常孟方 李 磊 曹瀟丹 賈夢輝周加勝 陳縉泉 徐建華,*

(1華東師范大學精密光譜科學與技術國家重點實驗室，上海200062；2中國科學院上海光學精密機械研究所，上海201800)

基于時間分辨方法的LicT蛋白熒光動力學特性

常孟方1李 磊1曹瀟丹1賈夢輝2周加勝1陳縉泉1徐建華1,*

(1華東師范大學精密光譜科學與技術國家重點實驗室，上海200062；2中國科學院上海光學精密機械研究所，上海201800)

使用時間分辨熒光方法，結合紫外吸收光譜和穩(wěn)態(tài)熒光光譜技術，測量了LicT蛋白中色氨酸殘基的熒光動力學特性，進而對LicT蛋白質激活前后的局部微環(huán)境和結構變化進行了研究。LicT蛋白質的激活態(tài)使得有關糖類利用的基因轉錄過程繼續(xù)進行，促進機體新陳代謝。通過色氨酸殘基的熒光發(fā)射和壽命的差異判斷出激活型蛋白AC 141和野生型蛋白Q 22不同的結構性質和微環(huán)境差異。在此基礎上，通過衰減相關光譜(DAS)和時間分辨發(fā)射光譜(TRES)闡釋了兩種蛋白色氨酸殘基和溶劑的相互作用，說明了激活型AC 141的比野生型Q 22的結構更加緊密。此外，TRES還說明了蛋白中的色氨酸殘基存在連續(xù)光譜弛豫過程。各向異性結果則對殘基和整個蛋白的構象運動進行了闡述，說明了色氨酸殘基在蛋白質體系內有獨立的局部運動，且在激活型蛋白中該運動更加強烈。

時間相關單光子計數(shù)；色氨酸；衰減相關光譜；時間分辨發(fā)射光譜；各向異性

1 引言

熒光光譜技術廣泛應用于對生物分子結構和動力學的研究中1。色氨酸是氨基酸中最為重要的熒光發(fā)色團，數(shù)十年來一直被用來探測多肽和蛋白質的環(huán)境和構象變化2，其化學結構及殘基結構如圖1所示。相較其他氨基酸，色氨酸的吲哚環(huán)有著較強的紫外消光系數(shù)和較高的量子產(chǎn)率3。其最低單線態(tài)1La對周圍環(huán)境的極性和動力學過程非常敏感4,5。隨著色氨酸在水中暴露的部分增多，其發(fā)射峰值在308到355 nm之間變化。總體上看，這一點反映了蛋白質周圍的靜電環(huán)境6。許多含有單個色氨酸殘基的多肽和蛋白質表現(xiàn)出波長相關的多指數(shù)熒光衰減，每個衰減成分都有不同的衰減相關光譜(DAS)7。造成色氨酸熒光多指數(shù)衰減的因素有很多，如溶劑弛豫、基態(tài)異質性、旋轉異構體、局部環(huán)境等8－10。蛋白質或多肽內的淬滅因素有肽鍵、谷氨酰胺、天冬酰胺、半胱氨酸、組氨酸等11。而蛋白質構型的改變也使得色氨酸殘基的局部環(huán)境發(fā)生變化，從而引起色氨酸穩(wěn)態(tài)熒光光譜和時間分辨衰減曲線的改變2。在DAS基礎上得到的時間分辨發(fā)射光譜(TRES)可用于激發(fā)態(tài)光譜弛豫的研究和弛豫時間的估計。對于分子各項異性的測量可以判斷分子的形狀和旋轉擴散的情況12。有關蛋白質中色氨酸殘基的各向異性的研究可以反映出蛋白的整體旋轉擴散和局部轉動的速率13,14。

