趙娟　馬唯　吳林林　陳隈陟　劉鳳閣

[摘要]目的：探討AEG-1、P16、KT-67蛋白在宮頸癌前病變中的表達(dá)與臨床意義。方法：2008年2月至2015年9月選擇在我院診治的宮頸癌前病變患者98例作為癌前病變組，同期選擇宮頸癌患者98例作為宮頸癌組和98例健康體檢人作為對照組，取三組的宮頸樣本都進(jìn)行AEG-1、P16、KT-67蛋白表達(dá)的免疫組化分析，并調(diào)查了臨床資料進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果：AEG-1、P16、KT-67蛋白在宮頸癌組的陽性表達(dá)率分別為80.0%、93.9%和92.9%，而癌前病變組為57.1%、50.0%和57.1%，在對照組為3.1%、2.0%和4.1%，三組間對比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。AEG-1、P16、KT-67蛋白的陽性表達(dá)與宮頸癌前病變的年齡、疾病類型、HPV感染等病理參數(shù)對比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。直線相關(guān)性顯示AEG-1、P16、KT-67蛋白表達(dá)都呈現(xiàn)兩兩正向相關(guān)性（P<0.05）。結(jié)論：AEG-1、P16、KT-67蛋白在宮頸癌前病變中都呈現(xiàn)高表達(dá)狀況，且與臨床病理特征存在相關(guān)性，三者可互相作用影響宮頸癌前病變的發(fā)展?fàn)顩r。

[關(guān)鍵詞]AEG-1；P16；KI-67；宮頸癌前病變；相關(guān)性

宮頸癌是女性最為常見惡性腫瘤之一，我國當(dāng)前宮頸癌的發(fā)生率逐漸增高，且呈現(xiàn)年輕化趨勢。宮頸上皮內(nèi)瘤變（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）為常見的宮頸癌前病變，不過發(fā)展為宮頸癌的時間比較長，一般在15年左右，在這個時間段可以對宮頸上皮內(nèi)瘤變進(jìn)行有效診斷，從而預(yù)防宮頸癌的發(fā)生。星型膠質(zhì)細(xì)胞上調(diào)基因-1（Astrocyte elevated gene-1，AEG-1）與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移，血管生成及化療耐藥密切相關(guān)，可能是多種腫瘤的一個重要的潛在預(yù)后指標(biāo)。原發(fā)腫瘤因子-16（premature tumor-16，P16）基因為一種細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶的抑制劑，可直接參與細(xì)胞周期調(diào)控，在宮頸癌及癌前病變中p16基因主要表現(xiàn)為過表達(dá)。細(xì)胞增殖核抗原一67（nuclcar-associated antigen KT-67）可能是為DNA復(fù)制提供場所的核基質(zhì)及染色體支架的一種組分，可以用來識別生長期的正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞，可參不驅(qū)動細(xì)胞周期的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。腫瘤惡性程度越高，KT-67蛋白表達(dá)水平越高，腫瘤細(xì)胞增殖越快。本文具體探討了AEG-1、P16、KT-67蛋白在宮頸癌前病變中的表達(dá)與臨床意義，現(xiàn)報道如下。

1.資料與方法

1.1研究對象

2008年2月至2015年9月選擇在我院診治的宮頸癌前病變患者98例作為癌前病變組，同期選擇宮頸癌患者98例作為宮頸癌組和98例健康體檢人作為對照組，納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡20～70歲；癌前病變與宮頸癌都得到病理證實；均未行放療、化療及免疫治療；知情同意本研究且得到醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：有免疫缺陷疾??；既往有宮頸病變史。癌前病變組中年齡最小35歲，最大68歲，平均年齡（61.34±4.52）歲；平均體重指數(shù)為（21.47±2.44）kg/m2；疾病類型：CIN I型40例，CINⅡ型40例，CINⅢ型18例。宮頸癌組中年齡最小42歲，最大69歲，平均年齡（60.67±3.18）歲；平均體重指數(shù)（21.22±3.19）kg/m2；病理類型：鱗癌58例，腺癌40例；臨床分期：Ⅰ期44例，Ⅱ期30例，Ⅲ期24例。而對照組中年齡最小22歲，最大68歲，平均年齡（45.67±4.19）歲；平均體重指數(shù)為（21.89±2.22）kg/m2。

