尹秀文+侯成波+陳江鵬+潘孟+李雪蓮+王子禹+董玲

[摘要] 研究荷葉多成分整體的腸滲透性，明確荷葉成分間吸收過程中的相互作用。采用大鼠在體單向灌流法。結(jié)果表明，荷葉中荷葉堿、去甲基荷葉堿、蘆丁、異槲皮苷、紫云英苷、槲皮素、山柰酚7種單體成分的有效滲透系數(shù)（Peff）大于0.5×10-4 cm·s-1，在生物藥劑學(xué)分類系統(tǒng)（biopharmaceutics classification system，BCS）腸滲透屬性中，屬高滲透性成分，而兒茶素、金絲桃苷為低滲透性成分。然而，在荷葉總提取物多成分環(huán)境下，成分的滲透行為發(fā)生了變化，對荷葉中不明確成分進(jìn)行半定量分析發(fā)現(xiàn)，在多成分環(huán)境下，可標(biāo)識的9個成分中有3個成分Peff小于0.5×10-4 cm·s-1。在多成分環(huán)境下，7個未知成分中，3個成分屬于高滲透性成分，4個成分屬于低滲透性成分。該研究初步明確了荷葉中多成分整體的腸滲透性，為揭示中藥多成分環(huán)境下的吸收機(jī)制奠定一定的基礎(chǔ)。

[關(guān)鍵詞] 單向腸灌流；滲透性；荷葉；中藥生物藥劑學(xué)分類系統(tǒng)

Overall intestinal permeability of multiple components in

lotus leaf by in situ single pass intestinal perfusion models

YIN Xiu-wen， HOU Cheng-bo， CHEN Jiang-peng， PAN Meng， LI Xue-lian，WANG Zi-yu， DONG Ling*

（Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100102， China）

[Abstract] To investigate the overall intestinal permeability of multiple components in lotus leaves and make clear the interaction in composition absorption process. Rat single-pass intestinal perfusion technique was used， and the results showed that the Peff values of nuciferine， demethylanuciferine， rutin， quercetin， kaempferol from lotus leaf were greater than 0.5×10-4 cm·s-1. In the biopharmaceutics classification system （BCS） intestinal permeability property， these ingredients were high permeable components， while the hyperin was low permeable component. However， in the multi-component environment of the lotus leaf extract， component permeation was changed. Semi quantitative analysis of the unclear components showed that under the multi-component environment， four in seven components with relatively high contents had a Peff value less than 0.5×10-4 cm·s-1， indicating these 4 components were of low permeability， while other 3 components were of high permeability. The results could be valuable to make clear the overall intestinal permeability of multiple components in lotus leaf， and lay a foundation for studying the mechanism of the lipid-lowering effect of lotus leaf.

[Key words] single-pass intestinal perfusion（SPIP）； permeability； lotus leaf； biopharmaceutics classification system of Chinese materia medica

口服作為藥物最常見的服用方式，其胃腸道吸收過程非常復(fù)雜。藥物的水溶解性及腸滲透性是影響吸收的主要因素[1]，也是影響藥物生物利用度的關(guān)鍵因素之一?！吧锼巹W(xué)分類系統(tǒng)（biopharmaceutics classification system，BCS）”是根據(jù)藥物的水溶解性及腸滲透性高低，對藥物進(jìn)行分類的一種科學(xué)框架或方法[2-3]。BCS的提出是基于單一成分化學(xué)藥物，而中藥與化藥口服吸收的本質(zhì)和核心是一致的。成分在腸道吸收受很多因素影響，對中藥整體腸吸收研究，需要經(jīng)過單成分到多成分環(huán)境的遞進(jìn)過程，才能明確成分在多成分環(huán)境下的吸收變化差異?；谥兴幍亩喑煞謱傩员菊n題組提出了中藥生物藥劑學(xué)分類系統(tǒng)（biopharmaceutics classification system of Chinese materia medica，CMMBCS）[4]。本文在研究中藥多成分環(huán)境下的滲透性時，首先要對吸收的目標(biāo)成分進(jìn)行鎖定，同時要充分考慮多成分環(huán)境下其他成分對目標(biāo)成分的影響，然后再對吸收成分的吸收程度進(jìn)行系統(tǒng)分析和定量研究。