LicT蛋白質是枯草桿菌BglG族的四種反終止子蛋白之一，在碳水化合物的運輸和代謝過程中調節(jié)有關糖類利用的基因表達。其激活態(tài)促使轉錄過程持續(xù)進行，在機體新陳代謝過程中有著十分重要的作用15,16。研究者們已經(jīng)使用不同的實驗方法對LicT蛋白的功能和結構進行了探究，如表面等離子體共振、晶體結構測定、小角度X射線衍射、分析超速離心法、核磁共振等17－19。然而，在LicT蛋白質PRD1區(qū)域的120位存在色氨酸殘基，除了穩(wěn)態(tài)熒光光譜的測量18，尚未有時間分辨熒光方法運用在探索LicT蛋白及其突變體的動力學中。

本文使用時間相關單光子計數(shù)(TCSPC)技術，通過時間分辨手段對野生型及天冬氨酸激活型LicT蛋白的動力學和結構特性進行了深入的探討。通過耦合了皮秒激光器的TCSPC平臺實現(xiàn)了衰減相關光譜，時間分辨發(fā)射光譜和各向異性的測量。壽命擬合、DAS、TRES說明了兩種蛋白色氨酸殘基的微環(huán)境和連續(xù)光譜弛豫過程。各向異性結果則對殘基和整個蛋白的結構運動進行了闡述，說明了色氨酸殘基在蛋白質體系內有獨立的局部運動。這些結果反映了LicT蛋白在激活前后的熒光動力學變化。

2 樣品準備

Q 22是野生型LicT蛋白，AC 141是其激活型，其中His 207和His 269被帶負電荷的天冬氨酸所取代，目的是模擬磷酸化的組氨酸殘基。蛋白的制備方法見文獻18。

將1 mL電阻率為18.2 MΩ·cm的去離子水加入到凍干的Q 22和AC 141粉末中。室溫下停放10到15 min之后，搖晃離心管加速溶解。將上層清液移至干凈的離心管中，然后以800 r·min－1的速率離心20 min。將500μL的各樣品移至600μL(30 mm×10 mm×2 mm)的比色皿中以備測量。

3 實驗部分

LicT蛋白的吸收譜由紫外-可見分光光度計(TU1901，北京普析通用儀器有限公司)測量，探測波長為200至900 nm。穩(wěn)態(tài)熒光光譜由熒光分光光度計(4500，Hitachi，日本)測量得出，激發(fā)波長為298 nm。所有的時間分辨熒光測量都是使用自主搭建的TCSPC系統(tǒng)完成的。在此系統(tǒng)中，中心波長為298 nm的激發(fā)光由皮秒二極管激光器(PDL800-B，PicoQuant，德國)發(fā)出，重復頻率是10 MHz。熒光信號經(jīng)紫外-可見光電倍增管(PMA165A-N-M，PicoQuant，德國)探測，由單光子計數(shù)模塊(PicoHarp300，PicoQuant，德國)記錄。在DAS測量中熒光偏振設為魔角(magic angle，54.7°)，而對于各向異性的測量分別設為豎直和水平方向。探測光路中通過單色儀(7ISW151，北京賽凡光電儀器有限公司)選擇探測的熒光波長。使用0.34%二氧化硅納米顆粒水溶液的衰減曲線作為儀器響應函數(shù)，其半高寬(FWHM)約為500 ps。在自主編寫的控制軟件中，選擇25000個通道，每個時間通道設為4 ps。DAS的探測波長設為325－395 nm，步長為10 nm。各向異性的探測波長設在345 nm。

4 結果與討論

圖2為LicT蛋白的吸收譜。從圖2可見，兩種樣品均有一個280 nm左右的吸收峰，這是色氨酸基團的特征吸收峰。根據(jù)Beer-Bouguer定律20：

(其中，Ti為樣品的透過率，c為樣品濃度，l為樣品光程，K是消光系數(shù))，由吸收峰值和在RCSB Protein Data Bank中計算得到的消光系數(shù)，計算出AC 141和Q 22的濃度分別為1.00和0.95 mg· mL－1。二者濃度基本相同。

