任 韡，李 欣，白 林，范金釗，黃曉舞（解放軍總醫(yī)院制劑中心，北京 100853）

?實驗研究?

HPLC法測定保元丹中三七皂苷R1的含量

任 韡，李 欣，白 林，范金釗，黃曉舞（解放軍總醫(yī)院制劑中心，北京 100853）

目的：建立測定保元丹中三七皂苷R1含量的方法。方法：采用HPLC法，色譜柱：Dikma Diamonsil C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-水，梯度洗脫；檢測波長：203 nm；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：40 ℃。結(jié)果：三七皂苷R1在38.0 ～ 380.0 μg·mL-1（r = 0.999 9）范圍內(nèi)線性關系良好；平均回收率、RSD（n = 9）分別為99.7%、1.04%。結(jié)論：本方法簡便、準確、重復性好，可用于保元丹中三七皂苷R1的含量測定。

高效液相色譜法；保元丹；三七皂苷R1；含量測定

保元丹是解放軍總醫(yī)院非標準制劑，由冬蟲夏草、三七、西洋參等制成，該藥用于補肺益氣，益氣升陽，利水消腫，止咳化痰，治氣衰血虛，腎虛久咳，虛喘氣促，腰膝酸痛，久服強身健體，延緩衰老[1]。三七為五加科植物三七Panax notoginseng(Burk.) F.H.Chen的干燥根和根莖，散瘀止血，消腫定痛[2]，為保元丹的主要成分，原質(zhì)量標準中無含量測定方法，本試驗測定保元丹中三七的特征有效成分三七皂苷R1[3]的含量，以期為有效控制制劑的質(zhì)量提供參考。

1 儀器與試藥

Agilent 1200高效液相色譜儀（美國Agilent公司，含1200系列在線脫氣機、四元泵、自動進樣器、柱溫箱、VWD檢測器、色譜工作站）；AG-285型電子天平（瑞士Mettler公司）；超聲清洗機（DZ47-60，北京精益榮華首飾器材有限公司）。

三七皂苷R1對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110745-200617）；甲醇、乙腈為色譜純，水為重蒸餾水。保元丹（解放軍總醫(yī)院自制，批號：20120301、20130201、20140801）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Dikma Diamonsil（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；以乙腈為流動相A，以水為流動相B，進行梯度洗脫：0 ～ 20 min，A相比例為19%；20 ～ 70 min，A相比例由19%變?yōu)?6%；70 ～ 80 min，A相比例由36%變?yōu)?9%；檢測波長：203 nm；柱溫：40 ℃；流速：1.0 mL?min-1；進樣量：10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液 取三七皂苷R1對照品適量，精密稱定，置50 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得對照品儲備液；精密量取三七皂苷R1對照品儲備液3.0 mL，置5 mL量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，即得對照品溶液（含三七皂苷R1120.84 μg?mL-1）。

2.2.2 供試品溶液 取本品內(nèi)容物約2.5 g，精密稱定，置100 mL碘量瓶中，加50 mL甲醇，密塞，超聲處理（功率：250 W，頻率：50 kHz）50 min，放冷，過濾，蒸干。殘渣用乙腈-水（19 : 81）溶解并轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，定容至刻度，搖勻，用0.22 μm的微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.2.3 陰性樣品溶液 按處方比例取除三七以外的其余成分，按本制劑的制備工藝制成陰性樣品，按供試品溶液制備方法制成陰性樣品溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性實驗

取對照品溶液、供試品溶液、陰性樣品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，按“2.1”項下色譜條件測定，三七皂苷R1的保留時間約為37 min，峰形對稱尖銳，基線平穩(wěn)，與其他色譜峰分離良好，陰性樣品無干擾，詳見圖1。

圖1 HPLC色譜圖A – 對照品，B – 供試品，C – 陰性對照；1 – 三七皂苷R1Fig 1 HPLC chromatogramsA – reference substance, B – sample, C – negative reference substance; 1 – notoginsenoside R1

2.4 線性關系考察

精密稱取三七皂苷R1對照品適量，用甲醇稀釋，制成含三七皂苷R1為38.0、76.0、95.0、171.0、380.0 μg?mL-1的系列標準溶液。取10 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖。以峰面積值為縱坐標（Y），對照品溶液濃度（μg?mL-1）為橫坐標（X）繪制標準曲線，得回歸方程：Y= 2.952X+ 2.349 1，r= 0.999 9。實驗結(jié)果表明三七皂苷R1在38.0 ～ 380.0 μg?mL-1范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關系。

2.5 精密度實驗

精密吸取對照品溶液（含三七皂苷R1120.84 μg?mL-1）10 μL，按“2.1”項下色譜條件，連續(xù)重復進樣6次，記錄峰面積值，計算三七皂苷R1的RSD為0.13%，表明儀器的精密度良好。

2.6 重復性實驗

取同一供試品（批號20140801），按供試品溶液制備方法分別制備6份供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進行測定，三七皂苷R1的平均含量為0.60 mg?g-1，RSD（n= 6）為1.55%。結(jié)果表明此法重復性良好。

