龐永冰，王琳琳＊，校晗

(菏澤醫(yī)學專科學校，山東菏澤274000;*嘉祥縣人民醫(yī)院，山東嘉祥272400）

陰莖海綿神經損傷采用蠶絲蛋白膜聯合神經生長因子修復實驗研究

龐永冰，王琳琳＊，校晗

(菏澤醫(yī)學?？茖W校，山東菏澤274000;*嘉祥縣人民醫(yī)院，山東嘉祥272400）

目的探討陰莖海綿體內損傷結合絲素蛋白膜神經修復神經生長因子的療效。方法將36只雄性健康SD大鼠隨機分成三組，海綿體神經切斷組、絲素蛋白膜聯合神經生長因子組及絲素蛋白膜修復組。每組12只。海綿體神經切斷組大鼠單純切斷雙側的海綿體神經，不做其他處理；對絲素蛋白膜聯合神經生長因子F組大鼠先制作海綿體神經缺損的模型，然后用絲素蛋白膜橋接進行修復，局部注入神經生長因子30 μl；絲素蛋白膜修復組僅用絲素蛋白膜對缺損的海綿體神經進行橋接修復；術后90天對三組大鼠進行：阿樸嗎啡試驗，計數SD大鼠陰莖勃起次數、勃起率。應用免疫組化方法檢測大鼠陰莖中后部海綿體組織中神經型一氧化氮合酶的表達。應用SPSS17.0軟件，所獲數據采用方差分析、t檢驗和χ2檢驗。結果陰莖勃起率A組與B組、A組與C組比較，P均＜0.005;B組與C組比較，P＞0.05。勃起次數A組與B組、A組與C組比較，P均＜0.0005;B組與C組比較，P＜0.001。對缺損的海綿體神經斷端進行橋接修復后將自制的神經生長因子90天后NOS神經纖維染色最為明顯。陽性纖維數目A組與B組、A組與C組、B組與C組數目比較，P均＜0.0005。結論絲素蛋白膜聯合神經生長因子對海綿體神經修復與再生具有明顯的促進作用，為海綿體神經缺損的臨床治療提供了新的方向及實驗依據。

絲素蛋白膜/治療應用；神經生長因子/治療應用；海綿體神經損傷/治療

前列腺癌的發(fā)病率在我國逐漸上升，成為男性常見的惡性腫瘤之一，目前對該病最好的治療方法仍然是前列腺癌根治手術，但在手術過程中，對前列腺的周圍神經血管的損傷是不可避免的，其中的海綿體神經被損傷后會導致患者出現勃起功能障礙（ED），使患者術后的生活質量下降。我們應用SD大鼠模擬外科手術對海綿體神經所形成的損傷，然后應用絲素蛋白膜(SF)聯合神經生長因子(NGF)對損傷進行修復，在手術后的90天對其修復效果進行評價?，F報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗分組36只健康SD雄性大鼠，體重180～260 g(解放軍第八十九醫(yī)院動物實驗中心提供)，隨機分為3組，每組12只。A組：海綿體神經切斷組；B組：SF聯合NGF組；C組：SF修復組。

1.2 實驗材料純度百分之百的絲素蛋白膜，剪成0.5 cm×0.8 cm備用；在牛精液中自行純化的N G F溶液，每毫升中約神經生長因子約1 mg。

1.3 實驗動物處理SD大鼠仰臥固定于實驗臺，用濃度為2.5%的戊巴比妥鈉（北京普博斯生物科技有限公司，P3761）按每公斤體重約40 mg～45 mg行腹腔麻醉。成功以后取下腹部正中切口，依次找到睪丸、精囊腺等組織，將這些盆腔組織進行外翻，在前列腺和直腸前外側壁間應用外科顯微鏡（徠卡顯微系統(tǒng)上海貿易有限公司，F40）尋找海綿體神經，找到了海綿體神經后進行游離，為證實其為海綿體神經可用自制的電極對該神經進行刺激，證實以后按照實驗分組處理。處理方法：A組大鼠先找到海綿體神經，然后將兩側的神經分別切除約8 mm左右，然后縫合切口，不做其它處理；B組大鼠將海綿體神經切除8 mm后，在外科手術顯微鏡底下用9-0的尼龍線將SF與海綿體神經的兩個斷端進行橋接修復；C組大鼠雙側海綿體神經被切除8 mm后以SF單純進行橋接修復。

