甄 潔

(鄭州大學(xué)體育系，河南 鄭州 450001)

長期運動對慢性心力衰竭大鼠左室重構(gòu)的抑制作用

甄 潔

(鄭州大學(xué)體育系，河南 鄭州 450001)

目的 觀察8 w運動對心力衰竭大鼠左室結(jié)構(gòu)、功能和重構(gòu)基因表達的影響，探討運動改善左室重構(gòu)的可能機制。方法 40只SD大鼠隨機分為心力衰竭對照組(HC組，n=10)、心力衰竭運動組(HE組，n=10)、假手術(shù)對照組(SC組，n=10)和假手術(shù)運動組(SE組，n=10)，心力衰竭模型采用冠狀動脈結(jié)扎術(shù)。HE組和SE組進行8 w跑臺運動，SC組和HC組在鼠籠內(nèi)自由活動。超聲心動圖檢測左室結(jié)構(gòu)和功能；分離左室后行Masson染色法進行組織病理學(xué)觀察并獲得膠原容積分數(shù)(CVF)；實時熒光定量PCR檢測左室心肌心鈉素(ANF)、α-肌球蛋白重鏈(α-MHC)、β-肌球蛋白重鏈(β-MHC)和肌質(zhì)網(wǎng)Ca2+-ATP酶(SERCA2a)mRNA表達量。結(jié)果 ①與SC組比較，SE組大鼠左室出現(xiàn)離心性肥大，心功能提高，α-MHC和SERCA2a mRNA升高(P<0.05)；②與SC組比較，HC組左室出現(xiàn)向心性肥大，心功能降低，CVF明顯增加(P<0.05)，心肌α-MHC和SERCA2a mRNA表達下調(diào)(P<0.05)，ANF和β-MHC mRNA表達上調(diào)(P<0.05)；③與HC組比較，HE組大鼠左室發(fā)生離心性肥大，心功能提高，CVF明顯減少(P<0.05)，心肌α-MHC和SERCA2a mRNA表達上調(diào)(P<0.05)，ANF和β-MHC mRNA表達下調(diào)(P<0.05)。結(jié)論 長期運動抑制心力衰竭大鼠左室重構(gòu)并改善心功能，其機制與心肌纖維化程度減輕、胚胎基因表達下調(diào)、收縮蛋白表達上調(diào)有關(guān)。

運動；慢性心力衰竭；左室重構(gòu)

心力衰竭高患病率、高致殘率和高死亡率嚴重影響患者的生活質(zhì)量〔1〕。心力衰竭的發(fā)病機制極為復(fù)雜，近年研究認為以神經(jīng)內(nèi)分泌為主、多種因素參與的以左室病理性重構(gòu)為主要特征的心臟負荷過度是心力衰竭發(fā)生最主要的原因〔2〕。研究發(fā)現(xiàn)，規(guī)律運動特別是有氧運動對于穩(wěn)定期心力衰竭患者具有積極作用，可提高運動耐力并改善生活質(zhì)量〔3～6〕。此外，運動員經(jīng)過長期運動訓(xùn)練，心臟出現(xiàn)生理性重構(gòu)并伴隨心功能提高〔7〕。運動對心力衰竭時左室病理重構(gòu)的影響以及運動誘導(dǎo)的生理重構(gòu)在其中的作用鮮有關(guān)注，因此本研究以SD大鼠為受試對象，通過結(jié)扎冠狀動脈造模，觀察8 w運動對左室結(jié)構(gòu)、功能和重構(gòu)基因表達的影響，探討運動改善左室重構(gòu)的可能機制。

1 資料與方法

1.1 實驗動物 健康雄性SPF級SD大鼠40只，體質(zhì)量250～300 g，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心提供，分籠飼養(yǎng)，自由進食水。