2.7 穩(wěn)定性實驗

取同一供試品溶液，分別于0、2、4、6、10、24 h進樣測定，三七皂苷R1峰面積的RSD為0.91%（n= 6），表明供試品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.8 回收率實驗

取已知含量的樣品（批號20140801）9份，每份約2.5 g，精密稱定，精密加入三七皂苷R1對照品溶液（201.4 μg?mL-1）6.0 mL，7.5 mL，9.0 mL，按“2.2.2”項下方法制成低、中、高（80%、100%、120%）3個濃度的樣品溶液各3份。按“2.1”項下色譜條件測定，記錄色譜圖及峰面積，計算回收率。結(jié)果見表1。

表1 保元丹回收率實驗測定結(jié)果. n = 9Tab 1 Results of recovery test in Baoyuandan. n = 9

2.9 樣品含量測定

取3批樣品，每批3份，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項下色譜條件進行測定，結(jié)果見表2。

表2 保元丹中三七皂苷R1的含量. n = 3Tab 2 Contents determination of notoginsenoside R1in Baoyuandan. n = 3

3 討論

3.1 定量指標的選擇

《中國藥典》2015年版一部“三七”項下含量測定方法是以三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1為測定指標，“西洋參”項下含量測定方法是以人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Re為測定指標，故三七皂苷R1為三七藥材的特征有效成分，本實驗建立三七皂苷R1的HPLC含量測定方法，為有效控制制劑的質(zhì)量提供參考。

3.2 樣品處理方法的優(yōu)化

本品內(nèi)容物為棕褐色膏體，本研究中供試品溶液的制備采用流動相進行稀釋并濾過，有效避免基質(zhì)遇流動相析出，減少對色譜柱及液相色譜系統(tǒng)的損壞[4]。本研究比較了溶劑回流提取[2,5]和超聲波振蕩提取法[6-7]，結(jié)果表明兩者提取率大致相同。超聲振蕩提取法，省時簡便，故本研究選擇超聲提取。并考察了超聲30、40、50、60 min對含量的影響，研究結(jié)果表明超聲50 min成分已提取完全，曾浸泡24 h后再行超聲處理，含量沒有明顯提高，因此選擇50 min直接超聲。保元丹為油性膏體，用乙醚、正丁醇萃取損失較多，且提取效果沒有很大改變。

3.3 色譜條件的選擇

參考《中國藥典》2015年版一部“三七”項下含量測定方法，選擇乙腈-水梯度洗脫，12 min乙腈比例為19%，60 min乙腈比例為36%，結(jié)果分離效果不好。改用本試驗的流動相比例，分離良好，陰性樣品無干擾。曾用乙腈-0.1%磷酸流動相系統(tǒng)，分離效果沒有顯著改善。其他色譜條件相同，分別在柱溫25、30、35、40 ℃下測定，發(fā)現(xiàn)在40 ℃時基線平穩(wěn)，色譜峰峰形尖銳，與其他色譜峰分離良好，陰性樣品無干擾。

3.4 色譜柱的選擇

本次研究中，比較了Agilent Zorbax SB-C18（250 mm× 4.6 mm，5 μm）和Dikma Diamonsil （250 mm×4.6 mm，5 μm）兩種色譜柱，結(jié)果表明兩種色譜柱對三七皂苷R1的分離效果均較好。

[1] 金道山，梅世昌，江朝光，等.保元丹對常見老年病的臨床作用觀察[J].中華保健醫(yī)學雜志，2009，11（2）：108-110.

[2] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（一部）[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：11-12.

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Determination of notoginsenoside R1in Baoyuandan by HPLC

REN Wei, LI Xin, BAI Lin, FAN Jin-zhao, HUANG Xiao-wu(Preparation Center, General Hospital of PLA, Beijing 100853, China)

Objective:To establish the HPLC method for content determination of notoginsenoside R1in Baoyuandan.Methods:HPLC analysis was carried out on Dikma Diamonsil C18column (250 mm × 4.6 mm, 5 μm) and with gradient elution of acetonitrile and water. The detection wavelength was 203 nm, the fl ow rate was 1.0 mL·min-1and the column temperature was 40 ℃.Results:Notoginsenoside R1showed a good linear relationship in the range of 38.0 – 380.0 μg·mL-1(r = 0.999 9). The recovery and RSD of notoginsenoside R1in Baoyuandan (n = 9) were 99.7% and 1.04% respectively.Conclusion:The method is simple, accurate and repeatable, which is suitable for the content determination of notoginsenoside R1in Baoyuandan.

HPLC; Baoyuandan; Notoginsenoside R1; Content determination

R917

A

1672 – 8157(2017)02 – 0081 – 03

2016-10-24

2016-12-05）

軍隊醫(yī)療機構(gòu)單品種制劑質(zhì)量標準提高項目課題（14TG0231）

黃曉舞，女，副主任藥師，研究方向：藥物管理與質(zhì)量控制。E-mail：huangxw301@163.com

任韡，女，藥師，主要從事藥物分析與藥品質(zhì)量控制。E-mail：yewell2013@126.com