王友伢，寧志豐，白育庭，**

(1.武漢大學中南醫(yī)院胸心外科，湖北 武漢 430071；2.湖北科技學院)

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神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白1在食管癌中的表達及臨床意義*

王友伢1，寧志豐2，白育庭1，2**

(1.武漢大學中南醫(yī)院胸心外科，湖北 武漢 430071；2.湖北科技學院)

目的 探討神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白1(neureglin1，NRG1)在食管癌組織中的表達，并分析其與臨床病理特征之間的關系。方法 采用免疫印跡(Western Blot)、實時熒光定量聚合酶鏈式反應(real-time PCR)檢測食管癌及正常食管組織中NRG1在蛋白水平及核酸水平的表達，采用免疫組化(ICH)SP法檢測NRG1在食管癌組織中的表達強度，并分析NRG1的表達和臨床特征之間的關系。結果 在蛋白水平，NRG1在食管癌組織中的表達均低于正常食管組織(P<0.05)，在核酸水平也顯示該趨勢(P<0.05)，且表達與患者的性別和腫瘤分化程度相關(P均<0.05)，與年齡、吸煙、飲酒、淋巴結轉移、TNM分期無相關性(P>0.05)。結論 食管癌的發(fā)生及惡性程度可能與NRG1的表達相關，NRG1有可能成為食管癌治療的新的有效靶點。

食管癌；神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白1

食管癌在我國發(fā)生率高，組織學上以鱗狀細胞癌多見，食管鱗癌已成為我國衛(wèi)生部確定的十大特色腫瘤之一[1]，臨床上多采用外科手術治療[2]，但由于食管癌的早期癥狀多不明顯，多數(shù)患者就診時病情已達中晚期，導致預后較差，手術后需要輔助其他治療[3-4]。相關研究發(fā)現(xiàn)食管癌組織中存在多條信號轉導通路的異常激活，但目前尚無作用于食管癌的有效靶向治療藥物[3]，因此尋求有效的治療靶點可能對于食管癌的治療具有重要的意義。國外相關研究顯示神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白1(NRG1)與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關，且其發(fā)生作用的過程中導致多種與腫瘤相關的信號通路分子改變[5]。NRG1在食管中的作尚未見具體研究，本實驗意在研究NRG1在食管癌中的表達，同時探討其表達量與患者的臨床病理特征之間的關系，為食管癌的診療提供新的有價值的思路。

1 材料與方法

1．1 實驗材料 收集武漢大學中南醫(yī)院2015年5月至2016年1月胸心外科行手術切除的食管癌組織標本及對應的正常組織(距癌組織5cm以上，術后病檢均未發(fā)現(xiàn)癌細胞)30例用于免疫印跡(Western Blot)及聚合酶鏈式反應(PCR)實驗，2015年1月至2016年2月行石蠟包埋的食管癌組織64例用于免疫組化實驗。提供組織的所有患者均被證實無心臟、神經(jīng)系統(tǒng)疾病，無其他器官腫瘤，術前均未經(jīng)任何放療或化療；所收集的癌組織術后經(jīng)病理證實均為食管鱗癌。收集所有提供用于免疫組化實驗標本的患者的臨床信息，包括年齡、性別、吸煙史、飲酒史、腫瘤分化程度、淋巴結轉移情況及TNM分期。所有標本收集術前均獲得患者同意及武漢大學中南醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準。NRG1兔抗人多克隆抗體購買自abnove公司。

1.2 Western Blot 將低溫凍存的新鮮食管癌組織及配對的正常組織標本取出后經(jīng)TBS充分清洗并剪碎置入碾缽中，每1g組織中加入500μL組織裂解液(RIPA)及10μL的蛋白酶抑制劑(PMSF)，然后在冰浴上充分碾磨，轉移到EP管中。以12000 r/min，4℃離心15min，轉移上清到到新的EP管中，加入125μL上樣緩沖液(5×)，100℃煮沸10min后上樣。80 V的電壓電泳至溴酚藍進入分離膠(10%)時改變電壓至120V，待溴酚藍至膠底時，停止電泳。將凝膠中的目的蛋白NRG1及內(nèi)參蛋白β-actin電轉至PVDF膜上。使用5%的脫脂奶粉(含0.05%Tween-20的TBST緩沖液配制)在室溫下封閉2h；NRG1兔抗人多克隆抗體(1∶1000稀釋)及β-actin兔抗人多克隆抗體(1∶1000稀釋)4℃下?lián)u床孵育過夜，TBST漂洗4×10min，羊抗兔IgG抗體(1∶20000)室溫下孵育2h，TBST漂洗4×10min，ECL檢測液顯色并曝光，使用quantity one軟件對條帶進行半定量分析。以NRG1蛋白條帶的光密度值與β-actin蛋白條帶光密度值之比作為蛋白相對表達量。