圖3為LicT蛋白的穩(wěn)態(tài)熒光光譜。由圖3可以看出，AC 141相較于Q 22發(fā)生了約為5 nm的藍移。色氨酸有兩個等能激發(fā)態(tài)1La和1Lb，如圖4所示。在極性溶劑水中，熒光主要從1La激發(fā)態(tài)發(fā)射21。而1La能態(tài)在極性強的溶劑中或在與氫鍵鍵合的過程中能量轉低，電子躍遷時發(fā)射波長變長，光譜發(fā)生紅移22,23。圖3體現(xiàn)了這一溶劑效應。因此，結合圖5中LicT蛋白的結構示意圖，AC 141的結構比Q 22更加緊密，色氨酸殘基得到了保護，更少地暴露在水中。

為了得到LicT蛋白的壽命成分及其比重，依據(jù)加權最小二乘法的方法，使用如下公式對TCSPC系統(tǒng)測得的多探測波長衰減曲線進行擬合：

圖2 LicT蛋白的吸收譜Fig.2 Absorption spectra of LicT proteins

圖4 溶劑效應和激發(fā)態(tài)連續(xù)光譜弛豫(CR)的Jablonski圖Fig.4 Jablonskidiagram of solvent effectand excited state continuous spectralrelaxation(CR) hνis the energy of the exciting photons.1Lb(a)and1Laare singletexcited states.F and R representFranck-Condon(unrelaxed)state and relaxed state, respectively.k is fluorescence decay rate.ksis solventrelaxation rate.

其中I(λ,t)是t時刻波長λ的熒光強度，τi是壽命成分，αi(λ)是該壽命所占比重。擬合的效果通過χR2的值來評價12，本文χR2的范圍是1.01－1.20。TCSPC系統(tǒng)的儀器時間分辨率約為250 ps，故整體壽命數(shù)值的誤差在250 ps左右。在擬合過程中，基線(或者暗噪聲)由自己編寫的Matlab程序自動扣除。AC 141和Q 22均可用三個壽命擬合。多指數(shù)衰減和蛋白質的結構有關12。色氨酸在中性環(huán)境里有3.1和0.5 ns兩個壽命，約為3 ns的是色氨酸的自然輻射壽命，0.5 ns可能來自于色氨酸的自淬滅或外部淬滅12,24。而在LicT蛋白中，還存在著約為7 ns的壽命，這可能是因為蛋白質的結構為色氨酸殘基提供了弱極性的疏水環(huán)境，使得色氨酸壽命變長25。

多波長探測的結果經(jīng)全局擬合處理，得到DAS(如圖6)。DAS通常用來確定異質性和弛豫在色氨酸熒光發(fā)射中的重要性。而DAS系數(shù)的正負則是兩態(tài)激發(fā)態(tài)反應的判斷標志26。圖6使用三指數(shù)模型對衰減曲線進行了擬合，得到了3個熒光壽命。鑒于所有的DAS系數(shù)均為正值，所以在LicT蛋白的熒光發(fā)射中，異質性的作用更為重要。AC 141和Q 22的最短壽命成分(趨近探測極限)曲線沒有明顯區(qū)別。這一現(xiàn)象說明兩種蛋白的色氨酸殘基受溶劑弛豫的影響相同。對于最長的壽命成分，Q 22的比率高于AC 141，而對于中間的壽命成分3 ns，Q 22的比率低于AC 141。

圖5 LicT蛋白結構的帶狀和空間填充示意圖Fig.5 Ribbon and space filling presentations of LicT protein Adapted from Fig.6a of reference 18.