小腸是藥物吸收的重要部位，目前，預(yù)測藥物小腸吸收的方法主要有分為體外法、離體法、在體法3種[5-7]。體外法主要有Caco-2細(xì)胞模型、平行人工膜等，離體法主要采用翻轉(zhuǎn)腸囊實(shí)驗(yàn)，離體法則涉及翻轉(zhuǎn)腸囊法。體內(nèi)法通常采用經(jīng)典的單向腸灌流法、以及腸灌流并行采血法。本課題組前期通過離體法翻轉(zhuǎn)腸囊實(shí)驗(yàn)研究了荷葉中荷葉堿、蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮素、紫云英苷的腸滲透性，但由于兒茶素、去甲基荷葉堿，山柰酚等成分在荷葉總提取物中含量本身比較低，翻轉(zhuǎn)腸囊實(shí)驗(yàn)未能進(jìn)一步探索其腸滲透情況，該方法對成分的判斷有失準(zhǔn)確[8]。為了進(jìn)一步對荷葉成分進(jìn)行腸滲透性定量分析，本研究采用大鼠在體單向腸灌流（SPIP）實(shí)驗(yàn)對荷葉中確定單成分進(jìn)行灌流實(shí)驗(yàn)，該方法較好地模擬人體的體內(nèi)環(huán)境，不損傷研究部位的循環(huán)系統(tǒng)和生理環(huán)境，且結(jié)果與人體試驗(yàn)結(jié)果相關(guān)性良好[9-10]。古籍記載荷葉具有減肥降脂的功效[11]，荷葉多成分是通過多靶點(diǎn)發(fā)揮降脂減肥作用[12-14]。本研究選用荷葉為研究對象，采用在體單向腸灌流模型，研究荷葉多成分整體的腸滲透性，明確荷葉多成分中的易吸收透過腸壁和難于透過腸壁屏障的成分，為中藥生物藥劑學(xué)分類系統(tǒng)的后續(xù)研究提供一定的理論和技術(shù)參考。

1 材料

1.1 儀器

LC-20AT高效液相色譜儀（SPD-20A型紫外檢測器，SIL-20A自動進(jìn)樣器，日本島津公司）；BT-25S電子分析天平（北京賽多利斯儀器有限公司）；DZKW-4 電熱恒溫水浴鍋（北京中興偉業(yè)儀器有限公司）；KH7200DB型數(shù)控超聲波清洗器（昆山超聲儀器有限公司）；STARTER2100實(shí)驗(yàn)室pH計（奧豪斯儀器上海有限公司）；注射泵（LSP02-1B，保定蘭格恒流泵有限公司）；高速冷凍離心機(jī)（GL-21M，上海滬湘儀離心機(jī)有限公司）。

1.2 藥物與試劑

荷葉藥材購自中國北京同仁堂（集團(tuán)）有限責(zé)任公司，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)王晶娟副教授鑒定為睡蓮科植物蓮Nelumbo nuifera Gaertn的干燥葉，對照品葉堿（批號J04M6Y1，上海源葉生物科技有限公司）、蘆丁（批號Y05M6S1，上海源葉生物科技有限公司）、金絲桃苷（批號08916-418，美國ChromaDex）、異槲皮苷（批號HJ0604XA13，上海源葉生物科技有限公司）、槲皮素（批號Y26D5Y1，上海源葉生物科技有限公司）、紫云英苷（批號KS0910CB14，上海源葉生物科技有限公司）；乙腈購買于美國Fisher公司（色譜級）；磷酸、氯化鎂、氯化鈉、磷酸二氫鈉、氯化鉀、氯化鈣、碳酸氫鈉、葡萄糖購買于北京化工廠（分析級）；娃哈哈純凈水購買于娃哈哈集團(tuán)公司（中國杭州）。

1.3 動物

SD大鼠，雄性，體重200～250 g，斯貝福（北京）實(shí)驗(yàn)動物科技有限公司提供，許可證號SCXK（京）2011-0004。

2 方法

2.1 溶液配制

2.1.1 對照品溶液

精密稱取各對照品5.0 mg于10 mL量瓶，甲醇稀釋至刻度，搖勻，得500 mg·L-1對照品儲備液。精密量取各儲備液3.0 mL于50 mL量瓶，甲醇稀釋至刻度，搖勻后，精密量取各對照品適量于50 mL量瓶，甲醇定容，搖勻，即得一定濃度的混合對照品溶液。

2.1.2 Krebs-Ringer′s營養(yǎng)液（K-R液）

稱取NaCl 7.8 g，KCl 0.35 g，CaCl2 0.37 g，NaHCO3 1.37 g，NaH2PO4 0.32 g，MgCl2 0.02 g，葡萄糖1.4 g，加去離子水定容至1 000 mL，即得。

2.1.3 荷葉提取物溶液的制備

荷葉藥材粉碎，得粗粉，稱取5 g，以60%乙醇固料比1∶30回流提取1 h，提取液趁熱抽濾，放冷定容至250 mL，搖勻，過0.45 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液供HPLC分析。

