趙傳景，李 江，孫云飛，劉發(fā)義

(1.青島澳海生物有限公司，山東 青島 266101； 2.國(guó)家海洋局 第一海洋研究所，山東 青島 266061)

富含共軛亞油酸磷脂的制備工藝

趙傳景1，李 江2，孫云飛1，劉發(fā)義1

(1.青島澳海生物有限公司，山東 青島 266101； 2.國(guó)家海洋局 第一海洋研究所，山東 青島 266061)

采用甲醇鈉為催化劑，以大豆粉末磷脂和共軛亞油酸乙酯為原料，通過(guò)酯交換反應(yīng)制備富含共軛亞油酸磷脂。通過(guò)研究反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間、催化劑用量、共軛亞油酸乙酯與大豆粉末磷脂摩爾比對(duì)反應(yīng)的影響，得出最優(yōu)制備工藝條件為：反應(yīng)溫度130℃，反應(yīng)時(shí)間3 h，催化劑用量為大豆粉末磷脂質(zhì)量的4%，共軛亞油酸乙酯與大豆粉末磷脂摩爾比4∶1。在最優(yōu)制備工藝條件下得到的磷脂產(chǎn)品中共軛亞油酸總含量可達(dá)59.23%，其中兩種主要異構(gòu)體c9，t11-CLA和t10，c12-CLA的含量分別為27%和29%左右。

磷脂；共軛亞油酸；甲醇鈉

磷脂廣泛存在于動(dòng)植物體的重要組織中，幾乎所有的細(xì)胞中都含有磷脂，它是細(xì)胞膜的基本組成成分，是重要的生命物質(zhì)。同時(shí)磷脂還具有調(diào)節(jié)血脂、改善記憶、延緩衰老、保護(hù)肝臟等多種重要生理功能[1-2]。磷脂的生理活性與其脂肪酸組成和極性末端的組成密切相關(guān)，富含功能性脂肪酸的磷脂有很高的藥用價(jià)值；另外，多不飽和脂肪酸(PUFA)改性磷脂具有促進(jìn)PUFA吸收的作用[3]。

共軛亞油酸(CLA)是亞油酸的異構(gòu)體，普遍存在于人和動(dòng)物體內(nèi)。研究表明，共軛亞油酸作為一種新發(fā)現(xiàn)的營(yíng)養(yǎng)素，具有抗癌、預(yù)防心血管疾病、糖尿病、降低體內(nèi)脂肪、提高免疫等多種生理活性[4-8]。共軛亞油酸與磷脂結(jié)合在一起，不僅能增強(qiáng)共軛亞油酸的氧化穩(wěn)定性，并且兩者具有協(xié)同增效作用。國(guó)內(nèi)外關(guān)于結(jié)構(gòu)磷脂的研究已有相關(guān)報(bào)道，常見(jiàn)用于和磷脂反應(yīng)的脂肪酸有中長(zhǎng)鏈飽和脂肪酸、EPA、DHA、CLA和ARA等[9-11]，但大多采用酶法進(jìn)行催化反應(yīng)[12-15]。酶法具有反應(yīng)條件溫和、產(chǎn)生的廢水少等優(yōu)點(diǎn)，但酶催化反應(yīng)速度慢，而且商業(yè)酶價(jià)格昂貴，在工業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用中仍存在諸多限制。

本文報(bào)道了以大豆粉末磷脂和共軛亞油酸乙酯為原料，采用甲醇鈉進(jìn)行催化，合成富含共軛亞油酸磷脂(CLA-PL)，該工藝反應(yīng)速度快、成本低，易于實(shí)現(xiàn)工業(yè)化推廣應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 原料與試劑

大豆粉末磷脂(PL)，北京美亞斯磷脂技術(shù)有限公司，丙酮不溶物含量大于95%；共軛亞油酸乙酯(CLA-EE)，青島澳海生物有限公司，其中CLA含量為80%左右；甲醇鈉，粉末狀，山東富喜爾化學(xué)有限公司；丙酮、氫氧化鈉、三氯甲烷、三氟化硼、甲醇等均為分析純。PL和CLA-EE的脂肪酸組成見(jiàn)表1。