圖6 LicT蛋白的DAS圖Fig.6 DAS(decay associated spectra)of LicT proteins (a)AC 141;(b)Q 22

圖7 LicT的TRES圖Fig.7 Time-resolved emission spectra(TRES)of LicT proteins (a)AC 141;(b)Q 22

為了更好地了解LicT蛋白的瞬態(tài)過程，由之前DAS的結果做出了TRES。對于激發(fā)態(tài)過程的研究通?？梢越柚赥RES的測量。TRES是在脈沖激發(fā)之后的時間里立即測量得到的一系列熒光發(fā)射光譜12。激發(fā)態(tài)弛豫過程可用兩種模型描述：激發(fā)態(tài)反應(ESR)模型和連續(xù)光譜弛豫(CR)模型。兩者的區(qū)別在于ESR的弛豫態(tài)熒光衰減速率和激發(fā)態(tài)熒光衰減速率不同，而CR模型的兩種衰減速率相同，并且在兩種狀態(tài)轉換的中間態(tài)里連續(xù)衰減。故CR模型的熒光發(fā)射光譜的形狀不會隨記錄時間不同而改變，而ESR模型的光譜形狀會改變。從圖7中可以看出，兩種LicT蛋白的熒光衰減均符合CR模型，即激發(fā)態(tài)電子的弛豫是一個連續(xù)發(fā)光的過程，并且激發(fā)態(tài)電子衰減速率與弛豫態(tài)相同，如圖4所示。對于熒光衰減過程而言，由于從激發(fā)態(tài)到弛豫態(tài)需要時間，而弛豫態(tài)能量低于激發(fā)態(tài)，因此，長波長的熒光衰減壽命更長12。這與我們所測得的數(shù)據(jù)相吻合。

對于TRES的測量有直接測量和波長相關衰減兩種方法。前者雖然也涉及TCSPC技術，但由于儀器響應函數(shù)的存在，測得的光譜往往會受到扭曲。因此，我們采用探測不同波長衰減的方法間接測量樣品的TRES，數(shù)據(jù)處理的計算方法如下：

其中F(λ)是穩(wěn)態(tài)發(fā)射光譜，I(λ,t)是熒光衰減強度。用壽命和其比率替換熒光衰減強度，得到：

H(λ)乘以相同波長下時間積分的熒光衰減強度等于該波長下的穩(wěn)態(tài)熒光強度。于是，計算TRES的公式為：

這里α′i(λ)=H(λ)αi(λ)12。

值得注意的是，圖7中只有0－0.5 ns能夠得出可分辨的TRES曲線。由此可以得出在LicT蛋白中存在著約為0.5 ns的弛豫過程，如圖4所示。而Q 22相較AC 141在激發(fā)的最初時間里紅移得更多，說明了前者的弛豫態(tài)能量低于后者，這是因為色氨酸周圍環(huán)境的極性不同所導致的12。極性越大，則激發(fā)態(tài)能量越低。由此可以推斷出AC 141的色氨酸殘基更多包裹在蛋白質的結構中。

為了繼續(xù)研究LicT蛋白的結構轉動變化，我們計算了AC 141和Q 22的各向異性參數(shù)，結果由Decayfit軟件通過加和減的方式得出。設熒光強度衰減光譜中與激發(fā)光偏振平行和垂直的分量分別為I∥(t)和I⊥(t)，r(t)是時間分辨各向異性，則有如下關系式：

其中，r0=j是沒有旋轉擴散的限制各項異性，θj是單獨的相關時間，gi是每個各向異性衰減相關時間所占的比值，且=1.012。擬合結果見表1。

圖8為LicT蛋白的各向異性測量到的衰減曲線及擬合分析。圖8中，Q 22的時間分辨各向異性曲線比AC 141的衰減得快一些。這說明了Q 22色氨酸殘基更多的暴露于水中，當?shù)鞍妆患せ顣r結構變得更加緊密，使得AC 141色氨酸殘基受到了保護。表1中，較長的轉動相關時間θ1說明了蛋白的整體旋轉擴散。轉動相關時間θ2說明了由溶液或其他殘基轉動擴散引起的超快動力學過程。Q 22的θ2所占比率高于AC 141，說明前者的結構較為松散，色氨酸殘基的局部運動更加劇烈。相同條件下色氨酸的基本各向異性值為0.3，而AC 141和Q 22的r0值分別為0.209和0.165，均小于0.3。這種各向異性數(shù)值的減小是因為色氨酸殘基存在著一個快速的運動，且這種運動的時間尺度在測量所用儀器的分辨率之下12。所以，進一步的研究需要使用熒光飛秒上轉換裝置來完成。