2.1.4 灌流液制備

稱取適量的荷葉對照品，以K-R液溶解得到不同濃度的腸灌流液。取荷葉醇提液用K-R液稀釋至一定生藥濃度的灌流液。

2.2 荷葉多成分HPLC分析方法的建立

2.2.1 色譜條件

2.2.1.1 荷葉可標(biāo)識單成分色譜條件 Phenomenex Gemini C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量20 μL；流動相水（A，含0.025%磷酸）-乙腈（B），梯度洗脫。各成分檢測波長、流速、流動相比例見表1。

2.2.1.2 荷葉提取物色譜條件 Phenomenex Gemini C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；檢測波長270 nm；流速0.8 mL·min-1；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量20 μL；流動相0.025%磷酸（A）-乙腈（B），梯度洗脫 （0～2 min，98∶2；2～5 min，98∶2～92∶8；5～8 min，92∶8；8～11 min，92∶8～88∶12；11～17 min，88∶12；17～25 min，88∶12～85∶15；25～43 min，85∶15；43～61 min，85∶15～74∶26；61～70 min，74∶26；70～89 min，74∶26～25∶75；89～90 min，25∶75；90～98 min，25∶75～98∶2；98～120 min，98∶2）。

2.2.2 定量分析方法學(xué)考察

2.2.2.1 專屬性考察 荷葉可標(biāo)識單成分：分別取空白腸灌流液、含對照品灌流液進(jìn)行HPLC檢測分析，空白腸灌流液對荷葉定量成分檢測無影響，說明方法專屬性良好，結(jié)果見圖1。

荷葉多成分：分別取空白腸灌流液、含混標(biāo)對照品灌流液進(jìn)行HPLC檢測分析，空白腸灌流液、荷葉總提取物溶液對荷葉定量成分檢測無影響，說明方法專屬性良好，結(jié)果見圖2。

2.2.2.2 線性與范圍 荷葉可標(biāo)識單成分：分別量取一定體積0.5 g·L-1的對照品儲備液于容量瓶中并定容，配成不同濃度的對照品溶液，分別精密取上述對照品溶液20 μL注入高效液相，記錄各成分峰面積，以藥物質(zhì)量濃度X（mg·L-1）為橫坐標(biāo)，峰面積Y為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸。結(jié)果表明各對照品在相應(yīng)濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，見表2。

荷葉多成分：分別量取一定體積0.5 g·L-1的對照品儲備液于量瓶中并定容，配成不同濃度的混標(biāo)溶液，分別精密取上述混標(biāo)溶液20 μL注入高效液相，記錄峰面積，以藥物質(zhì)量濃度X（mg·L-1）為橫坐標(biāo)，峰面積Y為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸。結(jié)果表明各對照品在相應(yīng)濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，結(jié)果見表3。

2.2.2.3 精密度考察 荷葉可標(biāo)識單成分：分別配制不同濃度的對照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6 針，記錄峰面積，計算RSD。各濃度下RSD均小于2%，說明方法精密度良好。

荷葉多成分：分別配制不同濃度的混合對照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6針，記錄峰面積，計算RSD。各濃度下，RSD均小于2%，說明方法精密度良好。

2.2.2.4 重復(fù)性考察 荷葉可標(biāo)識單成分：分別精密量取對照品母液于50 mL量瓶，以K-R′s試液定容，搖勻后，以甲醇稀釋至一定比例，樣品通過0.22 μm微孔濾膜后進(jìn)行HPLC檢測，記錄峰面積，并計算RSD，所有樣品重復(fù)操作5次。結(jié)果表明RSD均小于2%，說明方法重復(fù)性良好。

荷葉多成分：分別精密量取對照品母液于50 mL量瓶，以K-R′s試液定容，搖勻后即得一定濃度的混合對照品溶液，以甲醇稀釋至一定比例，樣品過膜后進(jìn)行HPLC檢測，記錄峰面積，計算RSD，樣品重復(fù)操作6次。結(jié)果RSD<3%，說明方法重復(fù)性良好。

2.2.2.5 回收率考察 荷葉可標(biāo)識單成分：取空白腸灌流液，分別加入不同量的對照品，以HPLC測定其含量，計算回收率，樣品回收率RSD在95.28%～100.8%，說明方法準(zhǔn)確度良好。

荷葉多成分加樣回收率考察：取指標(biāo)成分已知濃度的荷葉提取物腸灌流液，分別加入不同量的對照品，以HPLC測定其含量，計算回收率，結(jié)果表明回收率在86.85%～105.7%。

