龔 林，邱 彥，劉 靜，魯 毅，王亞威，段 靖，馬 靜，周 永

（1.解放軍454醫(yī)院門診部，江蘇 南京210002；2.解放軍454醫(yī)院藥劑科，江蘇 南京 210002；3.解放軍454醫(yī)院器械科，江蘇 南京 210002）

知母總皂苷對血管性抑郁小鼠抑郁行為和腦組織病理學(xué)的影響

龔 林1，邱 彥2，劉 靜2，魯 毅2，王亞威2，段 靖2，馬 靜2，周 永3

（1.解放軍454醫(yī)院門診部，江蘇 南京210002；2.解放軍454醫(yī)院藥劑科，江蘇 南京 210002；3.解放軍454醫(yī)院器械科，江蘇 南京 210002）

目的：探討知母總皂苷對血管性抑郁小鼠抑郁行為、腦組織炎癥因子及病理學(xué)的影響。方法：采用反復(fù)缺血再灌注方法制備血管性抑郁小鼠模型，灌胃給予知母總皂苷，實(shí)驗(yàn)2周后，觀察血管性抑郁小鼠行為學(xué)變化，檢測小鼠腦組織中炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6的含量以及腦組織病理學(xué)改變。結(jié)果：與模型組相比，知母總皂苷中劑量組和高劑量組小鼠水平運(yùn)動得分、垂直運(yùn)動得分均明顯增加（P ＜ 0.05），明顯縮短小鼠懸尾、游泳不動時間（P ＜ 0.05）；與模型組比較，知母總皂苷三個劑量組均顯著抑制小鼠腦組織中TNF-α、IL-1β、IL-6含量的升高（P ＜ 0.05）。腦組織病理切片顯示，與模型組相比，知母總皂苷各劑量組可顯著減輕大腦皮質(zhì)錐體細(xì)胞和腦實(shí)質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)的核固縮、核溶解、核體不規(guī)則等情況。透射電鏡結(jié)果顯示，與模型組比較，知母總皂苷各劑量組能改善腦組織神經(jīng)元細(xì)胞變小、突觸泡擴(kuò)張、血管周圍有空白區(qū)等現(xiàn)象。結(jié)論：知母總皂苷對血管性抑郁小鼠具有顯著的治療作用。

知母總皂苷；血管性抑郁；行為學(xué)；炎癥因子；病理學(xué)

血管性抑郁是抑郁常見的一種亞型，是與腦血管病或血管危險因素密切相關(guān)的一種老年期抑郁綜合征。心腦血管疾病是一種嚴(yán)重威脅人類特別是中老年人健康的常見病，發(fā)病率逐年在增加；心腦血管疾病與抑郁互為因果致病，顯著增加了患者的患病率、致殘率和死亡率，但至今對血管性抑郁的病因及機(jī)制尚不完全明確。目前，我國人口老齡化發(fā)展速度極快，而血管性抑郁則是老齡化社會面臨的一個重要的醫(yī)學(xué)和社會問題。由于血管性抑郁患者對抗抑郁劑敏感性低（療效不足50%），耐受性差，易出現(xiàn)毒副作用[1]，對患者及其家庭、社會造成沉重負(fù)擔(dān)，已成為國內(nèi)外醫(yī)學(xué)關(guān)注的熱點(diǎn)。知母主要功效為清熱瀉火、滋陰潤燥、止渴除煩等，用于溫?zé)岵?、肺熱咳嗽、陰虛火旺、高熱煩渴等病癥。研究[2]表明，知母皂苷及其苷元是知母的主要活性成分，具有防止老年癡呆，保護(hù)腦缺血損傷、抗凝血、抗氧化、抗腫瘤、抗骨質(zhì)疏松、降糖降壓、降血脂等廣泛的藥理活性；但未見知母活性成分或其中藥復(fù)方在血管性抑郁方面應(yīng)用與研究的報道。本實(shí)驗(yàn)通過阻斷小鼠雙側(cè)頸總動脈反復(fù)缺血再灌注方法制備血管性抑郁模型，觀察知母總皂苷（saponins from Anemarrhena asphodeloides Bge.，SAaB）對血管性抑郁小鼠行為學(xué)的影響，腦組織中促炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6含量的變化以及腦組織病理學(xué)改變，為其在抗血管性抑郁方面的開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