表1 原料PL和CLA-EE的主要脂肪酸組成 %

1.1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 7890B氣相色譜儀，予華DF-101S油浴鍋，Sigma 5801臺(tái)式離心機(jī)，予華SHZ-(Ⅲ)D水循環(huán)真空泵。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 CLA-PL的制備

將PL和CLA-EE按照不同的比例混合、抽真空加熱，并在甲醇鈉的催化下進(jìn)行反應(yīng)，以得到富含CLA的磷脂粗品。將得到的粗品和一定量的丙酮混合均勻，于-18℃冷凍，然后離心分離，將沉淀反復(fù)用-18℃的丙酮洗滌并離心分離，取上層丙酮洗滌液滴于干凈玻璃板上揮干，觀察有無(wú)油跡存在，直至無(wú)油跡出現(xiàn)。將洗滌后的磷脂沉淀干燥至恒重。

1.2.2 磷脂中主要脂肪酸的測(cè)定

磷脂脂肪酸甲酯的制備參照GB/T 17376—2008中“5酯交換法”進(jìn)行。

氣相色譜條件：檢測(cè)器為氫火焰離子化檢測(cè)器(FID)；分析柱為SGE-AC20毛細(xì)管柱(30 m×0.22 mm，0.25 μm)；檢測(cè)器溫度250℃；進(jìn)樣口溫度260℃；柱溫200℃；載氣(氮?dú)?流速32 mL/min；進(jìn)樣量1 μL；氫氣流速50 mL/min；分流比20∶1。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)物的檢測(cè)結(jié)果

通過(guò)對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行氣相色譜分析發(fā)現(xiàn)，既檢測(cè)到磷脂脂肪酸的特征峰同時(shí)也檢測(cè)到共軛亞油酸的特征峰(見(jiàn)圖1)，該結(jié)果也表明實(shí)驗(yàn)獲得了CLA-PL。

圖1 CLA-PL的氣相色譜圖

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1 催化劑用量對(duì)CLA含量的影響

取PL 3 g和CLA-EE 10 g混合，在持續(xù)真空條件下(-0.1 MPa)加熱到130℃，然后分別加入PL質(zhì)量0.5%、1%、2%、3%、4%和5%的甲醇鈉，130℃攪拌反應(yīng)3 h后取樣進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如表2所示。

表2 催化劑用量對(duì)CLA含量的影響

由表2可看出，當(dāng)催化劑用量為4%時(shí)，CLA兩種異構(gòu)體c9，t11-CLA和t10，c12-CLA的含量分別為23.64%和25.25%，CLA的總含量達(dá)到51.32%，顯著高于0.5%～3%催化劑用量的結(jié)果；但隨著催化劑用量的繼續(xù)增加，產(chǎn)物中c9，t11-CLA和t10，c12-CLA以及CLA的總含量均出現(xiàn)下降的趨勢(shì)。因此，確定催化劑用量為4%。

2.2.2 反應(yīng)時(shí)間對(duì)CLA含量的影響

取PL 3 g和CLA-EE 10 g，催化劑用量為4%，在持續(xù)真空條件下(-0.1 MPa)加熱到130℃進(jìn)行反應(yīng)，分別于反應(yīng)1、2、3、4 h和5 h取樣進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如表3所示。

表3 反應(yīng)時(shí)間對(duì)產(chǎn)物中CLA含量的影響

由表3可看出，反應(yīng)1 h時(shí)，CLA及兩種異構(gòu)體c9，t11-CLA和t10，c12-CLA的含量分別為30.07%、11.84%和13.07%，而反應(yīng)3 h時(shí)CLA、c9，t11-CLA和t10，c12-CLA的含量分別達(dá)到52.39%、22.82%和24.74%；但隨著反應(yīng)時(shí)間的繼續(xù)延長(zhǎng)，CLA及兩種異構(gòu)體的含量基本穩(wěn)定，沒(méi)有明顯變化。因此，確定反應(yīng)時(shí)間為3 h。