2.3 荷葉單成分腸滲透性研究

2.3.1 大鼠在體腸灌流操作方法

大鼠禁食不禁水12～18 h，腹腔注射10%水合氯醛（3 μL·g-1）麻醉。沿中線打開腹部，選取合適長度腸段，用生理鹽水沖洗干凈。注射泵與腸段入口端相連，設(shè)置灌流速度為0.2 mL·min-1，持續(xù)灌流約30 min吸收達(dá)到穩(wěn)定后重新計時，每隔15 min用已知質(zhì)量的小瓶在腸段出口端收集流出藥液，計算收集前后小瓶重量稱量差，同時測定收集液的密度，以此方法來進(jìn)行灌流液的體積校正。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后剪下被灌流的腸段并處死大鼠，測量腸段的長度及內(nèi)徑。HPLC測定流出灌流液中待測成分含量。

2.3.2 在體單向腸灌流法相關(guān)計算方法[15]

在體灌流法腸有效滲透系數(shù)Peff計算公式如下。

Peff=-Qin·ln（Cout（cor）/C0）2πrL

Qout=Mout/Doutt

Cout（cor）=CoutQoutQin

Qin為灌流液流速（mL·min-1）；C0為灌流液荷葉成分的初始濃度（mg·L-1）；L是灌流腸段長度（cm）；r為灌流腸段半徑（cm）；Cout（cor）荷葉成分灌流收集液校正濃度（mg·L-1）；Qout為灌流液流出的流速（mL·min-1）；Cout為灌流收集液中荷葉成分的濃度（mg·L-1）；Dout為灌流收集液密度（g·mL-1）；t為取樣周期（min）；Mout為灌流收集液質(zhì)量（g）。

3 結(jié)果

3.1 荷葉可標(biāo)識單成分、多成分HPLC圖的建立

3.1.1 荷葉可標(biāo)識單成分HPLC圖的建立

3.1.1.1 荷葉可標(biāo)識單成分HPLC圖 本研究建立了荷葉可標(biāo)識單成分HPLC圖譜，空白腸灌流液、荷葉總提取物溶液對荷葉定量成分檢測無影響，說明方法專屬性良好，結(jié)果見圖1。

3.1.1.2 荷葉可標(biāo)識單成分標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 以藥物質(zhì)量濃度X（mg·L-1）為橫坐標(biāo)，峰面積Y為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，結(jié)果表明各對照品在相應(yīng)濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，見表2，

3.1.2 荷葉多成分HPLC圖的建立

3.1.2.1 荷葉多成分HPLC圖 為了考察荷葉成分吸收變化情況，本研究建立了荷葉化學(xué)成分HPLC圖譜，空白腸灌流液、荷葉總提取物溶液對荷葉定量成分檢測無影響，說明方法專屬性良好，結(jié)果見圖1。

3.1.2.2 荷葉多成分標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 以藥物質(zhì)量濃度X（mg·L-1）為橫坐標(biāo)，峰面積Y為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，結(jié)果表明各對照品在相應(yīng)濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，見表3。

3.2 荷葉多成分腸滲透性研究

3.2.1 荷葉可標(biāo)識單成分吸收

采用在體單向灌流對荷葉中明確的單成分進(jìn)行滲透性研究，荷葉中可標(biāo)識單體成分有效滲透系數(shù)見表4，可以看出荷葉中荷葉堿、去甲基荷葉堿、蘆丁、異槲皮苷、紫云英苷、槲皮素、山柰酚成分Peff大于0.5 ×10-4cm·s-1，在BCS腸滲透屬性中，這些成分為高滲透性成分，而兒茶素、金絲桃苷為低滲透性成分。

3.2.2 荷葉提取物吸收情況

3.2.2.1 荷葉提取物中可標(biāo)識成分吸收情況 在荷葉多成分環(huán)境下，可標(biāo)識成分有效滲透系數(shù)見表5，結(jié)果表明，單成分僅有兒茶素、金絲桃苷是低滲透性藥物成分，但是在多成分環(huán)境下，成分的滲透行為并不是一成不變的，去甲基荷葉堿與蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷、紫云英苷等荷葉黃酮苷類成分整體滲透率有降低的趨勢，蘆丁的滲透系數(shù)出現(xiàn)了跨象限的現(xiàn)象，多成分環(huán)境下，蘆丁成分由高滲透性變?yōu)榈蜐B透性，而山柰酚滲透系數(shù)則增大。

