吳 雷 郭 華 高子云 胡尚偉 沈曉黎 郭 化 祝新根

(南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院，江西 南昌 330006)

內(nèi)皮型一氧化氮合成酶(eNOS)作為調(diào)整腦血管穩(wěn)定的一種重要酶，其腦保護(hù)作用已引起了廣泛的關(guān)注，本課題組前期的工作已經(jīng)證實(shí)蛛網(wǎng)膜下腔出血 (SAH)后7 d時(shí)血管痙攣?zhàn)顬閲?yán)重，eNOS的表達(dá)趨勢(shì)與腦血管痙攣嚴(yán)重度呈負(fù)相關(guān)〔1，2〕，細(xì)胞間黏附分子-1(ICAM-1)、肌糖蛋白 C(TN-C)、前列腺素 F2α(PGF2α)等炎性因子參與了血管痙攣的發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)復(fù)制大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血模型，再將轉(zhuǎn)染eNOS的脂肪基質(zhì)干細(xì)胞(ADSCs)注入大鼠腦室中，觀察其對(duì)痙攣血管的作用，并探討其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 Trizol-A(Invitrogen公司)，cDNA 合成試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)試劑盒、引物、DEPC (上海生工生物公司)，ELISA試劑盒(大連寶生物公司)，DMEM高糖培養(yǎng)基(Gibco公司)，新生牛及胎牛血清(PAA公司，奧地利)，青霉素、鏈霉素(山西振東泰盛制藥有限公司)，二氧化碳培養(yǎng)箱(Heraeu公司，德國(guó))，倒置顯微鏡(OLYMPUS,日本)，電泳儀(BIO-RAD PowerPac2000)。

1.2方法

1.2.1ADSCs細(xì)胞培養(yǎng) 無(wú)菌條件下切取大鼠腹股溝處脂肪,剔除軟組織和小血管，PBS緩沖液沖洗3 次,剪成小塊,37℃下7.5 g/L Ⅰ型膠原酶消化30 min,含15 g /LFBS的DMEM等體積中和，1 000r/min離心10 min后棄去上清及脂肪組織，160 mmol/L 紅細(xì)胞裂解液，裂解紅細(xì)胞10 min,離心棄去上清,含15 g/L FBS的DMEM重懸細(xì)胞及沉淀的組織塊,接種至含血清培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶，每72小時(shí)換液1次。

1.2.2eNOS基因轉(zhuǎn)染ADSCs 培養(yǎng)2～4代ADSCs，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至70%～80%融合時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，加入含有重組載體adeno-eNOS質(zhì)粒，腺病毒的量以200 pfu/細(xì)胞計(jì)算,轉(zhuǎn)染方法按照脂質(zhì)體2000試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱恒溫孵育4 h后，去除轉(zhuǎn)染混合物,換用25 ml培養(yǎng)瓶加入無(wú)血清培養(yǎng)液DMEM約7 ml，繼續(xù)置5% CO 、37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 d。

1.2.3RT-PCR檢測(cè)重組腺病毒轉(zhuǎn)染ADSCs后eNOS mRNA的表達(dá)鑒定 取病毒轉(zhuǎn)染后6 d收集轉(zhuǎn)染組細(xì)胞，按Trizol法抽提總RNA，取4 μg RNA反轉(zhuǎn)錄cDNA，反應(yīng)結(jié)束后取2 μl反應(yīng)物進(jìn)行PCR反應(yīng)。以eNOS引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，eNOS上游引物:5′-CCGGCTGCCACCTGATCCTA-3′,下游引物:5′-AACATGTGTCCTTGCTCGAGG CA-3′,片段大小是650 bp，β-actin上游引物：5′-TACAACCTCCTTGCAGCTCC-3′,下游引物:5′-GGATC TTCATGAGGTAGTCATTC-3′，片段大小是340 bp。以β-actin為體系內(nèi)控制。PCR產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳鑒定，鑒定eNOS的表達(dá)。