1.2免疫組化方法

鼠抗人AEG-1單克隆抗體（即用型抗體，批號TA803710）購自R&D公司，鼠抗人P16單克隆抗體（即用型抗體，批號ZM-0205）購自博士得生物有限公司，鼠抗人KT-67單克隆抗體（即用型抗體，批號ST-0910）購自福建邁新生物技術(shù)有限公司。

DAB顯色試劑盒購自福建邁新生物技術(shù)有限公司（生產(chǎn)批號為20942244），免疫組化染色試劑盒購自于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司（生產(chǎn)批號為20134461）。采用Envision二步法檢測AEG-1、P16、KT-67蛋白的表達(dá)情況，在免疫組化過程中，選擇經(jīng)HE染色證實的宮頸組織石蠟塊，3um石蠟切片，放置于載玻片，60℃烤片4h；切片經(jīng)二甲苯脫蠟2次，依次梯度酒精后充分水洗；進(jìn)行微波處理修復(fù)抗原，蒸餾水沖洗，5min×3次；滴加50uL 3%H2O2溶液處理15min，以阻斷內(nèi)源性迪氧化物酶，PBS沖洗，5min×3次；滴加50uL第一抗體（AEG-1、P16、KT-67）工作液，4℃孵育12h，PBS沖洗，5min×3次；滴加50txL第二抗體工作液，25℃孵育30min，PBS沖洗，5min×3次；DAB（3，3-二氨基聯(lián)苯胺Tris緩沖液）室溫下3～5min顯色，自來水沖洗終止顯色；蘇木素復(fù)染細(xì)胞核1～2min，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片、顯微鏡下觀察。以已知的陽性對照染色片為陽性對照，PBS代替一抗為陰性對照。

1.3觀察指標(biāo)

以細(xì)胞核內(nèi)呈現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性，每張切片在400倍光學(xué)顯微鏡計數(shù)癌細(xì)胞，陽性率≥20%定為陽性，每張切片由兩位病理專家獨立閱片共同協(xié)商出判斷結(jié)果。

1.4統(tǒng)計方法

選擇SPSS17.00軟件進(jìn)行分析，而計數(shù)數(shù)據(jù)對比采用卡方分析；計量數(shù)據(jù)選擇（x±s）表示，對比采用單因素方差分析或者t檢驗；相關(guān)性分析采用直線相關(guān)分析，P<0.05認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1AEG-1、P16、KT-67蛋白的表達(dá)情況對比

AEG-1、P16、KT-67蛋白在宮頸癌組中主要在細(xì)胞的核周和細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，在癌前病變組主要表達(dá)在異型細(xì)胞的核周和細(xì)胞質(zhì)。見圖1、圖2、圖3。經(jīng)過判定，AEG-1、P16、KT-67蛋白在宮頸癌組的陽性表達(dá)率分別為80.0%、93.9%和92.9%，而癌前病變組為57.1%、50.0%和57.1%，在對照組為3.1%、2.0%和4.1%，三組間對比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表1。

2.2AEG-1、P16、KT-67蛋白表達(dá)與宮頸癌前病變病理參數(shù)的相關(guān)性

經(jīng)過資料調(diào)查與對比分析，AEG-1、P16、KT-67蛋白的陽性表達(dá)與宮頸癌前病變的年齡、疾病類型、HPV感染等病理參數(shù)對比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），表現(xiàn)為年齡越大，CINⅢ型和HPV感染的AEG-1、P16、KT-67蛋白陽性表達(dá)率都比較高。見表2。

2.3AEG-1、P16、KT-67蛋白在癌前病變中表達(dá)的相關(guān)性

直線相關(guān)性顯示，AEG-1、P16、KT-67蛋白表達(dá)都呈現(xiàn)兩兩正向相關(guān)性（P<0.05）。見表3。

3.討論

宮頸癌是最常見婦科惡性腫瘤之一，其中多數(shù)為鱗狀細(xì)胞癌與腺癌，一般認(rèn)為宮頸癌的發(fā)生與性生活過早、多產(chǎn)、多個性伴侶及HPV感染等因素有關(guān)。不過宮頸癌的發(fā)病過程持續(xù)比較久，長期的慢性子宮頸炎-子宮頸上皮內(nèi)瘤發(fā)-原位癌-浸潤癌是一個逐漸發(fā)展的過程，特別是癌前病變按照異型增殖細(xì)胞累及宮頸黏膜上皮的層次，分為CIN Ⅰ、CINⅡ、CINⅢ，針對癌前病變進(jìn)行分析，有利于預(yù)防與控制宮頸癌的發(fā)生。