表1 LicT蛋白的各向異性衰減擬合參數(shù)Table 1 Fitting parameters of anisotropy decays of LicT proteins

圖8 LicT蛋白的各向異性測量到的衰減曲線及擬合分析Fig.8 Measured decay anisotropies and fitting analyses of LicT proteins

5 結論

使用時間分辨熒光方法探討了LicT蛋白的野生型和突變體的熒光動力學。通過TCSPC技術，DAS、TRES、各向異性的測量和結果分析探討了LicT蛋白質色氨酸殘基的激發(fā)態(tài)弛豫過程以及局部運動和轉動擴散。對兩種蛋白熒光壽命的三指數(shù)擬合表明了色氨酸殘基的不同微環(huán)境和淬滅現(xiàn)象。在此基礎上，通過DAS展示了兩種蛋白中色氨酸殘基的溶劑弛豫效應，說明了激活型AC 141的比野生型Q 22的結構更加緊密，使得色氨酸殘基受到了更多的保護。通過TRES，說明了蛋白中的色氨酸殘基存在0.5 ns的連續(xù)光譜弛豫過程。各向異性結果則對殘基和整個蛋白的結構運動進行了闡述，說明了色氨酸殘基在蛋白質體系內有獨立的局部運動，且激活后該運動更加強烈。因此，色氨酸可作為一種內源性探針對LicT蛋白質激活前后的局部微環(huán)境和結構進行研究。除此之外，這些結論為研究者們使用時間分辨熒光方法進一步探索皮秒量級LicT蛋白的熒光動力學性質提供了依據(jù)。

致謝：感謝CBS(Centre de Biochimie Structurale,France)提供制備LicT蛋白所需的質粒和相關技術支持。

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Fluorescence Dynamics of LicT Protein by Time-Resolved Spectroscopy

CHANGMeng-Fang1LILei1CAO Xiao-Dan1JIA Meng-Hui2ZHOU Jia-Sheng1CHEN Jin-Quan1XU Jian-Hua1,*
(1State Key Laboratory of Precision Spectroscopy,EastChina Normal University,Shanghai 200062,P.R.China;2Shanghai Institute of Optics and Fine Mechanics,Chinese Academy of Sciences,Shanghai 201800,P.R.China)

In this paper,the fluorescence dynamics oftryptophan residues in LicT protein is investigated by time-resolved fluorescence method combined with UV absorption and steady-state fluorescence spectroscopy. The localmicroenvironmentand structuralchanges of LicT protein before and after activation are studied.The activated LicT protein AC 141 prevents the antitermination of gene transcription involved in carbohydrate utilization to accelerate the body′s metabolism.The structuralproperties and microenvironment ofactivated protein AC 141 and wild-type protein Q 22 were determined by differentfluorescence emissions and lifetimes of tryptophan residues.The interaction between tryptophan residues and solvent is elucidated by decay associated spectroscopy(DAS)and time-resolved emission spectra(TRES),indicating thatupon activation, the structure of AC 141 is more compact than that of wild-type Q 22.In addition,TRES also showed that tryptophan residues in the protein had a continuous spectralrelaxation process.Anisotropy results illustrated the conformationalmotions ofresidues and whole proteins,suggesting thattryptophan residues had independent localmotions in the protein system,and thatthe motions were more intense in the activated protein.

Time-correlated single-photon counting;Tryptophan;Decay-associated spectra;Timeresolved emission spectra;Anisotropy

.Email:jhxu@ecnu.edu.cn;Tel:+86-21-62233936 ?Editorialoffice ofActa Physico-Chimica Sinica

O643

allis,P.R.Method Enzymol.1996,278,113.

10.1016/ S0076-6879(97)78009-1

doi:10.3866/PKU.WHXB201703061

Received:January 5,2017;Revised:March 1,2017;Published online:March 6,2017.*