李萌+周琴+范盎然+胡葉+楊萌+左明煥

[摘要] 目的 研究華蟾素（CINO）對人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞增殖的影響及其作用機(jī)制。 方法 體外培養(yǎng)SW480細(xì)胞，取對數(shù)期細(xì)胞以4×103個/孔接種于96孔板中，用培養(yǎng)液定容至總體積200 μL，隨機(jī)分為四組：空白對照組（Control組，200 μL培養(yǎng)基）和CINO 1 mg/mL組（用培養(yǎng)基稀釋500倍取200 μL）、CINO 10 mg/mL組（用培養(yǎng)基稀釋50倍取200 μL）、CINO 100 mg/mL組（用培養(yǎng)基稀釋5倍取200 μL），采用MTT法檢測CINO對SW480細(xì)胞的生長抑制作用，倒置熒光顯微鏡實(shí)時成像技術(shù)觀察SW480細(xì)胞凋亡形態(tài)，酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）法檢測CINO對SW480細(xì)胞血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）及血管內(nèi)皮生長因子受體2（VEGF-R2）表達(dá)的影響。 結(jié)果 作用24、48、72 h后，MTT結(jié)果顯示CINO 1、10、100 mg/mL組A540值均較Control組顯著下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。作用0、24、48 h后，倒置熒光顯微鏡觀察CINO組（1、10、100 mg/mL）細(xì)胞凋亡數(shù)明顯多于空白對照組。ELISA結(jié)果顯示，CINO組能減少SW480細(xì)胞VEGF及VEGF-R2的蛋白表達(dá)，與空白對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。 結(jié)論 CINO能抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)其凋亡，其機(jī)制可能與抑制腫瘤細(xì)胞自分泌VEGF、VEGF-R2有關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 結(jié)腸癌；華蟾素；SW480細(xì)胞；細(xì)胞凋亡；血管內(nèi)皮生長因子

[中圖分類號] R735.302 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）03（c）-0004-05

Effect of cinobufacini on proliferation of human colon cancer SW480 cells and study on its mechanism

LI Meng* ZHOU Qin* FAN Angran HU Ye YANG Meng ZUO Minghuan▲

Department of Oncology， Dongfang Hospital， Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100078， China

[Abstract] Objective To study the effect of cinobufacini （CINO） on proliferation of human colon cancer SW480 cells and its mechanism. Methods The SW480 cells were cultured generally， the cells at logarithmic phase were inoculated into 96-well plates by 4×103/hole， the nutrient solution was used to filled to total volume 200 μL， and they were randomly divided into four groups： blank control group （control group， 200 μL complete medium）， CINO 1 mg/mL group （CINO was diluted to 500 times using complete medium and take 200 μL）， CINO 10 mg/mL group （CINO was diluted to 50 times using complete medium and take 200 μL）， CINO 100 mg/mL group （CINO was diluted to 5 times using complete medium and take 200 μL）. The anti-proliferative effect of CINO for SW480 cells was measured by MTT assay. The apoptotic morphology of SW480 cells were observed with inverted real-time fluorescence microscopy imaging. Enzyme linked immunosorbent assay （ELISA） method was used to detect the effects of SW480 cells for the expression of vascular endothelial growth factor （VEGF） and vascular endothelial growth factor receptor-2 （VEGF-R2）. Results After 24， 48， 72 h， the MTT test showed that compared with the control group， the A540 of CINO 1， 10， 100 mg/mL groups was dropped significantly， the difference was statistically significant （P < 0.05）. After 0， 24， 48 h， the inverted real-time fluorescence microscopy imaging showed that the number of apoptotic cells in CINO group （1， 10， 100 mg/mL） were significantly higher than those of control group. Compared with the control group， ELISA results showed that CINO group could reduce the protein expression of VEGF and VEGF-R2， the difference was statistically significant （P < 0.05）. Conclusion CINO can inhibit the proliferation of colonic cancer cells， and induces apoptosis， and its mechanism may be related to inhibiting the autocrine of VEGF and VEGF-R2 in cancer cells.

