeloma cell death via the intracellular accumulation of immunoglobulin and the generation of proteotoxic stress[J].Cancer Lett,2013,339: 49～59.

[4] Wang XP, Wang QX, Lin HP, et al.Significance of clinicopathology and expression of heat shock protein 72 and glycoprotein 96 in human hepatocellular carcinomas[J].Afr Microbiol Res,2011,5:5607～5614.

[5] Romanucci M, D'Amato G, Malatesta D, et al.Heat shock protein expression in canine osteosarcoma[J].Cell Stress Chaperones,2012,17:131～138.

[6] Szondy K, Rusai K, Szabó AJ, et al.Tumor cell expression of heat shock protein (HSP) 72 is influenced by HSP72 [HSPA1B A(1267)G] polymorphism and predicts survival in small Cell lung cancer (SCLC) patients[J].Cancer Invest,2012,30: 317～322.

[7] Aghdassi A, Phillips P, Dudeja V, et al.Heat shock protein 70 increases tumorigenicity and inhibits apoptosis in pancreatic adenocarcinoma[J].Cancer Res,2007,67: 616～625.

[8] Chen YJ, Chen YH, Chow LP, et al.Heat shock protein 72 is associated with the hepatitis C virus replicase complex and enhances viral RNA replication[J].Biol Chem,2010,285: 28183～2890.

[9] Lim YS, Shin KS, Oh SH, et al.Nonstructural 5A protein of hepatitis C virus regulates heat shock protein 72 for its own propagation[J].Viral Hepat,2012,19: 353～363.

[10] Lindenbach BD, Evans MJ, Syder AJ, et al.Complete replication of hepatitis C virus in cell culture[J].Science,2005,309:623～266.

[11] Ohta H, Hamada J, Tada M, et al.HOXD3-overexpression increases integrin alpha v beta 3 expression and deprives E-cadherin while it enhances cell motility in A549 cells[J].Clin Exp Metastasis,2006,23: 381～390.

[12] Woo SK, Lee SD, Na KY, et al.TonEBP/NFAT5 stimulates transcription of HSP70 in response to hypertonicity[J].moL Cell Biol,2002,22: 5753～5760.

[13] Bukau B, Weissman J, Horwich A. moLecular chaperones and protein quality control[J].Cell,2006,125:443～451.

[14] Shiber A, Ravid T. Chaperoning Proteins for Destruction: Diverse Roles of Hsp70 Chaperones and their Co-Chaperones in Targeting Misfolded Proteins to the Proteasome[J].BiomoLecules,2014,4: 704～724.

[15] Asea A. Mechanisms of HSP72 release[J].Bio sci,2007,32: 579～584.

[16] Luo X, Tao L, Lin P, et al.Extracellular heat shock protein 72 protects schwann cells from hydrogen peroxide-induced apoptosis[J].Neurosci Res,2012,90: 1261～1269.

[17] Krause M, Keane K, Rodrigues-Krause J, et al.Elevated levels of extracellular heat-shock protein 72 (eHSP72) are positively correlated with insulin resistance in vivo and cause pancreatic β-cell dysfunction and death in vitro[J].Clin Sci (Lond),2014,126: 739～752.

[18] Ogawa K, Kim HK, Shimizu T, et al.Plasma heat shock protein 72 as a biomarker of sarcopenia in elderly people[J].Cell Stress Chaperones,2012,17: 349～359.

[19] Luo X, Zuo X, Mo X, et al.Treatment with recombinant Hsp72 suppresses collagen-induced arthritis in mice[J].Inflammation,2011,34: 432～439.

[20] Meng L, Hunt C, Yaglom JA, et al.Heat shock protein Hsp72 plays an essential role in Her2-induced mammary tumorigenesis[J].Oncogene,2011,30: 2836～2845.

[21] Bonvini P, Zorzi E, Mussolin L, et al.Consequences of heat shock protein 72 (Hsp72) expression and activity on stress-induced apoptosis in CD30+ NPM-ALK+ anaplastic large-cell lymphomas[J].Leukemia,2012,26: 1375～1382

[22] Isomoto H, Oka M, Yano Y, et al.Expression of heat shock protein (Hsp) 70 and Hsp 40 in gastric cancer[J].Cancer Lett,200,198:219～228.

[23] Thanner F, Sütterlin MW, Kapp M, et al.Heat-shock protein 70 as a prognostic marker in node-negative breast cancer[J].Anticancer Res,2003,23:1057～1062.

[24] Cheng L, Smith DJ, Anderson RL, et al.Modulation of cellular Hsp72 levels in undifferentiated and neuron-like SH-SY5Y cells determines resistance to staurosporine-induced apoptosis[J].PLoS One,2011,6: e24473.

[25] Nyman U, Muppani NR, Zhivotovsky B, et al.Hsp72 mediates TAp73α anti-apoptotic effects in small cell lung carcinoma cells[J].Cell moL Med,2011,15: 1757～1768.

[26] Asea A. Stress proteins and initiation of immune response: chaperokine activity of hsp72[J].Exerc Immunol Rev,2005,11: 34～45.

Over-expression of Hsp72 Induced by Hepatitis C virus: Role of Hsp72 in Proliferation of Hepatocellular Carcinoma with HCV Infection

WANGXi,etal

(InstituteforFoodandDrugControlinShanghai,Shanghai201203,China)

Objective:To investigate the expression of Heat shock protein 72(Hsp72) in HCV infection and its role on the growth and proliferation of hepatocellular carcinoma cells with hepatitis C virus (HCV) infection. Methods: Sera and liver biopsy specimens from patients chronically infected with HCV were obtained for analysis of Hsp72 expression by ELISA, quantitative PCR and immunohistochemical staining. Hepatocytes upon infection with cell culture-grown HCV J6/JFH1 were used to investigate the role of over-expressed Hsp72 in proliferation of hepatocellular carcinoma cell with HCV infection by siRNA and cell proliferation assays. Results: Hsp72 expression was significantly upregulated in HCV infection. HCV increases Hsp72 expression level via induction of NFAT5. Hsp72 promotes proliferation of human hepatocellular carcinoma cells with HCV infection. The MAPK/MEK activation and cell proliferation driven by Hsp72 were suppressed by MEK inhibitor PD98095. Conclusions: The over-expressed of Hsp72 in HCV related HCC contributes to cell proliferation by activating MEK/Erk1/2. The role of Hsp72 and its importance for elimination of HCV in patients with HCC needs to take into account.

Hepatitis virus C; Heat shock protein 72; Hepatocellular carcinoma; Proliferation

1006-6233(2017)04-0645-06

上海市2015年度“科技創(chuàng)新行動(dòng)計(jì)劃”生物醫(yī)藥領(lǐng)域產(chǎn)學(xué)研醫(yī)合作項(xiàng)目,(編號(hào)：15DZ1940700)

A 【doi】10.3969/j.issn.1006-6233.2017.04.034