2.2.3 CLA-EE與PL摩爾比對(duì)CLA含量的影響

分別設(shè)置CLA-EE與PL摩爾比為2∶1、3∶1、4∶1和5∶1，在催化劑用量4%，持續(xù)真空(-0.1 MPa)條件下加熱到130℃進(jìn)行反應(yīng)，并于反應(yīng)3 h后取樣進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如表4所示。

表4 CLA-EE與PL摩爾比對(duì)CLA含量的影響

由表4可看出，隨著CLA-EE與PL摩爾比增加，CLA及兩種異構(gòu)體c9，t11-CLA和t10，c12-CLA的含量逐漸增加，當(dāng)CLA-EE與PL摩爾比為4∶1時(shí)，CLA及兩種異構(gòu)體c9，t11-CLA和t10，c12-CLA的含量分別為51.33%、22.14%和24.38%。而當(dāng)CLA-EE與PL摩爾比繼續(xù)增加時(shí)，CLA及兩種異構(gòu)體的含量出現(xiàn)下降。因此，確定CLA-EE與PL摩爾比為4∶1。

2.2.4 反應(yīng)溫度對(duì)CLA含量的影響

當(dāng)催化劑用量為4%，CLA-EE與PL摩爾比為4∶1，在抽真空分別加熱到110、120、130、140、150℃之后并繼續(xù)抽真空(0.5 h)的條件下，反應(yīng) 3 h 取樣進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如表5所示。

表5 反應(yīng)溫度對(duì)產(chǎn)物中CLA含量的影響

由表5可看出，反應(yīng)溫度為130℃時(shí)，CLA及兩種異構(gòu)體c9，t11-CLA和t10，c12-CLA的含量分別為51.81%、22.94% 和23.85%，效果最佳，之后隨著反應(yīng)溫度的繼續(xù)升高，CLA及兩種異構(gòu)體的含量出現(xiàn)下降。因此，確定反應(yīng)溫度為130℃。

2.3 正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化

在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，固定反應(yīng)時(shí)間為3 h，以反應(yīng)溫度、催化劑用量以及CLA-EE與PL摩爾比為考察因素，CLA總含量為考察指標(biāo)進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化，正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表6所示。

表6 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

由表6可看出，在反應(yīng)3 h條件下，催化劑用量對(duì)反應(yīng)結(jié)果影響最大，CLA-EE與PL摩爾比次之，而反應(yīng)溫度對(duì)反應(yīng)結(jié)果影響較小。在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的范圍內(nèi)，較優(yōu)的因素水平組合為：催化劑用量4%，反應(yīng)溫度130℃，真空度-0.1 MPa，CLA-EE與PL摩爾比4∶1，反應(yīng)時(shí)間3 h。在該最優(yōu)反應(yīng)條件下，終產(chǎn)物中CLA總含量高達(dá)59.23%。其中兩種主要異構(gòu)體c9,t11-CLA和t10，c12-CLA的含量分別為27%和29%左右。

3 結(jié) 論

以大豆粉末磷脂和共軛亞油酸乙酯為原料，以甲醇鈉為催化劑制備富含共軛亞油酸的磷脂。經(jīng)優(yōu)化獲得最優(yōu)反應(yīng)條件為：共軛亞油酸乙酯與大豆粉末磷脂摩爾比4∶1，催化劑用量為大豆粉末磷脂質(zhì)量的4%，反應(yīng)溫度130℃，反應(yīng)時(shí)間3 h。最優(yōu)條件下得到的磷脂中共軛亞油酸的總含量達(dá)到59.23%。由于該工藝反應(yīng)速度快，成本低，因此具有潛在的工業(yè)化應(yīng)用前景。

[1] 劉秋云，李開(kāi)雄，李寶昆. 利用分子蒸餾技術(shù)分離共軛亞油酸的研究[J]. 食品工業(yè)，2010(4)：13-16.

[2] 劉佩，沈生榮，阮暉，等. 共軛亞油酸的生理學(xué)功能及健康意義[J]. 中國(guó)糧油學(xué)報(bào)，2009，24(6)：161-164.

[3] 苑艷霞，劉明，馮寶民，等. 化學(xué)催化制備富含共軛亞油酸的改性磷脂[J]. 中國(guó)油脂，2011，36(2)：9-12.