1.3分組 雄性SD大鼠60只，體重290～350 g，由南昌大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，自由進(jìn)食，晝夜節(jié)律喂養(yǎng)。隨機(jī)分為3組，SAH組20只：造模后不予任何處理；ENOS(-)組20只：SAH造模后24 h通過(guò)立體定向儀向腦室內(nèi)注入ADSCs細(xì)胞懸液10 μl，懸液密度為5×106個(gè)；AdeNOS組20只：SAH造模前通過(guò)向腦室內(nèi)注入eNOS轉(zhuǎn)染(+)ADSCs細(xì)胞懸液10 μl，懸液密度為5×106個(gè)。

1.4SAH模型制作 取SD大鼠麻醉后，后頸部及右側(cè)股動(dòng)脈區(qū)備皮、消毒后；大鼠仰臥位，鈍性分離右側(cè)股動(dòng)脈抽取股動(dòng)脈血0.3 ml留以備用，改俯臥位后鈍性分離枕部肌肉暴露枕骨，用1 ml針管穿刺入枕大池，在2 min內(nèi)將0.3 ml動(dòng)脈血注入枕大池，縫合傷口。48 h后同法取左側(cè)股動(dòng)脈血0.3 ml注入枕大池，制成大鼠SAH動(dòng)物模型。

1.5標(biāo)本采集及測(cè)定 首先取血液標(biāo)本放入含100 g/L依地酸二鈉60 μl試管中混勻，采用ELISA測(cè)定血清e(cuò)NOS、ICAM-1、TN-C和PGF2α，嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。分別于建模后第7天處死大鼠，剝離其腦組織對(duì)顳葉皮質(zhì)切片進(jìn)行染色，按試劑盒操作，觀察顳葉皮質(zhì)切片中神經(jīng)元染色陽(yáng)性細(xì)胞。剝離其基底動(dòng)脈組織部分行石蠟包埋后行HE染色檢查，光鏡下觀察并測(cè)量基底動(dòng)脈血管內(nèi)徑，橫截面積，血管舒張度(D/T值：動(dòng)脈血管內(nèi)徑與管壁厚度比值)。另一部分凍存于-80℃冰箱中，統(tǒng)一行eNOS、ICAM-1、TN-C和PGF2α檢測(cè)，將eNOS、ICAM-1、TN-C、PGF2α和β-actin進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量 PCR。反應(yīng)條件：95℃變性2 min，40個(gè)循環(huán)94℃變性20 s,58℃(eNOS)、61℃(ICAM-1)、56℃(TN-C)、55℃(PGF2α)退火20 s,72℃延伸30 s,74℃讀板。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)脂糖凝膠電泳后，用內(nèi)參照β-actin光密度值標(biāo)化eNOS、ICAM-1、TN-C和PGF2α mRNA的吸光度值，得到eNOS、ICAM-1、TN-C和PGF2αmRNA表達(dá)的相對(duì)含量。

1.6神經(jīng)元凋亡指數(shù) 所有受試動(dòng)物進(jìn)行神經(jīng)元凋亡指數(shù)評(píng)分，顳葉皮質(zhì)神經(jīng)元凋亡指數(shù)為顳葉皮質(zhì)切片1 000個(gè)神經(jīng)元中的TUNEL染色陽(yáng)性細(xì)胞。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用t檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1重組腺病毒Ade-NOS鑒定結(jié)果 對(duì)重組腺病毒Ade-NOS進(jìn)行PCR鑒定，經(jīng)酶切鑒定、電泳證明，構(gòu)建出的載體完全正確，認(rèn)為已將eNOS基因成功克隆到ADSCs細(xì)胞內(nèi)。見(jiàn)圖1。

圖1 ADSCs細(xì)胞eNOS表達(dá)鑒定

2.2基底動(dòng)脈標(biāo)本觀察 SAH組、ENOS(-)組可見(jiàn)血液主要聚積于蛛網(wǎng)膜下腔，可見(jiàn)明顯的凝血塊，基底動(dòng)脈管壁增厚，各組均可見(jiàn)內(nèi)膜出現(xiàn)皺褶，結(jié)構(gòu)排列紊亂，向血管內(nèi)腔突起，平滑肌細(xì)胞排列紊亂，厚薄不均，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。ENOS(+)組與SAH 、ENOS(-)組相比可見(jiàn)內(nèi)膜結(jié)構(gòu)稍完整，壞死、脫落細(xì)胞少，無(wú)皺褶，平滑肌細(xì)胞排列尚整齊，仍呈扁平狀。