[Key words] Colon cancer； Cinobufacini； SW480 cells； Cell apoptosis； Vascular endothelial growth factor

結(jié)腸癌（colon cancer）是全球最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率仍然呈逐年增高的趨勢[1]。在結(jié)腸癌的形成、進(jìn)展、浸潤和遷移中，腫瘤細(xì)胞自分泌的血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）及其受體VEGF-R2扮演著重要的角色。華蟾素（cinobutacini，CINO）注射液是中華大蟾蜍皮經(jīng)加工制成的水溶性制劑，在臨床上廣泛應(yīng)用于治療結(jié)腸癌[2]。本研究旨在觀察CINO在體外對人結(jié)腸癌細(xì)胞系SW480生長增殖及細(xì)胞凋亡形態(tài)的影響以及分泌VEGF、VEGF-R1、VEGF-R2的代謝變化，為結(jié)腸癌的治療提供新思路及實(shí)驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)及細(xì)胞分組

人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞系購于中國科學(xué)院細(xì)胞庫。SW480細(xì)胞使用RPMI1640完全培養(yǎng)基中（內(nèi)含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素，100 μg/mL鏈霉素），在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞經(jīng)胰酶消化、傳代和收獲，取對數(shù)生長期細(xì)胞，胰酶消化后進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，以4×103個/孔接種于96孔板中，用培養(yǎng)液定容至總體積200 μL，細(xì)胞貼壁后更換培養(yǎng)基，加入待測藥物，隨機(jī)分為四組：①Control組（200 μL培養(yǎng)基）；②CINO 1 mg/mL組（用培養(yǎng)基稀釋500倍取200 μL）；③CINO 10 mg/mL組（用培養(yǎng)基稀釋50倍取200 μL）；④CINO 100 mg/mL組（用培養(yǎng)基稀釋5倍取200 μL）。包裝細(xì)胞PT-67 RFP，包裝細(xì)胞PT-67 H2b GFP由安泰康生物技術(shù)（北京）有限公司構(gòu)建提供。

1.2 藥品和試劑

CINO（5 mL，500 mg/mL，批號20150314）購自安徽華潤金蟾有限公司，用時使用RPMI1640完全培養(yǎng)基（購自CORNING公司，批號為20141010）稀釋至所需濃度。PBS（購自CORNING公司，批號為20140110）0.25%胰酶、Geneticin（G418Sulfate）購自Gibco公司（批號為20150106、20141220），DMSO（購自Sigma公司，批號為20150105），MTT（購自Amresco公司，批號為20141120），Hygromycin B購自Invitrogen（批號為106 87010），VEGF Human酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）Kit、Human VEGF-R2 ELISA BMS2019購自Abcam公司（批號分別為ab100665、ab100662）。

1.3 MTT法檢測細(xì)胞增殖抑制率并繪制生長曲線

取對數(shù)生長期的Control組、CINO組（1、10、100 mg/mL）SW480細(xì)胞，每個組設(shè)置6個平行復(fù)孔，分別于24、48、72 h進(jìn)行MTT檢測，每孔加入20 μL的MTT溶液，CO2培養(yǎng)箱孵育4 h后，去上清，加入100 μL/孔DMSO溶液，充分溶解后，酶標(biāo)儀測定540 nm吸光值（A）。計算細(xì)胞生長抑制率，繪制生長曲線。

1.4 倒置熒光顯微鏡觀察細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化

1.4.1 雙色熒光細(xì)胞的轉(zhuǎn)染與篩選 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染雙色熒光細(xì)胞，是通過將綠色熒光蛋白（GFP）特異性轉(zhuǎn)入已有的表達(dá)紅色熒光蛋白（RFP）細(xì)胞的細(xì)胞核中進(jìn)行穩(wěn)定表達(dá)。將包裝細(xì)胞PT-67 H2b RFP培養(yǎng)至對數(shù)期，收集培養(yǎng)4 h的新鮮上清液，0.22 μm濾膜過濾后，對SW480細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染后可見部分細(xì)胞質(zhì)表達(dá)RFP，用Hygromycin B及G418進(jìn)行單克隆篩選得到SW480 RFP。再用同樣方法對SW480 RFP進(jìn)行轉(zhuǎn)染，最終得到雙色熒光轉(zhuǎn)染的SW480細(xì)胞（SW480 DUAL）。