1.4 實驗結果評定指標（1）阿樸嗎啡試驗：手術后90天，對各組大鼠進行阿樸嗎啡試驗，具體方法是在大鼠的頸部用自制阿樸嗎啡溶液(上海靜融生物科技有限公司，100839-200601)以每公斤體重150 μg進行注射，在注射后的30 min內對大鼠陰莖勃起情況進行觀察并計數勃起的次數。（2）免疫組化方法：計數神經性一氧化氮合酶神經纖維的數目：手術后90天，取實驗大鼠陰莖中后部的海綿體，將所得海綿體組織運用常規(guī)方法制成石蠟切片，將石蠟切片脫蠟后進行抗原的修復，修復后在室溫下用山羊血清封閉液(北京中杉金橋生物技術有限公司)封閉20 min，然后將封閉液甩掉，加1∶150濃度的一抗(快捷型酶標羊抗鼠/兔IgG聚合物,北京博奧森生物公司)，在4℃條件下過夜后用PBS進行沖洗，沖洗后加1：100的二抗(大鼠NOS1免疫組化試劑盒,北京博奧森生物技術有限公司)，后在室溫下進行20 min的孵育，孵育后應用PBS液進行沖洗，沖洗后滴加新配的DAB液，放在顯微鏡下進行觀察，大約10～20 min左右即發(fā)生著色，著色后立即進行沖洗，沖洗后用蘇木素進行復染，再進行一次脫水后用中性樹膠進行封片，最后將切片放在顯微鏡(BX51型生物光學顯微鏡及照相系統(tǒng),日本Olympus公司)下觀察被染成棕黃色的神經纖維，并在400×下隨機選取6個視野，對視野中陽性的神經性一氧化氮合酶陽性的神經纖維進行計數。

1.5 統(tǒng)計學處理應用SPSS17.0軟件，所獲數據采用方差分析、t檢驗和χ2檢驗。

2 結果

2.1 計數神經型一氧化氮合酶陽性神經纖維的數目見表1。

表1 一氧化氮合酶陽性神經纖維的數目比較（個

表1 一氧化氮合酶陽性神經纖維的數目比較（個

陽性纖維數目A組與B組、A組與C組、B組與C組，數目比較，t=67.008、25.738、8.9101,P均＜0.0005。

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2.2 阿撲嗎啡實驗A組大鼠在陰莖勃起次數、勃起率上明顯低于B組、C組，差別具有顯著性，B、C大鼠間的差別也有統(tǒng)計學意義。見表2。

2.3 免疫組化法觀察nNOS神經纖維染色結果術后90天，取各只大鼠陰莖海綿體中部海綿體組織進行免疫組織化學染色，nNOS陽性神經纖維被染成棕黃色，其中A組大鼠棕黃色神經纖維數明顯低B組和C組，B組亦明顯多于C。見圖1、圖2、圖3。

表2 三組阿撲嗎啡結果比較

表2 三組阿撲嗎啡結果比較

陰莖勃起率A組與B組、A組與C組比較，χ2=20.307、17.142，P＜0.005;B組與C組比較，χ2=0,P＞0.05。勃起次數A組與B組、A組與C組比較，t=8.2272、6.5206，P＜0.0005;B組與C組比較，t=3.6484，P＜0.001。