3.2.2.2 荷葉提取物中不可標(biāo)識成分吸收情況 由HPLC圖，選取已知成分異槲皮苷作為內(nèi)標(biāo)物，計算其他較高含量成分的相對保留時間及相對含量，并計算其腸有效滲透系數(shù)，結(jié)果見圖3，表6。

結(jié)果表明，其他含量比較高的成分中7個成分中，X1，X2，X6的Peff大于0.5×10-4 cm·s-1，依據(jù)BCS屬于高滲透性成分，成分X3，X4，X5，X7則低于該值，屬于BCS的低滲透性成分。

4 討論

4.1 荷葉整體腸滲透性實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

對荷葉中已知的單成分進(jìn)行了腸滲透性考察，既定成分已經(jīng)有了比較明確的腸滲透歸屬，9個成分中僅有兒茶素與金絲桃苷的Peff小于0.5×10-4 cm·s-1，其他成分均大于該限度，兒茶素與金絲桃苷屬于低滲透性成分，而其他成分為高滲透性成分。但是，在荷葉總提取物這一復(fù)雜環(huán)境下，對應(yīng)成分的腸滲透性情況可能會發(fā)生變化，最為顯著的是蘆丁的滲透系數(shù)出現(xiàn)了跨象限的現(xiàn)象，多成分環(huán)境下，蘆丁成分由高滲透性變?yōu)榈蜐B透性，多成分環(huán)境下，荷葉中的去甲基荷葉堿與蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷、紫云英苷等荷葉黃酮苷類成分整體滲透率有降低的趨勢，而山柰酚滲透系數(shù)增大，可能是其他成分促滲作用導(dǎo)致。因此，研究清楚荷葉多成分在整體環(huán)境下的腸滲透性，明確多成分環(huán)境下成分吸收變化規(guī)律具有重要的意義。

4.2 基于腸滲透性的成分吸收評價研究

腸滲透性是藥物進(jìn)行BCS分類的基本屬性之一[16]，根據(jù)其強(qiáng)弱將藥物分為高滲透性藥物（強(qiáng)吸收成分）和低滲透性藥物（弱吸收成分）[2]。就中藥而言，中藥成分本身滲透性有差異，同時多成分環(huán)境下也會導(dǎo)致滲透性產(chǎn)生差異，因此在考察成分滲透性時，要同時考察對單成分滲透行為和整體多成分環(huán)境對滲透性的影響。藥物的滲透性差異，其吸收行為就有差異，必然導(dǎo)致其發(fā)揮藥效的機(jī)制不同，對于高滲透性的藥物，藥物多是吸收進(jìn)入體內(nèi)發(fā)揮療效，而對于低滲透性藥物，則多是滯留在腸道內(nèi)，因此在研究藥物發(fā)揮療效的機(jī)制時，對于腸滲透性差的藥物，可以考慮基于腸道吸收前靶點(diǎn)的活性研究，而對于腸滲透性較好的藥物成分，考慮其在吸收過程中以及吸收后靶點(diǎn)藥效研究。

荷葉是經(jīng)典的藥食兩用的減肥藥材，降脂減肥的臨床功效得到普遍認(rèn)可，荷葉中含有大量的減肥有效成分，主要是生物堿類和黃酮類成分，還有多酚類、有機(jī)酸類成分等[17]。但其發(fā)揮減肥作用的機(jī)制尚不明確，其中脂肪酶抑制是非常典型降脂減肥機(jī)制，針對荷葉生物堿、黃酮總提取物以及部分單體成分的脂肪酶抑制活性已經(jīng)有研究[18]，但各成分之間協(xié)同作用，如何發(fā)揮療效，未見文獻(xiàn)報道。為了明確荷葉多成分的減肥降脂機(jī)制，首先對荷葉進(jìn)行吸收行為考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，荷葉多成分中有滲透性好的成分，也有腸滲透性差的成分，且多成分環(huán)境下腸滲透性受到成分間相互作用影響發(fā)生改變。因此，研究荷葉發(fā)揮降脂的機(jī)制，低滲透性成分可能因在腸道滯留時間長，結(jié)合像脂肪酶一樣的腸道吸收前靶點(diǎn)發(fā)揮作用，而高滲透性成分如荷葉堿，可能是吸收過程中或吸收進(jìn)入體內(nèi)經(jīng)過其他降脂靶點(diǎn)發(fā)揮療效，除此之外，還要考慮荷葉多成分在發(fā)揮藥效時的相互影響。綜上所述，荷葉發(fā)揮減肥降脂的機(jī)制及其關(guān)系，需進(jìn)一步研究。

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[責(zé)任編輯 孔晶晶]