1.2 動物分組與造模 將大鼠隨機分為心力衰竭對照組(HC組)、心力衰竭運動組(HE組)、假手術(shù)對照組(SC組)和假手術(shù)運動組(SE組)各10只。心力衰竭造模采用冠狀動脈結(jié)扎術(shù)，方法為：腹腔麻醉后胸部備皮，連接小動物呼吸機，在心尖搏動處開胸暴露心臟，0號絲線結(jié)扎冠狀動脈前降支，心電圖示心肌缺血性改變持續(xù) 30 min標志手術(shù)成功，迅速放回心臟縫合胸壁。術(shù)后連續(xù)3 d給予青霉素肌注以預(yù)防感染。SC組和SE組動物開胸后只栓線不結(jié)扎左冠狀動脈前降支。

1.3 運動方案 SC組和HC組動物在鼠籠內(nèi)自由活動，HE組和SE組在術(shù)后4 w開始進行跑臺適應(yīng)性訓(xùn)練(10～15 m/min，坡度為0°，30 min/d，共5 d)，之后開始正式訓(xùn)練，速度為16 m/min(50%～60%VO2max)，坡度為0°，60 min/d，5 d/w，共8 w。

1.4 左室結(jié)構(gòu)與功能檢測 末次訓(xùn)練后48 h，腹腔麻醉大鼠，胸部備皮，仰臥位固定，用小動物超聲影像診斷系統(tǒng)(Vevo 770，加拿大visualsonics公司)進行左室結(jié)構(gòu)與功能檢測，指標包括左室舒張末內(nèi)徑(LVEDD)、左室壁厚度(LVWT)、心率(HR)、左室縮短分數(shù)(LVFS)和左室射血分數(shù)(LVEF)。

1.5 動物取材 超聲檢測后稱體重(BW)，迅速分離心臟，冷PBS洗凈稱量心臟重量(HW)后分離左室，濾紙吸干，稱量左室重量(LVW)，分別計算與體重比值為心臟重量指數(shù)(HWI)和左室心臟重量指數(shù)(LVWI)。取左側(cè)肺葉，稱量得肺濕重，于干燥箱干燥24 h后稱量肺干重，計算肺含水率(LWR)=(肺濕重-肺干重)/ 肺濕重×100%。切取左室非梗死區(qū)心肌，分成兩份，一份進行心臟組織病理學(xué)觀察，另一份用于基因表達檢測。迅速將組織置于液氮中并轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱凍存待測。

1.6 心臟組織病理學(xué)觀察 將左室心肌組織固定于10%的福爾馬林中，經(jīng)脫水、透明、包埋、切片(5 μm)后行Masson染色，普通光鏡觀察各組心肌組織病理學(xué)變化。每張切片隨機選取5個視野，用圖像分析軟件測量膠原組織面積，膠原組織面積占所測視野面積的百分比即為膠原容積分數(shù)(CVF)。

1.7 mRNA表達檢測 將心室肌組織勻漿后，用Trizol法抽提心肌總RNA，用722型紫外分光光度計測定RNA濃度并測定A260/A280比值(1.8～2.0為高純度)。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)獲得cDNA，實時熒光定量PCR(7300型熒光定量PCR儀，美國Applied Biosystems公司)測定心鈉素(ANF)、α-肌球蛋白重鏈(α-MHC)、β-肌球蛋白重鏈(β-MHC)和肌質(zhì)網(wǎng)Ca2+-ATP酶(Ca2+-ATPase，SERCA2a)mRNA表達量。擴增條件為：預(yù)變性94℃/3 min；94℃/45 s，55℃/30 s，72℃/90 s，共35個循環(huán)。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)作為內(nèi)參，計算目的基因的相對表達量(SC組的倍數(shù))。引物序列：ANF正義鏈5′-GGACTAGGCTGCAACAGCTTC-3′，反義鏈5′-GTGACACACCACAAGGGCTTA-3′；α-MHC正義鏈5′-ATCAAGGAGCTCACCTACCAG-3′，反義鏈5′-CACTCCTCATCGTGCATTTTC-3′；β-MHC正義鏈5′-ATGTGCCGGACCTTGGAA-3′，反義鏈5′-CCTCGGGTTAGCTGAGAGATCA-3′；SERCA2a正義鏈5′-CTGTGGAGACCCTTGGTTGT-3′，反義鏈5′-CAGAGCACAGATGGTGGCTA-3′；GAPDH正義鏈5′-TGTGTCCGTCGTGGATCTGA-3′，反義鏈5′-TTGCTGTTGAAGTCGCAGGAG-3′。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS15.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析及LSD檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 BW與心臟指數(shù) 與SC組比較，SE組和HE組HW、HWI、LVW、LVWI升高(P<0.05)；HC組HW、HWI、LVW、LVWI和LWR升高(P<0.05)；與HC組比較，HE組LWR降低(P<0.05)；所有組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，見表1。