ICR小鼠，60只，雄性，體質(zhì)量18 ～ 20 g，SPF級，實(shí)驗(yàn)動物許可證號：SCXK（滬）2013-0016，由上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動物有限公司提供。動物實(shí)驗(yàn)室溫度22 ～ 24 ℃，濕度40% ～ 60%，光照時間隨自然變化，動物自由飲食。

1.2 藥品及試劑

知母總皂苷（由解放軍四五四醫(yī)院藥劑科提取制備），其主要成分為知母皂苷B-Ⅱ（52%），知母皂苷A-Ⅲ（7%），知母皂苷B（2%）；鹽酸氟西汀膠囊（百優(yōu)解，禮來蘇州制藥有限公司，批號：9901C）。TNF-α（批號：20151110）、IL-1β（批號：20151016）、IL-6（批號：20160108）ELISA試劑盒，均購自上海星黍生物科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

酶標(biāo)儀（Thermo FisherMK3型，上海賽默生物科技發(fā)展有限公司）；滑動切片機(jī)（RM2135型，德國LEICA公司）；光學(xué)顯微鏡（Olympus DM750型，日本Olympus公司）；透射電鏡（H-600型，日本日立公司）。

2 方法

2.1 分組及給藥

將60只小鼠隨機(jī)分為6組，每組10只，分別為：假手術(shù)組、模型組、鹽酸氟西汀組（10 mg?kg-1，按0.1 mL?10 g-1小鼠體質(zhì)量灌胃給藥）、低劑量組（知母總皂苷70 mg?kg-1）、中劑量組（知母總皂苷140 mg?kg-1）、高劑量組（知母總皂苷280 mg?kg-1）。知母總皂苷各劑量組按0.1 mL?10 g-1小鼠體質(zhì)量灌胃給藥。假手術(shù)和模型組灌胃給予相應(yīng)體積的生理鹽水。在實(shí)驗(yàn)造模前給藥1周，造模后再繼續(xù)給藥1周，共給藥14 d，qd。

2.2 血管性抑郁小鼠模型的建立[3]

小鼠經(jīng)腹腔注射0.3%戊巴比妥鈉麻醉后，將小鼠仰臥位固定，沿頸前正中切口，鈍性分離暴露雙側(cè)頸總動脈，使用小號動脈夾阻斷雙側(cè)頸總動脈供血5 min后，打開動脈夾恢復(fù)供血10 min，再次用動脈夾阻斷供血5 min后，將動脈夾完全移開，使得其動脈恢復(fù)血流，術(shù)中密切觀察小鼠呼吸、心跳，術(shù)后縫合切口。假手術(shù)組除不阻斷供血外，其余處理方式與實(shí)驗(yàn)組相同。手術(shù)后用電熱毯維持小鼠正常的體溫，直到小鼠蘇醒。于手術(shù)后7 d進(jìn)行檢查測試。

2.3 行為學(xué)檢測[4-5]

2.3.1 曠場試驗(yàn) 曠場為一50 cm×50 cm×50 cm正方體，底面含25個等邊方格。將小鼠放在中心方格內(nèi)，觀察3 min內(nèi)的水平運(yùn)動和垂直運(yùn)動得分。兩只動物實(shí)驗(yàn)間歇徹底清潔曠場。

2.3.2 懸尾試驗(yàn) 末次給藥后1 h，將小鼠尾端2 cm部位貼在一水平支撐物上，使動物成倒掛狀態(tài)，支撐物放置于一敞口箱內(nèi)，其頭部離底面約5 cm。記錄小鼠6 min內(nèi)后4 min的不動時間，各組小鼠平行操作。