2.3各組基底動(dòng)脈橫截面積及管壁比較 基底動(dòng)脈行 HE 染色后，SAH組基底動(dòng)脈橫截面積為(59 862±2 432) μm2，血管內(nèi)徑(118.8±7.4) μ，D/T值(8.0±2.6)，ENOS(-)組基底動(dòng)脈橫截面積為(59 674±2 389) μm2，血管內(nèi)徑(117.9±7.1) μ，D/T值(7.8±2.5)，ENOS(+)組基底動(dòng)脈橫截面積為(78 792±2 768) μm2，血管內(nèi)徑(169.4±9.0) μ，D/T值(14.5±2.6)，SAH組、ENOS(-)組基底動(dòng)脈橫截面積、血管內(nèi)徑和D/T值均明顯低于正常組和ENOS(+)組(P<0.05)。SAH組和ENOS(-)組基底動(dòng)脈橫截面積、血管內(nèi)徑和D/T值差異不明顯(P>0.05)。

2.4各組大鼠神顳葉皮質(zhì)神經(jīng)元凋亡指數(shù)比較 SAH組、ENOS(-)較ENOS(+)組顳葉皮質(zhì)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)松散，數(shù)目減少，排列紊亂； SAH組、ENOS(-)組顳葉神經(jīng)元凋亡指數(shù)(32.0%±4.4%、32.7%±4.0%)明顯高于ENOS(+)組(22.6%±3.1%，P<0.05)。見(jiàn)表1。

2.5血清e(cuò)NOS、ICAM-1、TN-C和PGF2α濃度 SAH組、ENOS(-)組eNOS表達(dá)水平明顯低于ENOS(+)組，差異有顯著性(P<0.05)。SAH組、ENOS(-)組PGF2α、TN-C表達(dá)水平明顯高于AdeNOS組，差異有顯著性(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠血清e(cuò)NOS、ICAM-1、TN-C和PGF2α表達(dá)水平

2.6各組大鼠基底動(dòng)脈eNOS、ICAM-1、TN-C和PGF2α mRNA表達(dá)情況 SAH組、ENOS(-)組大鼠基底動(dòng)脈eNOS表達(dá)明顯低于ENOS(+)組，ENOS(+)組TN-C、PGF2α表達(dá)明顯低于SAH組、ENOS(-)組(P<0.05)。見(jiàn)表2、圖2。

M：Marker，1～3；SAH組、eNOS-C組、eNOS(+)組

表2 各組大鼠基底動(dòng)脈eNOS、ICAM-1、TN-C和PGF2α表達(dá)水平

3 討 論

腦血管痙攣是SAH后最為常見(jiàn)的并發(fā)癥，所導(dǎo)致的腦組織缺血缺氧可造成可逆性或永久性神經(jīng)元損傷。SAH 后立即發(fā)生，持續(xù)數(shù)分鐘或小時(shí)，為急性腦血管痙攣，發(fā)病短暫；而遲發(fā)性腦血管痙攣一般可在SAH后3 d以后出現(xiàn)，7～8 d達(dá)到高峰，持續(xù)2～3 w后開(kāi)始逐漸緩解，是SAH后致殘和死亡的主要原因〔1，2〕。NO是一種具有生物活性作用的小分子，是維持腦血管張力的重要因子之一，在調(diào)節(jié)心血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)和免疫功能方面發(fā)揮重要作用，能快速?gòu)浬⑦M(jìn)入平滑肌細(xì)胞，引起血管松弛。eNOS作為NOS的異構(gòu)體，存在于內(nèi)皮細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞，可持續(xù)低量地合成、釋放NO，使血管處于舒張狀態(tài)〔3，4〕，是預(yù)測(cè)SAH后腦血管痙攣的重要指標(biāo)之一〔5〕。Anantha等〔6〕證實(shí)促紅細(xì)胞生成素可通過(guò)增加磷酸化eNOS水平改善SAH后腦血管痙攣?？梢?jiàn)，eNOS是治療腦血管痙攣?zhàn)钣星熬暗陌悬c(diǎn)之一。胡萍等〔7〕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，eNOS 基因體內(nèi)轉(zhuǎn)染損傷后血管可以抑制血管新生內(nèi)膜增生，減少血管再狹窄的發(fā)生率。