1.4.2 熒光顯微鏡下形態(tài)學(xué)觀察 將雙色熒光人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480 DUAL細(xì)胞分為Control組及CINO組（1、10、100 mg/mL），CO2培養(yǎng)箱孵育0、24、48 h，倒置熒光顯微鏡進(jìn)行成像，觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.5 ELISA法檢測VEGF、VEGF-R2表達(dá)

1.5.1 ELISA法檢測VEGF表達(dá) 取Control組及CINO組（1、10、100 mg/mL）干預(yù)48 h后的人結(jié)腸癌細(xì)胞SW480的上清液，1000 r/min離心20 min再取上清（離心半徑15 cm），嚴(yán)格按照試劑盒說明操作，將不同濃度的VEGF標(biāo)準(zhǔn)品（8.23、24.69、74.07、222.2、666.7、2000、6000 pg/mL）以及不同組的細(xì)胞上清液于酶標(biāo)儀中檢測450 nm吸光度值和上清中VEGF吸光度值，每個濃度設(shè)3個平行孔，計算VEGF含量。

1.5.2 ELISA法檢測VEGF-R2表達(dá) 將CINO組（1、10、100 mg/mL）及Control組的細(xì)胞上清棄掉，加細(xì)胞裂解液，離心后取上清，將不同濃度的VEGF-R2標(biāo)準(zhǔn)品（78.125、156.25、312.5、625、1250、2500、5000 pg/mL）以及不同組的細(xì)胞上清液于酶標(biāo)儀中檢測并計算VEGF-R2含量。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，計量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，對成組設(shè)計的多個樣本均數(shù)的比較進(jìn)行方差分析，組間兩兩比較采用獨(dú)立樣本t檢驗。計數(shù)資料行χ2檢驗。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 華蟾素對人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞增殖的影響

MTT法結(jié)果顯示，作用24、48 h及72 h后，不同濃度CINO組與Control組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05），見表1。藥物濃度越高，作用時間越長，CINO對SW480細(xì)胞的抑制作用越強(qiáng)，見圖1。

2.2 華蟾素對人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞凋亡形態(tài)的影響

2.2.1 不同濃度華蟾素干預(yù)0 h的細(xì)胞形態(tài)比較 SW480 DUAL細(xì)胞經(jīng)過過夜貼壁，在0 h時間點(diǎn)，各組細(xì)胞形態(tài)正常，RFP在細(xì)胞質(zhì)表達(dá)，GFP在細(xì)胞核表達(dá)，細(xì)胞數(shù)量較少。見圖2。

2.2.2 不同濃度華蟾素干預(yù)24 h的細(xì)胞形態(tài)比較 經(jīng)過24 h后，Control組細(xì)胞增殖較快，大小均一，核質(zhì)分明（圖3A），CINO組（1、10、100 mg/mL）中，隨著華蟾素濃度的增高，橢球形細(xì)胞逐漸增多（圖3B～D），并且可見散落的細(xì)胞核碎片，細(xì)胞死亡已經(jīng)開始。

2.2.3 不同濃度華蟾素干預(yù)48 h的細(xì)胞形態(tài)比較 48 h后，Control組細(xì)胞呈現(xiàn)明顯快速增殖，細(xì)胞形態(tài)正常（圖4A），CINO組（1 mg/mL、10 mg/mL、100 mg/mL）（圖4B～D）出現(xiàn)明顯細(xì)胞形態(tài)失常，出現(xiàn)明顯的核環(huán)狀結(jié)構(gòu)、核碎裂的細(xì)胞凋亡形態(tài)，空泡細(xì)胞質(zhì)，散落的細(xì)胞碎片明顯可見，隨著濃度濃度增高，病變越明顯，其中最高劑量組（圖4D）出現(xiàn)大量明顯凋亡形態(tài)學(xué)特征（核環(huán)狀結(jié)構(gòu)）。