2.3.3 強(qiáng)迫游泳試驗(yàn) 末次給藥1次1 h后，將小鼠單獨(dú)放入高20 cm、直徑14 cm的圓柱型玻璃缸中，缸內(nèi)水深10 cm，水溫23 ～ 25 ℃。從小鼠入水后記時6 min，記錄后4 min內(nèi)的累計(jì)不動時間，各組小鼠平行操作。

2.4 炎癥因子含量測定[6-7]

末次檢測結(jié)束后，將小鼠麻醉放血處死，取腦組織，左側(cè)腦組織置于– 80 ℃冰箱中，待測TNF-α、IL-1β、IL-6含量。

2.5 腦組織透射電鏡及病理學(xué)檢查

將小鼠麻醉放血處死，取腦組織，右側(cè)腦組織一部分切成0.5 m3大小組織，用4%多聚甲醛-0.1 mol·L-1磷酸緩沖液（pH 7.3 ～ 7.4）固定保存，做透射電鏡檢查；另取一部分用10%中性甲醛溶液固定，常規(guī)脫水、石蠟包埋切片、HE染色，光鏡下觀察病理學(xué)變化。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 知母總皂苷對血管性抑郁小鼠抑郁行為的影響

在曠場試驗(yàn)、懸尾試驗(yàn)和強(qiáng)迫游泳試驗(yàn)中，與假手術(shù)組比較，模型組小鼠水平運(yùn)動得分、垂直運(yùn)動得分顯著降低，懸尾、游泳不動時間顯著增加（P ＜ 0.05），提示小鼠出現(xiàn)明顯的抑郁行為，表明小鼠血管性抑郁模型造模成功。與模型組小鼠相比，知母總皂苷高劑量組和氟西汀組小鼠水平運(yùn)動得分、垂直運(yùn)動得分明顯增加（P ＜ 0.05），懸尾、游泳不動時間均縮短（P ＜0.05），提示知母總皂苷對反復(fù)缺血再灌注所致血管性抑郁小鼠的行為學(xué)有顯著改善作用。結(jié)果見表1、表2。

表1 知母總皂苷對血管性抑郁小鼠曠場試驗(yàn)的影響. n = 10Tab 1 Effect of SAaB on open field test of vascular depression mice. n = 10

表2 知母總皂苷對血管性抑郁小鼠懸尾、游泳不動時間的影響. n =10Tab 2 Effect of SAaB on the immobility time in both of the tail suspension test and the forced swimming test in mice with vascular depression. n = 10

3.2 知母總皂苷對血管性抑郁小鼠腦組織中TNF-α、IL-1β、IL-6含量的影響

與假手術(shù)組比較，模型組小鼠腦組織中TNF-α、IL-1β、IL-6含量明顯增加（P ＜ 0.01）。與模型組小鼠相比，知母總皂苷三個劑量組和氟西汀組小鼠腦組織TNF-α、IL-1β、IL-6含量均不同程度降低（P ＜ 0.05）；結(jié)果提示，知母總皂苷對血管性抑郁小鼠腦組織中TNF-α、IL-1β、IL-6這3種促炎性細(xì)胞因子的表達(dá)有明顯的抑制作用。詳見表3。

表3 知母總皂苷對血管性抑郁小鼠腦組織TNF-α、IL-1β、IL-6含量的影響. n = 10Tab 3 Effect of SAaB on TNF-α, IL-1β and IL-6 levels in brain tissue of vascular depression mice. n = 10