2.2 左室結(jié)構(gòu)與功能 與SC組比較，SE組LVEDD、LVFS和LVEF升高P<0.05，HR降低(P<0.05)；HC和HE組LVEDD、LVFS和LVEF降低(P<0.05)，LVWT和HR升高(P<0.05)。與HC組比較，HE組LVEDD、LVFS和LVEF升高(P<0.05)，HR降低(P<0.05)；所有組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，見表2。

2.3 心臟組織病理學(xué)改變 左室心肌Masson染色顯示：膠原纖維呈藍色，心肌細胞呈紅色。SC組和SE組心肌纖維著色均勻，無膠原成分；HC組心肌細胞減少，膠原成分顯著增多，纖維化程度明顯，CVF高于SC組(P<0.05)；HE組較HC組心肌細胞增多且排列較為整齊，膠原纖維(即CVF)明顯減少(P<0.05)，但仍高于SC組(P<0.05)。見圖1及表3。

表1 各組大鼠BW與心臟指數(shù)

與SC組比較：1)P<0.05；與HC組比較：2)P<0.05，下表同

表2 各組大鼠左室結(jié)構(gòu)與功能

2.4 mRNA表達的變化 與SC組比較，SE組α-MHC和SERCA2a升高(P<0.05)；HC組α-MHC和SERCA2a降低，ANF和β-MHC升高(P<0.05)。與HC組比較，HE組α-MHC和SERCA2a升高，ANF和β-MHC降低(P<0.05)；所有組間差異均顯著，見表3。

圖1 心肌Masson染色(×200)表3 各組心肌ANF mRNA表達和 β-MHC、α-MHC、SERCA2a、CVF變化

組別ANFβ-MHCα-MHCSERCA2aCVF(%)SC組1.00±0.180.98±0.150.99±0.191.02±0.185.8±1.3SE組0.97±0.191.16±0.211.63±0.301)1.52±0.281)5.1±1.5HC組2.21±0.511)1.78±0.381)0.32±0.091)0.41±0.081)20.2±4.91)HE組1.22±0.302)1.31±0.282)0.81±0.102)0.76±0.082)13.1±2.21)2)