圖1 A組大鼠nNOS神經纖維染色結果

圖2 B組大鼠nNOS神經纖維染色結果

圖3 C組大鼠nNOS神經纖維染色結果

3 討論

神經生長因子是在20世紀50年代初被最早發(fā)現的神經營養(yǎng)因子，關于它的研究最為清楚，神經生長因子在維持神經系統(tǒng)的發(fā)育以及神經系統(tǒng)功能方面起著非常重要的作用。有研究表明[1]，神經生長因子在周圍神經的再生過程中起著重要的作用，其與神經再生的關系非常密切，在周圍神經損傷缺損處局部給予外源性神經生長因子，經過一系列的作用后最終會引起神經的功能、生理的變化[2]。當周圍神經發(fā)生損傷后，該神經的神經元將發(fā)生死亡等一系列的病理生理改變[3]，在神經損傷處給于外源性的神經生長因子，不僅可以保護神經元，防止神經元死亡，而且還可以促進突起的生長。損傷金魚的視神經，后在神經損傷局部給予外源性的神經生長因子，發(fā)現損傷的視神經的神經纖維在數量、長度上明顯增加，表明該因子具有促進神經纖維再生的作用，而且可以促進神經功能的恢復[4]。

絲素蛋白膜是一種純天然的高分子生物蛋白，它主要有丙氨酸、甘氨酸、絲氨酸組成，其有較好的化學、物理性能，而且具有良好的人體親和性[5]、生物相容性[6]、在體內可以發(fā)生生物降解[7]。近十幾年來國內外對絲素蛋白膜在人工血管[8]、藥物載體[9]、人工皮膚[10]、骨組織修復[11]，尿道修復[12]等方面進行了廣泛的研究，并獲得可觀的結果。在神經組織工程運用方面，國內外都有大量研究，在面神經的缺損上首先應用了絲素蛋白膜導管對缺損進行了修復，修復效果比較理想[13]。我們也曾運用絲素蛋白膜對大鼠的海綿體神經缺損進行修復的實驗研究，取得滿意結果。故絲素蛋白膜、神經生長因子在周圍神經損傷的修復上都有著一定的作用，本實驗應用絲素蛋白膜聯合神經生長因子對大鼠的海綿體神經缺損進行了修復，結果表明絲素蛋白膜聯合神經生長因子對大鼠海綿體神經的修復、再生具有明顯的促進作用，這為臨床上周圍神經的損傷修復提供新的治療方法和實驗依據。

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Sponge Nerve Injury Using Fibroin Membrane Joint Repair Nerve Growth Factor Experiments

Pang Yongbing,Wang Linlin?，Xiao Han
(Heze Medical College,Heze 274000,Shandong；*People's Hospital of Jiaxiang,Jiaxiang 272400,Shandong)

ObjectiveTo discuss Inside the penis sponge body damage combined with silk fibroin membrane the curative effect of nerve repair nerve growth factor.Methods36 healthy male SD rats were randomly divided into three groups,cavernous nerve cut group,the silk fibroin membrane joint nerve growth factor and silk fibroin membrane repair group.12 in each group.Cavernous nerve to cut off the set of simple cut bilateral cavernous nerve of rats,don't do other processing.Of silk fibroin membrane joint nerve growth factor group F rat cavernous nerve defect model,first and then use silk fibroin membrane bridge repair,30 μL local injection of nerve growth factor.Silk fibroin membrane repair group only with silk fibroin membrane for bridge repair the defect of the cavernous nerve.After 90 days on three groups of rats：apomorphine test,counting rate of SD rats penile erectile times,erectile.In the application of immunohistochemical method to detect the rat penis sponge tissue at the back of the nerves in the expression of nitric oxide synthase.The obtained data analyzed by variance,ttest andχ2test with the SPSS17.0 software.ResultsThe rate of penile erectile group A and group B, group A compared with group C,P＜0.005.Group B compared with group C,P＞0.05.Erectile times in group A and group B,group A compared with group C,P＜0.0005.Group B compared with group C,P＜0.001.To bridge the defect cavernous nerve end after repair will be homemade nerve growth factor 90 days NOS nerve fiber dyeing is most obvious.Number of positive fibers in group A and group B,group A and group C,group B compared with group C number,P＜0.0005.Con-clusionSilk fibroin membrane joint nerve growth factor of cavernous nerve repair and regeneration has an obvious role in promoting,for cavernous nerve defects and provides a new direction and experimental basis for clinical treatment.

Silk fibroin membrane/therapeutic use；Nerve growth factor/therapeutic use；Cavernous nerve injury/ therapy

R697.5

A

1008-4118（2017）01-0001-04

10.3969/j.issn.1008-4118.2017.01.001

2016-11-25