1.3 Real-time qPCR 分別取凍存的新鮮食管癌及正常食管組織，以Trizol(Invitrogen)、三氯甲烷、異丙醇、乙醇依次提取組織中的總RNA，所得RNA溶于DEPC水中，紫外分光光度計測定RNA的濃度及純度，用所有備用的RNA的A260/A280均在1.90～2.02之間，以逆轉錄試劑盒(Takara)將mRNA逆轉錄成cDNA,PCR引物序列為NRG1(forward:5′-AGTCCTTCGGTGTGAAACCAG-3′,reverse:5′-TGCGAAGTTCTGACTTCCCTG-3′),內(nèi)參β-actin(F:5′-AGAGCTACGAGCTGCCTGAC-3′,R:5′-AGCACTGTGTTGGCGTACAG-3′),反應體系為2×SYBR Premix ExTaq 10μL，上下游引物各1μL，cDNA1μL，無酶水7μL，總體積為20μL，反應條件為95℃ 5min預變形，95℃ 30s變性，57℃ 30s退火，72℃ 45s延伸，共40個循環(huán)，最后72℃ 10min終延伸；反應結束后，由電腦自動設置閾值，并記錄相應的CT值。本研究采用2-ΔΔCt,相對定量法比較目的基因在不同組織中的表達水平。

1.4 免疫組織化學染色 所有標本均用4%多聚甲醛常溫固定24h～72h，石蠟包埋，制成5mm的切片。石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度乙醇脫水后，0.3%H2O2甲醇溶液中室溫孵育30min，消除內(nèi)源性過氧化物酶活性，蒸餾水清洗，微波法抗原修復、磷酸鹽緩沖液(PBs)浸泡5min，1∶10山羊血清封閉液室溫孵育10min，加NRG1兔抗人多克隆抗體(1∶100稀釋)4℃過夜，生物素標記的二抗和辣根過氧化物酶標記鏈霉菌卵白素37℃各30 min，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，水洗，蘇木素復染，梯度乙醇脫水、二甲苯透明后，樹膠封片，在光學顯微鏡下觀察全片，在400倍的高倍鏡下觀察并從兩方面對切片進行評分，根據(jù)細胞染色強度計分：無著色0分，淡黃色1分，棕黃色2分，棕褐色3分；根據(jù)陽性細胞數(shù)計分：1%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，76%及以上為4分。兩項評分相乘為最終結果：0～2分以下為陰性(-)，3～4分為弱陽性(+)，6～8分為中陽性(++)，9分及以上為強陽性(+++)。

1.5 統(tǒng)計學方法 應用SPSS 17．0統(tǒng)計軟件分析。比較兩種組織中NRG1在蛋白水平的表達采用配對t檢驗，在核酸水平的表達采用獨立樣本t檢驗，分析NRG1的表達與臨床特征之間的關系采用Fisher’s精確χ2檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 NRG1在食管癌及食管正常組織中的表達 在蛋白水平，NRG1在食管癌組織及對應的正常食管組織中均可見表達，并且在癌組織中表達低于在正常組織中的表達(P=0.004<0.05)，見圖1(封三)，該種蛋白主要表達于細胞核及細胞膜中，在一些細胞的細胞質(zhì)中也可見其表達，見圖2(封三)。在核酸水平，NRG1的表達也表現(xiàn)在癌組織中低于正常組織(P=0.032<0.05)。

2.2 NRG1的表達強度與臨床病理參數(shù)間的關系 NRG1在癌組織中的表達與患者的性別相關(P=0.047<0.05)，并且與腫瘤分化程度顯著相關(P=0.002<0.05)，而與患者的年齡、吸煙史、飲酒史、淋巴結轉移情況及腫瘤的TNM分期無明顯相關性(P>0.05)。見表1。

表1 NRG1的表達與臨床病理各參數(shù)之間的關系(n=64)

3 討 論

食管癌是我國常見的惡性腫瘤，發(fā)病率高，占我國惡性腫瘤死因的第4位[4]，2012年全球新發(fā)食管癌患者約為455800例，死亡約400200[6]。食管癌的發(fā)病因素很多，目前認為吸煙、飲酒、各類慢性刺激及環(huán)境因素是中國食管鱗癌發(fā)病的主要原因[1]。臨床上，食管癌主要采用外科手術治療，但因為多數(shù)食管癌患者早期無明顯癥狀，就診時病情已達中晚期，單純手術治療效果不佳，為提高術后生存質(zhì)量，常常需要加行其他輔助治療[3-4]。相關研究發(fā)現(xiàn)食管癌組織中存在多條信號轉導通路的異常激活，但目前的p53、Ki-67等食管癌治療靶點的有效性存在爭議性[3]，因此尋求有效的治療靶點可能對于食管癌的治療具有重要的意義。