3.3 知母總皂苷對血管性抑郁小鼠腦組織病理學(xué)的影響

光學(xué)顯微鏡下觀察結(jié)果詳見圖1，結(jié)果顯示假手術(shù)組腦組織神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞正常，核膜清楚，核仁明顯，未見神經(jīng)變性壞死及中性粒細(xì)胞浸潤等病理改變；模型組腦組織中神經(jīng)元結(jié)構(gòu)模糊，線粒體腫脹，尼氏小體減少，出現(xiàn)不同程度的核固縮、核溶解，核體不規(guī)則；知母總皂苷三個劑量組可減輕血管性抑郁小鼠出現(xiàn)的上述腦組織病理改變，可改善大腦皮質(zhì)錐體細(xì)胞和腦實(shí)質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞的核固縮、核溶解程度。透射電鏡超微結(jié)構(gòu)觀察結(jié)果表明，假手術(shù)組腦組織結(jié)構(gòu)正常，神經(jīng)元細(xì)胞、突觸泡、小血管均正常；模型組神經(jīng)元細(xì)胞變小，細(xì)胞核染色質(zhì)邊集、畸形，血管周圍有空白區(qū)；知母總皂苷三個劑量組和陽性藥氟西汀組均可改善上述現(xiàn)象，突觸泡基本不擴(kuò)張，血管空白區(qū)減小。

4 討論

小鼠在懸尾及強(qiáng)迫游泳試驗(yàn)中出現(xiàn)的不動狀態(tài)反映了動物的絕望行為，可模擬人類的抑郁狀態(tài)[8]。本次懸尾和強(qiáng)迫游泳試驗(yàn)結(jié)果顯示，知母總皂苷能顯著縮短小鼠懸尾和強(qiáng)迫游泳不動時間，表明知母總皂苷具有抗抑郁作用，可能是通過參與調(diào)節(jié)中樞不同單胺（去甲腎上腺素、5-羥色胺等）能神經(jīng)傳導(dǎo)功能所產(chǎn)生的。動物發(fā)生抑郁樣行為學(xué)改變，反應(yīng)表現(xiàn)為快感缺乏、運(yùn)動能力和探索能力下降[9]等，曠場試驗(yàn)中水平運(yùn)動反映動物的活動度，垂直運(yùn)動反映動物對新鮮環(huán)境的好奇程度。本實(shí)驗(yàn)知母總皂苷高劑量組能夠顯著增加小鼠水平運(yùn)動得分、垂直運(yùn)動得分，從而提高血管性抑郁小鼠的自主運(yùn)動行為。

圖1 各組小鼠腦組織病理學(xué)檢查（HE，200×）A – 假手術(shù)組，B – 模型組，C – 鹽酸氟西汀組，D – 低劑量組，E – 中劑量組，F(xiàn) – 高劑量組Fig 1 Pathological examination of brain tissue in mice (HE, 200×)A – sham group, B – model group, C – fluoxetine hydrochloride group, D – low dose group, E – middle dose group, F – high dose group

血管性抑郁發(fā)病機(jī)制的“炎癥反應(yīng)假說”認(rèn)為，年齡及腦血管相關(guān)的炎癥過程介導(dǎo)了其抑郁癥的發(fā)生[10]。小膠質(zhì)細(xì)胞作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)起免疫監(jiān)視作用的主要細(xì)胞，可在缺血缺氧等多種病理?xiàng)l件下激活，釋放大量促炎性細(xì)胞因子參與中樞的免疫炎癥反應(yīng)[11]。腦卒中患者可引起炎性細(xì)胞因子，如白細(xì)胞介素IL-1β、IL-18、TNF-α，糖皮激素、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子、血管內(nèi)皮生長因子及組織型纖溶酶原激活物等一系列細(xì)胞因子的異常，這些細(xì)胞因子參與免疫調(diào)節(jié)作用及神經(jīng)遞質(zhì)的合成代謝，構(gòu)成了腦卒中后抑郁的發(fā)病機(jī)制[12]。本實(shí)驗(yàn)采用反復(fù)缺血再灌注法制備血管性抑郁小鼠模型，模型小鼠腦內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞大量激活，伴有腦內(nèi)相關(guān)促炎性細(xì)胞因子水平顯著增高；給予知母總皂苷后，血管性抑郁小鼠腦內(nèi)促炎性細(xì)胞因子水平顯著降低，表明知母總皂苷可以顯著抑制血管性抑郁小鼠腦組織中TNF-α、IL-1β、IL-6這三種促炎性細(xì)胞因子的表達(dá)。提示在以炎癥反應(yīng)為主導(dǎo)的血管性抑郁癥狀中，知母總皂苷可能是通過抗炎干預(yù)起到一定的治療作用。

