申立峰 王亞利 李倩 劉璐 譚立 孔靜 楊元 彭平 王夢(mèng)林 石任兵

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·論著·

運(yùn)用RP-HPLC測(cè)定油茶枯餅中皂苷類、黃酮類有效指標(biāo)性成分的含量

申立峰 王亞利 李倩 劉璐 譚立 孔靜 楊元 彭平 王夢(mèng)林 石任兵

目的 基于藥物體系導(dǎo)向建立油茶枯餅中皂苷類和黃酮類有效指標(biāo)性成分的含量測(cè)定方法。 方法 采用反相高效液相色譜方法，在酸性系統(tǒng)下同時(shí)測(cè)定油茶枯餅中皂苷類和黃酮類有效指標(biāo)性成分，采用Waters×bridge C18(4.6×250 mm，5 μm)色譜柱；流動(dòng)相為乙腈-0.05%磷酸水，梯度洗脫，流速1.0 mL/min，柱溫30℃，黃酮類檢測(cè)波長(zhǎng)為265 nm，皂苷類檢測(cè)波長(zhǎng)為203 nm，進(jìn)樣20 μL。結(jié)果 山奈酚3-O-[2-O-β-D-木糖-6-O-α-L-鼠李糖]-β-D-葡萄糖苷、山奈酚3-O-[2-O-β-D-半乳糖-6-O-α-L-鼠李糖]-β-D-葡萄糖苷、camelliasaponin B1分別在0.0876～8.76 μg、0.0885～8.85 μg、0.0872～8.72 μg范圍內(nèi)與色譜峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均為0.9999。精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性良好，平均加樣回收率分別為99.22%、101.50%、100.44%，RSD值分別為1.66%、1.72%、1.58%。 結(jié)論 所建方法快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確度高、重現(xiàn)性好、適用于油茶枯餅的含量測(cè)定與質(zhì)量控制。

油茶枯餅； 黃酮； 皂苷； 反相高效液相色譜法； 含量測(cè)定

油茶camelliaoleiferaabel.是中國(guó)特有的樹種，具有清熱解毒、活血散瘀、止痛的藥用價(jià)值[1]。油茶枯餅作為油茶籽煉油后的剩余物，含有多種活性成分[2]，具有抗氧化、抗菌、殺蟲等活性[3-5]。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)油茶枯餅制備物具有顯著的抗血栓、抗心肌缺血的藥效作用，并有抗癡呆的療效趨勢(shì)。筆者在研究過(guò)程中，通過(guò)藥學(xué)—藥效質(zhì)量表征關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)油茶枯餅中的皂苷類、黃酮類成分為其抗血栓、抗心肌缺血和抗癡呆藥物體系構(gòu)架的主要有效物質(zhì)基礎(chǔ)。然而，目前油茶枯餅側(cè)重單類指標(biāo)性成分的分析，如對(duì)油茶枯餅中山奈酚3-O-[2-O-β-D-木糖-6-O-α-L-鼠李糖]-β-D-葡萄糖苷、山奈酚3-O-[2-O-β-D-半乳糖-6-O-α-L-鼠李糖]-β-D-葡萄糖苷的含量進(jìn)行測(cè)定[6-8]，對(duì)油茶皂苷中camelliasaponin B1成分分離確定等[9-10]，而未見(jiàn)有關(guān)油茶枯餅中皂苷類成分含量測(cè)定的報(bào)道，更缺乏油茶枯餅藥物質(zhì)量整體評(píng)價(jià)的方法。因此，筆者基于課題組所建立的藥物體系的中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)模式[11-15]，建立了同時(shí)測(cè)定油茶枯餅皂苷類和黃酮類有效指標(biāo)性成分含量的方法，并應(yīng)用于油茶枯餅及其系列制備物藥物質(zhì)量表征。本文以藥物體系為導(dǎo)向，關(guān)注油茶枯餅主要有效物質(zhì)基礎(chǔ)，建立其藥物質(zhì)量評(píng)價(jià)方法，為油茶枯餅作為自然健康產(chǎn)品與藥物資源的質(zhì)量控制及開(kāi)發(fā)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 藥物與試劑

山奈酚3-O-[2-O-β-D-木糖-6-O-α-L-鼠李糖]-β-D-葡萄糖苷(下文以黃酮a代替，自制，批號(hào)：20160110)、山奈酚3-O-[2-O-β-D-半乳糖-6-O-α-L-鼠李糖]-β-D-葡萄糖苷(下文以黃酮b代替，自制，批號(hào)：20160111)、camelliasaponin B1(自制，批號(hào)：20160316)，對(duì)照品純度均≥98%，色譜級(jí)乙腈購(gòu)自Fisher Scientific公司；分析純甲醇購(gòu)自北京化工廠；分析純磷酸購(gòu)自北京化學(xué)試劑公司；娃哈哈純凈水購(gòu)自杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司；其余試劑也均為分析純。