NRG1最早于1992年在神經(jīng)科學研究領域中被發(fā)現(xiàn)，該基因位于染色體8P12上，含有1.4Mb個堿基序列[7]，其編碼的蛋白NRG1因在不同的實驗室中分離純化而具有不同的名稱，如人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白(heregulin，HRG)、神經(jīng)分化因子(neu differentiation factor，NDF)、膠質(zhì)生長因子(gial growth factor，GGF)及乙酰膽堿受體活性誘導因子(acetylcholine receptor inducing activity，ARIA)[8]。通過轉錄過程中啟動不同的轉錄啟動子以及翻譯過程中選擇性的mRNA剪切方式，其可編碼至少15種不同的跨膜蛋白結構[7]，即NRG1有多種亞型結構。在結構上，NRG1由6種結構域組成：氨基端區(qū)域、免疫球蛋白樣結構域、EGF樣結構域、近膜序列、跨膜序列和細胞質(zhì)結構域，大多數(shù)NRG1亞型都是以無活性的前體形式(proNRG1)錨定在細胞膜上的，當EGF樣結構域的近C端被水解后，形成可溶性的成熟的NRG1才具有生物活性[7，9]，即EGF樣結構域在NRG1發(fā)揮功能的過程中起著重要作用。在功能上，NRG1為一類重要的信號蛋白，其作為配體通過EGF樣結構域結合于受體酪氨酸激酶家族(ErbBs)成員，一方面可以使ERBBs活化并形成異源二聚體，導致下游一系列復雜的信號轉導途徑如絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)和磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)等通路被啟動[10-12]，從而發(fā)揮信號轉導的生物學效應；另一方面NRG1可以迅速被內(nèi)化，運輸?shù)郊毎酥?，作為核生長因子，參與細胞周期、分化、惡性形成相關的致癌基因c-myc的活化并啟動其轉錄過程，發(fā)揮有絲分裂原、誘導分化劑、轉化劑的效應[13]。在上皮源性惡性腫瘤中常見8號染色體短臂結構的改變，NRG1基因位于該部位常常被累及[14-15]。國內(nèi)外已有多項研究證實NRG1在多種惡性腫瘤中異常表達[16]，并參與腫瘤的增殖生長、分化、轉移、微血管生成及微環(huán)境改變等過[17-21]。但其在食管癌中尚未見具體研究。

本實驗研究NRG1在食管癌中的表達并對其與食管癌患者臨床特征的相關性進行分析。本研究通過Western Blot方案證實NRG1在在蛋白水平既表達于食管癌組織，也表達于正常的食管組織中，且在癌組織中表達相對較低，通過Real-time qPCR方案證實NRG1在核酸水平的表達同樣符合該觀點。通過免疫組化的研究顯示NRG1在食管癌中的表達與患者的性別和腫瘤分化程度顯著相關，而與患者的年齡、吸煙史、飲酒史、淋巴結轉移及腫瘤TNM分期無明顯相關性。這些研究結果提示NRG1在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起一定的作用，但本實驗未對NRG1發(fā)揮上述作用的機制、NRG1對食管癌細胞的生物學行為得影響及對食管癌患者的預后等方面做研究。

綜上所述，NRG1在食管癌的發(fā)生發(fā)展中起一定的作用，尚不能確定其是否可以作為一種抑癌基因及其發(fā)揮的作用，即NRG1能否作為食管癌診斷和治療的新的特異性分子指標還需更深研究。

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The Expression of NRG1 in Esophageal Carcinoma and its Clinical Significance

WANG You-ya,NING Zhi-feng,BAI Yu-ting

(DepartmentofCardiothoracicSurgery,ZhongnanHospital,WuhanUniversity,WuhanHubei430071,China)

Objective To study the expression and clinical significance of neureglin1(NRG1)in esophageal carcinoma tissues. Methods The expression of NRG1 at the protein levels 1 in esophageal cancer tissue and normal esophageal tissue was detected by Western blot and at nucleic acid level by real-time quantity PCR.The relationship between the expression of NRG1 in esophageal carcinoma and clinical characteristics by Immunohistochemistry(IHC) was also analyzed.Results The expression of NRG1 at the protein level in esophageal cancer was significantly lower than both normal esophageal tissue (P<0.05) and at the nucleic acid level(P<0.05),and its expression was gender-related differentiation,but not significantly associated with with age,smoking and drinking history,lymph node metastasis and TNM stage.Conclusion The occurrence and malignancy degree of esophageal cancer may be associated with the expression of NRG1,and NRG1 may serve as a new effective target of esophageal cancer treatment.

Esophageal carcinoma;NRG1

湖北省自然科學基金重點項目(2011CDA064)

R735.1

A

2095-4646(2017)02-0100-04

10.16751/j.cnki.2095-4646.2017.02.0100

2017-01-06)

**通訊作者，E-mail：xybyt0628@163．com