張 磊，柴強(qiáng)強(qiáng)，李潤成，黎滿香

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙410128）

一株副豬嗜血桿菌的鑒定及藥敏試驗(yàn)

張 磊，柴強(qiáng)強(qiáng)，李潤成，黎滿香※

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙410128）

湖南瀏陽地區(qū)某豬場(chǎng)發(fā)生保育豬急性死亡，臨床癥狀為咳嗽、消瘦和被毛粗亂，剖檢可見多發(fā)性漿膜炎和關(guān)節(jié)炎等病變。取3份死亡豬的肺臟做細(xì)菌鑒定及藥敏試驗(yàn)，根據(jù)臨床癥狀、病理變化、顯微鏡鏡檢和16S rDNA結(jié)果,確定分離到副豬嗜血桿菌。藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，該菌對(duì)丁胺卡那、大觀霉素、頭孢類藥物相對(duì)敏感。

副豬嗜血桿菌；病原鑒定；16S rDNA；藥敏試驗(yàn)

副豬嗜血桿菌?。ɑ蚍Q格拉斯病）是由副豬嗜血桿菌(Haemophilus parasuis,Hps)引起的豬的一種以多發(fā)性漿膜炎和關(guān)節(jié)炎為特征的疾病,主要臨床癥狀為咳嗽、消瘦、跛行和被毛粗亂等，多感染斷奶豬和保育豬,常見于5～8周齡，發(fā)病率一般為15%左右[1]。該病經(jīng)常與豬繁殖與呼吸綜合征、圓環(huán)病毒等免疫抑制性疾病混合感染,給全球的養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[2]。

1 材料與方法

1.1 病料

病料為湖南瀏陽地區(qū)某豬場(chǎng)急性死亡的3頭保育豬的肺臟。

1.2 培養(yǎng)基及試劑

胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基（TSB）（Sigma公司）；巧克力瓊脂培養(yǎng)基（江門市凱林貿(mào)易有限公司）；藥敏紙片（杭州天和微生物試劑有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)菌分離

無菌剪取0.5g肺臟組織，放入裝有無菌鋼珠的離心管，勻漿6分鐘后加入TSB，充分混勻。取20 μL培養(yǎng)液涂抹于巧克力瓊脂培養(yǎng)基，放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。

1.3.2 染色鏡檢

取分離到的單菌落進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢，觀察細(xì)菌的染色特性及形態(tài)。

1.3.3 PCR鑒定

挑取巧克力瓊脂培養(yǎng)基上的單菌落作模板，利用細(xì)菌16S rDNA通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增[3]，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送金斯瑞生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

1.3.4 藥敏試驗(yàn)

將培養(yǎng)好的菌液稀釋后用棉簽均勻涂布于巧克力瓊脂培養(yǎng)基，選取13種藥敏試紙片貼于平板上（詳見表1），放入37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h，判定藥敏試驗(yàn)結(jié)果。判定標(biāo)準(zhǔn)：抑菌圈直徑＜15mm為低度敏感；15mm～25mm為中度敏感；＞25 mm為高度敏感。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)與形態(tài)觀察

該菌株在巧克力瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)48h后，長(zhǎng)出邊緣整齊、圓形、灰白色透明、針尖大小的菌落。挑取單菌落涂片染色鏡檢，可見多數(shù)呈細(xì)小短桿狀，有的呈細(xì)小長(zhǎng)桿狀的革蘭氏陰性菌，其生長(zhǎng)特性及菌落形態(tài)符合副豬嗜血桿菌特征。

2.2 PCR鑒定結(jié)果

將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，目的片段大小約1500bp，結(jié)果顯示為陽性（見圖1）。測(cè)序結(jié)果在Genbank上進(jìn)行分析，結(jié)果顯示該菌與副豬嗜血桿菌的同源性達(dá)到99%，進(jìn)一步證實(shí)該菌株為副豬嗜血桿菌。

圖1 細(xì)菌通用引物16SrDNA檢測(cè)結(jié)果

2.3 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明該菌對(duì)丁胺卡那、大觀霉素、頭孢類藥物相對(duì)敏感。（詳見表1）。

表1 分離菌的藥敏試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

本試驗(yàn)對(duì)3份急性死亡的病豬肺臟進(jìn)行鑒定，確定分離到副豬嗜血桿菌。在通過結(jié)合分離菌株的藥敏試驗(yàn)結(jié)果科學(xué)用藥后，該豬場(chǎng)病情得到顯著控制。目前，大多采用疫苗對(duì)豬副嗜血桿菌病進(jìn)行防制，但副豬嗜血桿菌的血清型較多，且不同血清型之間無交叉保護(hù)力，若隨意使用商品化疫苗，將無法有效控制副豬嗜血桿菌病。因此，副豬嗜血桿菌病的綜合防制除加強(qiáng)飼養(yǎng)管理、定期徹底消毒和抗菌素處理外，還應(yīng)精準(zhǔn)化免疫接種。 □

[1]劉俊偉，安志興，葛亞明，等.副豬嗜血桿菌河南株的分離鑒定及藥敏試驗(yàn)[J].西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2011，(2):37-39.

[2]蔡旭旺.副豬嗜血桿菌的分離鑒定及診斷方法與滅活疫苗的研究[D].華中農(nóng)業(yè)大學(xué),2006.

[3]黎滿香，林榮高，薛立群，等.湖南豬源糞腸球菌的分離鑒定及16S rDNA系統(tǒng)進(jìn)化分析[J].中國獸醫(yī)學(xué)報(bào),2011，(9):1290-1294.

S852.6

A

1006-4907（2017）02-0035-02

10.3969/j.issn.1006-4907.2017.02.016

2017-04-05

湖南科技計(jì)劃項(xiàng)目（2015NK3017）

張磊（1991～），女，碩士在讀，從事預(yù)防獸醫(yī)學(xué)研究。

※通訊作者：黎滿香，E-mail：manxiangl@163.com。