[4] 李光友，劉發(fā)義. 共軛亞油酸及其應(yīng)用[M]. 山東 青島：青島出版社，2002.

[5] 蘇龍，莊宇，何冰芳. 酶的定向進(jìn)化研究及其在工業(yè)生物催化中的應(yīng)用[J]. 生物加工過(guò)程，2011(4)：69-74.

[6] 劉紅艷，周巖民. CLA對(duì)體脂和癌癥的影響及作用機(jī)理[J]. 中國(guó)油脂，2005，30(7)：31-33.

[7] BHATTACHARY A，BANU J，RAHMAN M，et al. Biological effects of conjugated linoleic acids in health and disease[J]. J Nutr Biochem，2006，17：789-810.

[8] CHEN B Q，XUE Y B，LIU J R，et al. Inhibition of conjugated linoleic acid on mouse forestomach neoplasia induced by benzo (a)pyrene and chemopreventive mechanisms[J]. World J Gastroenterol，2003，9：44-49.

[9] SVENSON I，ADELCREUTZ P，MATTIASSON B，et al. Phase behaviour of aqueous systems of enzymatically modifled phosphatidylcholines with one hexadecyl and one hexyl oroctyl chain[J]. Chem Phys Lipids，1993，66：195-197.

[10] ADIECREUTZ D，WEHTJE E. An enzymatic method for the synthesis of mixed acid phosphatidylcholine[J]. J Am Oil Chem Soc，2004，81：553-557.

[11] ADLECREUTZ P，LYBERG A M，ADIECREUTZ D. Enzymatic fatty acid exchange in glycerophospholipids[J]. Eur J Lipid Sci Technol，2003，105：638-645.

[12] 曾朝喜，羅日明，楊博，等. 響應(yīng)面優(yōu)化脂肪酶催化酸解合成共軛亞油酸磷脂[J]. 中國(guó)油脂，2012，37(3)：44-46.

[13] 潘麗，谷克仁，楊莊. 制備富含n-3多不飽和脂肪酸的磷脂[J]. 糧油加工，2006(12)：57-60.

[14] 張苓花，葉淑紅. 酶法合成DHA/EPA型卵磷脂的研究[J]. 大連輕工業(yè)學(xué)院學(xué)報(bào)，2000，19(1)：45-47.

[15] WANG Y H，LIANG S Z，YANG B，et al. Transesterification of phosphatidylcholine with fish oil by lipase [J]. J South Univ Technol，2000，28：71-75.

Preparation of conjugated linoleic acid-enriched phospholipid

ZHAO Chuanjing1， LI Jiang2， SUN Yunfei1， LIU Fayi1

(1.Qingdao Auhai Biotech Co.， Ltd.， Qingdao 266101， Shandong, China； 2.The First Institute of Oceanography， SOA， Qingdao 266061， Shandong, China)

The conjugated linoleic acid-enriched phospholipid was prepared from soy lecithin and conjugated linoleic acid ethyl ester catalyzed by sodium methoxide. The effects of reaction temperature， reaction time， amount of catalyst and molar ratio of conjugated linoleic acid ethyl ester to soy lecithin on the esterification reaction were investigated. The results showed that the optimal preparation conditions were obtained as follows：reaction temperature 130℃， reaction time 3 h， catalyst amount 4% of the mass of soy lecithin， molar ratio of conjugated linoleic acid ethyl ester to soy lecithin 4∶1. Under these conditions， the CLA content in the modified phospholipid was 59.23%， and the contents ofc9，t11-CLA andt10，c12-CLA were about 27% and 29% respectively.

phospholipid； conjugated linoleic acid； sodium methoxide

2016-06-16；

2016-12-13

中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金項(xiàng)目(2014T09)

趙傳景(1989)，男，助理工程師，碩士，研究方向?yàn)楣δ苄杂椭铣膳c制備(E-mail)zhaochj0805@163.com。

李 江，副研究員(E-mail)lijiang@fio.org.cn。

TS225.6；TQ645

A

1003-7969(2017)04-0127-04