本文結(jié)果表明eNOS不僅可緩解SAH后腦血管痙攣，抑制基底動(dòng)脈管壁的增厚，保持內(nèi)膜結(jié)構(gòu)完整，還具有一定的神經(jīng)元保護(hù)作用。

本文結(jié)果證明，本實(shí)驗(yàn)方法可以實(shí)現(xiàn)eNOS在SAH后腦血管及血表達(dá)上升，并引發(fā)TN-C和PGF2α的下調(diào)。TN-C是一種大分子量的細(xì)胞外基質(zhì)的糖蛋白，在胚胎發(fā)育、炎性反應(yīng)以及傷口愈合的過(guò)程中可一過(guò)性的表達(dá)，其特征與纖維連接蛋白和層黏連蛋白有許多相似之處〔8〕。PGF2α〔9，10〕是通過(guò)參與其他自體活性物質(zhì)、神經(jīng)遞質(zhì)和激素的調(diào)解而發(fā)揮作用的，在生理狀態(tài)下，主要作用于血管和平滑肌，參與血小板凝集、炎癥反應(yīng)、神經(jīng)沖動(dòng)傳導(dǎo)和細(xì)胞生長(zhǎng)等。

綜上所述，腦室內(nèi)注釋攜帶外源性eNOS基因的ADSCs，可對(duì)SAH后腦血管痙攣起到一定緩解作用，為SAH后腦血管痙攣的治療提供了一種新的思路。

4 參考文獻(xiàn)

1Pyne-Geithman GJ，Caudell DN，Cooper M，etal.Dopamine D2-receptor-mediated increase in vascular and endothelial NOS activity ameliorates cerebral vasospasm after subarachnoid hemorrhage in vitro〔J〕.Neurocrit Care，2009；10(2):225-31.

2Guresir E，Raabe A，Jaiimsin A，etal.Histological evidence of delayed ischemic brain tissue damage in the rat double-hemorrhage model〔J〕.J Neurol Sci，2010；293(1～2):18-22.

3Sabri M，Ai J，Knight B，etal.Uncoupling of endothelial nitric oxide synthase after experimental subarachnoid hemorrhage〔J〕.J Cereb Blood Flow Metab，2011；31(1):190-9.

4Osuka K，Watanabe Y，Usuda N，etal.Modification of endothelial nitric oxide synthase through AMPK after experimental subarachnoid hemorrhage〔J〕.J Neurotrauma，2009；26(7):1157-65.

5Pyne-Geithman GJ，Caudell DN，Prakash P，etal.Glutathione peroxidase and subarachnoid hemorrhage：implications for the role of oxidative stress in cerebral vasospasm〔J〕.Neurol Res，2009；31:195-9.

6Vijay A，Santhanam R，Leslie A,etal.Role of endothelial NO synthase phosphorylation in cerebrovascular protective effect of recombinant erythropoietin during subarachnoid hemorrhage-induced cerebral vasospasm〔J〕.Stroke，2005;36:2731-7.

7胡 萍，盛 凈，蔡文瑋，等.內(nèi)皮型一氧化氮合酶基因轉(zhuǎn)染對(duì)血管損傷后新生內(nèi)膜增生的影響〔J〕.中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù)，2011；15(2)：298-301.

8張占虎，王勇軍，于 彬，等.大鼠坐骨神經(jīng)缺損后損傷近端神經(jīng)TNC表達(dá)變化及功能分析〔J〕.交通醫(yī)學(xué)，2012；26(5):401-3,406.

9張建斌，劉文超，何正瑞，等.蛛網(wǎng)膜下腔出血后腦血管痙攣平滑肌超微結(jié)構(gòu)研究〔J〕.解剖學(xué)雜志，2000；33(3):263-4.

10孫 博，申愛(ài)榮.子宮內(nèi)膜異位癥并不孕患者血清、腹腔液中8-iso-PGF2A、 GSH-PX的表達(dá)〔J〕.中國(guó)婦幼保健，2010；25(27)：3936-8.