2.3 ELISA檢測VEGF、VEGF-R2的表達(dá)

2.3.1 ELISA檢測VEGF含量 CINO組（1、10、100 mg/mL）VEGF蛋白的表達(dá)量分別為（271.10±0.32）、（240.99±18.63）、（207.76±18.97）pg/mL，與Control組[（285.65±31.12）pg/mL]比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05），說明華蟾素呈濃度依賴性抑制SW480細(xì)胞分泌VEGF。

2.3.2 ELISA檢測VEGF-R2含量 CINO組（1、10、100 mg/mL）VEGF-R2蛋白的表達(dá)量分別為（318.10±34.54）、（193.98±4.75）、（150.76±18.97）pg/mL，與Control組[（448.44±190.07）pg/mL]比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05），說明華蟾素呈濃度依賴性抑制SW480細(xì)胞分泌VEGF-R2。

3 討論

結(jié)腸癌的發(fā)病率逐年上升，病死率則位居癌癥死亡原因第5位[1]。中醫(yī)藥治療腫瘤歷史悠久，近年來日益成為結(jié)腸癌綜合治療的重要組成部分[3-5]。

在中藥抗腫瘤機(jī)制的研究中，VEGF及其受體的表達(dá)與結(jié)合一直是當(dāng)前腫瘤治療中的研究熱點(diǎn)。VEGF是1989年Ferrara等[6]從牛的垂體濾泡細(xì)胞中分離出的一種能選擇性促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂的蛋白質(zhì)。腫瘤細(xì)胞分泌VEGF的方式分為旁分泌和自分泌兩種形式。惡性腫瘤細(xì)胞分泌產(chǎn)生的VEGF可作用于相鄰基質(zhì)血管內(nèi)皮細(xì)胞VEGF受體（主要為VEGF-R2），以此促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂、增殖，誘導(dǎo)腫瘤血管新生，此為VEGF的旁分泌作用。近年來，有研究表明某些惡性腫瘤細(xì)胞可選擇性地表達(dá)VEGF受體，腫瘤細(xì)胞分泌的VEGF通過作用于上述表面受體使之發(fā)生磷酸化，進(jìn)而激發(fā)胞內(nèi)蛋白質(zhì)發(fā)生一系列磷酸化反應(yīng)形成所謂的腫瘤細(xì)胞VEGF自分泌環(huán)[7-12]，此為VEGF的自分泌作用，而抑制腫瘤細(xì)胞自分泌VEGF及其受體也成為了腫瘤藥物研究的新靶點(diǎn)。

CINO中的多種成分無論在臨床研究中還是在實(shí)驗研究中都被證實(shí)有明確的抗腫瘤作用[13]。然而既往的國內(nèi)外研究中，多數(shù)探討的為CINO誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的機(jī)制[14-18]，甚少有人從中藥抑制結(jié)腸癌細(xì)胞自分泌VEGF及其受體的角度探討中藥治療結(jié)腸癌的不同機(jī)制。

本研究中MTT實(shí)驗及繪制的生長曲線說明CINO能顯著抑制SW480細(xì)胞的生長增殖能力，且呈一定的量效與時效關(guān)系。采用腫瘤細(xì)胞的熒光蛋白轉(zhuǎn)染技術(shù)，能夠直觀動態(tài)監(jiān)測腫瘤細(xì)胞生長、凋亡、轉(zhuǎn)移[19-21]。由雙色熒光細(xì)胞成像圖可見，CINO對人結(jié)腸癌細(xì)胞SW480有明顯的增殖抑制、誘發(fā)凋亡的作用，并且隨著時間延長和濃度增加，抑制增殖和促進(jìn)凋亡的作用越強(qiáng)。ELISA顯示CINO能使VEGF及VEGF-R2蛋白表達(dá)下降，并呈濃度依賴性，提示CINO能抑制SW480細(xì)胞的增殖作用，其機(jī)制可能與下調(diào)VEGF及VEGF-R2表達(dá)有關(guān)。這為CINO治療結(jié)腸癌提供了客觀的實(shí)驗依據(jù)，同時也為進(jìn)一步探討CINO抗腫瘤分子機(jī)制提供部分研究基礎(chǔ)。

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（收稿日期：2016-12-09 本文編輯：張瑜杰）