3 討 論

近年研究認為，左室病理性重構(gòu)是心力衰竭發(fā)生發(fā)展最重要的病理生理學(xué)機制〔8〕。左室肥大和心功能下降是左室病理重構(gòu)的主要標志〔9〕。本研究提示心力衰竭后發(fā)生病理性心臟肥大，表現(xiàn)為心臟重量和左室重量增加、心腔縮小、心壁增厚，即向心性肥大，收縮功能隨之降低，肺水腫明顯。胚胎基因重新激活是心肌肥大發(fā)生的重要機制，其中MHC和ANF是心肌肥大的分子標志物，其表達水平能影響心肌功能和預(yù)后，在左室重構(gòu)中發(fā)揮關(guān)鍵作用〔10〕。MHC由兩種基因α-MHC和β-MHC編碼，前者ATP酶活性高，肌肉收縮速率最快，后者則相反，調(diào)節(jié)二者的轉(zhuǎn)換對調(diào)節(jié)心肌收縮功能至關(guān)重要〔11〕。成年心室肌肌球蛋白α-MHC占優(yōu)勢，胚胎期則以β-MHC為主〔12〕。ANF具有抗氧化作用，其表達水平與心力衰竭程度正相關(guān)〔13〕。本研究提示心力衰竭時肌球蛋白ATP酶活性降低，心肌收縮力下降。此外，SERCA2a是一種鈣離子泵(收縮蛋白)，可將胞質(zhì)中的Ca2+逆濃度梯度泵入肌漿網(wǎng)，參與對細胞內(nèi)Ca2+濃度的調(diào)節(jié)〔14〕。本研究中HC組SERCA2a表達下降，不僅導(dǎo)致心肌細胞內(nèi)Ca2+超載，而且影響心臟的舒縮功能。心肌細胞外基質(zhì)過度沉積是左室重構(gòu)的另一特征〔15〕。心肌細胞外基質(zhì)主要由Ⅰ型和Ⅲ型膠原組成，其生理功能在于為心肌細胞提供支持、傳導(dǎo)應(yīng)力并保證心肌順應(yīng)性〔16〕。本研究中，HC組心肌Masson染色顯示心肌細胞變性壞死、膠原成分明顯增多，CVF升高，纖維化程度明顯。研究表明，膠原由正常的3%增至10%時，心室壁順應(yīng)性明顯下降，舒張功能受限，超過20%則出現(xiàn)心肌細胞被阻隔，收縮功能明顯下降〔17〕。此外，心肌纖維化可增加心肌電異質(zhì)性，是造成心律失常和猝死原因之一〔18〕。

與左室病理性重構(gòu)不同，運動訓(xùn)練誘導(dǎo)的心臟肥大(運動性心臟肥大或運動員心臟)是心臟對于運動應(yīng)激的良性適應(yīng)，屬于生理性重構(gòu)〔19～21〕。本研究提示長期運動訓(xùn)練誘導(dǎo)左室出現(xiàn)離心性肥大，即心腔擴大，室壁增厚不明顯。由于心功能增強(LVFS和LVEF增加，HR降低)，因此這種結(jié)構(gòu)變化屬于生理性肥大。在基因水平上，胚胎基因(ANP和β-MHC)無明顯變化，收縮蛋白基因(α-MHC和SERCA2a)表達上調(diào)，進一步證實運動性心臟肥大是對長期訓(xùn)練適應(yīng)的結(jié)果〔22〕。運動誘導(dǎo)的左室生理重構(gòu)在心力衰竭康復(fù)中的作用尚無定論，本研究顯示左室心力衰竭時“向心性肥大”經(jīng)過運動康復(fù)逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)椤半x心性肥大”，其機制可能與有氧運動增加心臟前負荷有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)〔23〕，長期有氧運動(如長跑或游泳等耐力型運動員)通過增加回心血量(即心臟前負荷或容量負荷)造成心室壁應(yīng)力增大，引起心肌細胞肌節(jié)串聯(lián)排列為主，心臟擴大以適應(yīng)增加的容量負荷。本研究提示，運動誘導(dǎo)的左室生理性重構(gòu)與病理性重構(gòu)在心力衰竭大鼠運動康復(fù)過程中同時存在并相互抗衡〔24〕，最終前者的良性作用逆轉(zhuǎn)了后者的負面效應(yīng)，表現(xiàn)為左室結(jié)構(gòu)由病理性肥大向生理性肥大轉(zhuǎn)變。因此，長期有氧運動通過抑制心力衰竭時左室重構(gòu)改善心功能。這一結(jié)論在Garciarena等〔25〕針對自發(fā)性高血壓大鼠的研究中也得到進一步證實，提示心力衰竭患者在運動康復(fù)過程中，即使在原有心臟病理肥大(如高血壓或心肌梗死造成的心臟向心性肥大)的基礎(chǔ)上出現(xiàn)離心性肥大，其堅持運動的收益可能遠遠大于風險。

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〔2015-12-11修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)

河南省體育局項目(HT2013-05)

甄 潔(1973-)，女，講師，碩士，主要從事運動人體科學(xué)研究。

G804.5

A

1005-9202(2017)08-1881-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.08.025