AEG-1最先發(fā)現(xiàn)在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中，隨后的研究發(fā)現(xiàn)AEG-1在腺癌、食管鱗癌、原發(fā)性肝細(xì)胞癌等多種腫瘤中異常表達(dá)，并與腫瘤的發(fā)生發(fā)展和預(yù)后密切相關(guān)。有學(xué)者采用多組織核酸印跡法證實AEG-1的mRNA在脊椎動物的腦、腎、膀胱、前列腺、胸腺、心臟、肝、脾、肺等組織器官中均有不同水平的表達(dá)。P16基因是直接參與細(xì)胞周期調(diào)控的抑癌基因，P16基因失活可使得宮頸上皮細(xì)胞的細(xì)胞周期發(fā)生紊亂，從而啟動一系列癌變過程。KT-67蛋白被公認(rèn)為是能準(zhǔn)確可靠反映細(xì)胞群增殖活性的客觀指標(biāo)。本研究顯示AEG-1、P16、KT-67蛋白在宮頸癌組的陽性表達(dá)率分別為80.0%、93.9%和92.9%，而癌前病變組為57.1%、50.0%和57.1%，在對照組為3.1%、2.0%和4.1%，三組間對比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），表明AEG-1、P16、KT-67蛋白都在宮頸癌前病變中呈現(xiàn)高表達(dá)狀況。

AEG-1是一個敏感的診斷癌前病變的指標(biāo)，有研究發(fā)現(xiàn)AEG-1在正常宮頸上皮組織、癌前病變組織和宮頸癌組織中的過表達(dá)率是逐步升高的，且AEG-1蛋白在宮頸癌中多為強(qiáng)陽性表達(dá)，并發(fā)現(xiàn)其升高程度與患者的預(yù)后成正相關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)胃癌患者AEG-1高表達(dá)組的中位生存時間明顯低于AEG-1低表達(dá)組，AEG-1表達(dá)水平與胃癌的預(yù)后密切相關(guān)。而HPV感染后，病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞進(jìn)行整合需要E1和E2蛋白的缺失，二者的缺失可導(dǎo)致癌蛋白水平升高，也引起細(xì)胞內(nèi)pRb蛋白功能失調(diào)，誘導(dǎo)P16蛋白過表達(dá)。而Ki-67表達(dá)不只限于基底層細(xì)胞，陽性細(xì)胞比例增加，與宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展及惡性程度有關(guān)。本研究顯示AEG-1、P16、KT-67蛋白的陽性表達(dá)與宮頸癌前病變的年齡、疾病類型、HPV感染等病理參數(shù)對比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），說明AEG-1、P16、KT-67蛋白可能參與宮頸癌的惡性表型的進(jìn)展過程。

細(xì)胞增殖是機(jī)體的基本生物學(xué)特征，當(dāng)發(fā)生致癌因素時，細(xì)胞增殖失控和分化受阻，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。本研究直線相關(guān)性顯示AEG-1、P16、KT-67蛋白表達(dá)都呈現(xiàn)兩兩正向相關(guān)性（P<0.05），其中P16蛋白的過表達(dá)與HPV感染有關(guān)；而Ki-67表達(dá)與CIN級別顯著相關(guān)，且不同Ki-67陽性表達(dá)級別組的HR-HPV負(fù)荷有顯著差異；AEG-1蛋白的陽性過表達(dá)率與宮頸癌的組織學(xué)分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期、肌層浸潤深度之間密切相關(guān)。

總之，AEG-1、P16、KT-67蛋白在宮頸癌前病變中都呈現(xiàn)高表達(dá)狀況，且與臨床病理特征存在相關(guān)性，三者可互相作用影響宮頸癌前病變的發(fā)展?fàn)顩r。