抑郁與腦缺血有一定關(guān)系，兩者互為因果，大腦皮層及海馬等部位神經(jīng)元損傷有可能是其基本的病理改變[13]。血管性抑郁模型小鼠腦組織光鏡下顯示神經(jīng)元結(jié)構(gòu)模糊，線粒體腫脹，尼氏小體減少，出現(xiàn)不同程度的核固縮、核溶解，核體不規(guī)則；透射電鏡超微結(jié)構(gòu)觀察結(jié)果表明，模型小鼠腦神經(jīng)元細(xì)胞變小，細(xì)胞核染色質(zhì)邊集、畸形，血管周圍有空白區(qū)。知母總皂苷明顯改善血管性抑郁小鼠腦組織病理學(xué)變化，對血管性抑郁模型小鼠腦組織損傷有保護(hù)作用。

知母總皂苷抗血管性抑郁作用明顯，其藥材來源廣泛，且中藥不良反應(yīng)及毒副作用較小，長期服用安全可靠，對其今后的開發(fā)和應(yīng)用有著非常廣闊的前景。中藥具有多環(huán)節(jié)、多靶點(diǎn)的作用特性，對知母總皂苷抗血管性抑郁的具體作用機(jī)制，還有待深入研究。

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Effects of saponins from Anemarrhena asphodeloides Bge. on the depressive behaviors of vascular depression mice and brain tissue pathology

GONG Lin1, QIU Yan2, LIU Jing2, LU Yi2, WANG Ya-wei2, DUAN Jing2, MA Jing2, ZHOU Yong3
(1. Outpatient Department, the No. 454 Hospital of PLA, Nanjing 210002, China; 2. Department of Pharmacy, the No. 454 Hospital of PLA, Nanjing 210002, China; 3. Instrument Section, the No. 454 Hospital of PLA, Nanjing 210002, China)

Objective:To investigate the effects of saponins from Anemarrhena asphodeloides Bge.(SAaB) on the depressive behaviors of vascular depression mice, and the influence of brain tissue pathology and inflammatory factors.Methods:The vascular depression model of mice were established by repeated ischemia and reperfusion. The mice received gastric perfusion of SAaB as designed once per day. After 2 weeks, the depressive behavior changes of vascular depression mice were observed. Contents of tumor necrosis factor-α (TNF-α), interleukin-1β (IL-1β) and interleukin-6 (IL-6) in brain tissue were measured, meanwhile pathological changes in the brain tissue of mice were analyzed.Results:Compared with the model group, SAaB in middle and high dose group could increase horizontal movement and vertical movement score in open field test (P ＜ 0.05). In the tail suspension test and the forced swimming test of mice, the immobility time of SAaB middle and high dose group was shorter than that of the model group signif i cantly (P ＜ 0.05). Compared with the model group, SAaB in low, middle and high dose groups could signif i cantly inhibit the increase of TNF-α, IL-1β and IL-6 in the mice brain tissue notably (P ＜ 0.05). The pathological examination showed that SAaB in each dosage group signif i cantly reduced the fuzzy neurons in the brain structure, mitochondria swelling, nissl body, pycnosis, irregular nuclear body in the cerebral cortex pyramidal cells and brain nerve cell nucleus. Compared with the model group, SAaB in each dosage group improved the brain neurons atrophy, synaptic vesicle expansion, nucleus chromatin edge setting, deformity and the blank area around blood vessels.Conclusion:SAaB has signif i cant therapeutic effect on vascular depression mice.

Saponins from Anemarrhena asphodeloides Bge.; Vascular depression; Behavioral science; Inf l ammatory; Pathology

R964

A

1672 – 8157(2017)02 – 0088 – 05

2016-12-06

2017-03-09）

南京軍區(qū)基學(xué)科研基金課題（15zD021）

周永，男，高級工程師，研究方向：醫(yī)學(xué)工程。E-mail：18202138603@163.com

龔林，女，副主任醫(yī)師，研究方向：神經(jīng)內(nèi)科。E-mail：benefi_bio@163.com