3批油茶(江西：20150721、河南：20150726、湖北：20150716)枯餅均由湖南潤(rùn)農(nóng)生態(tài)茶油有限公司提供，現(xiàn)存放于北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院中藥化學(xué)系。

1.2 儀器

Waters e2695自動(dòng)進(jìn)樣高效液相色譜儀，2996PDA檢測(cè)器，Empower工作站； Sartorius-BT25S型1/100000電子分析天平；Sartorious BT 124S型1/10000電子分析天平；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 油茶枯餅有效指標(biāo)性成分含量測(cè)定方法的建立

2.1.1 混合對(duì)照品溶液的制備 分別取黃酮a對(duì)照品、黃酮b對(duì)照品、camelliasaponin B1對(duì)照品適量，精密稱定，加50%甲醇分別制成每1 mL含黃酮a 87.6 μg、黃酮b 88.5 μg、camelliasaponin B187.2 μg的溶液，即得混合對(duì)照品溶液。2.1.2 供試品溶液的配制 取本品粉末(過(guò)四號(hào)篩)約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入125倍量50% 甲醇，加熱回流兩次，每次1小時(shí)，濾過(guò)，用50%甲醇多次洗滌濾紙和殘?jiān)?，合并濾液與洗滌液置蒸發(fā)皿中蒸干，殘?jiān)?0% 甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至100 mL量瓶中，用50% 甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液即得。

2.1.3 色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性 酸性系統(tǒng)：Waters×bridge C18(4.6×250 mm，5 μm)色譜柱；流動(dòng)相乙腈(A)-0.05%磷酸水(B)，洗脫梯度(0～8分鐘，10%～15.5% A；8～16分鐘，15.5% A；16～35分鐘，15.5%～37.4% A；35～61分鐘，37.4% A，61～70分鐘，37.4%～45% A，70～85分鐘，45% A，85～90分鐘，45%～60% A)，流速1.0 mL/min，柱溫30℃[16-17]，黃酮類成分檢測(cè)波長(zhǎng)為265 nm，皂苷類成分檢測(cè)波長(zhǎng)為203 nm，進(jìn)樣20 μL。在上述酸性系統(tǒng)下，3種有效指標(biāo)性成分在對(duì)應(yīng)檢測(cè)波長(zhǎng)下分離度良好，樣品和對(duì)照品有效指標(biāo)性成分保留時(shí)間一致。

2.1.4 線性關(guān)系考察 精密吸取黃酮a、黃酮b、camelliasaponin B1的混合對(duì)照品溶液1、20、40、60、80、100 μL注入液相色譜儀，測(cè)定色譜峰峰面積；以峰面積積分值為縱坐標(biāo)，對(duì)照品進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并進(jìn)行線性回歸，得到回歸方程，黃酮a：Y=1368862.44X-20520.36(r=0.9999，n=6)；黃酮b：Y=1454138.15X-42323.95(r=0.9999，n=6)；camelliasaponin B1：Y=412609.80X+30214.56，(r=0.9999，n=6)。結(jié)果表明黃酮a、黃酮b、camelliasaponin B1分別在0.0876～8.76 μg、0.0885～8.85 μg、0.0872～8.72 μg范圍內(nèi)與色譜峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.1.5 精密度考察 分別精密吸取同一供試品溶液20 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，按“2.1.3色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性”項(xiàng)下方法進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定黃酮a、黃酮b、camelliasaponin B1面積，計(jì)算RSD值分別為0.24%、0.29%、1.32%，表明該方法精密度良好。

2.1.6 穩(wěn)定性考察 分別精密吸取同一供試品溶液20 μL，分別于制備后0小時(shí)、2小時(shí)、4小時(shí)、8小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)，按“2.1.3色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性”項(xiàng)下方法進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定黃酮a、黃酮b、camelliasaponin B1峰面積，計(jì)算RSD值分別為0.24%、0.26%、1.15%、0.85%、1.52%，得出供試品溶液在24小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.7 重復(fù)性考察 取本品粉末(過(guò)四號(hào)篩)約0.5 g，6份，精密稱定，按“2.1.2供試品溶液的配制”項(xiàng)下方法，制備供試品溶液，精密吸取同一供試品溶液20 μL，按“2.1.3色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性”項(xiàng)下方法進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定黃酮a、黃酮b、camelliasaponin B1面積，計(jì)算得到平均含量分別為1.22%、1.40%、1.17%、0.0016%、0.0019%，RSD值分別為2.63%、2.84%、2.24%、1.64%、2.02%，說(shuō)明該方法重復(fù)性良好。

2.1.8 加樣回收率考察 取本品粉末(過(guò)四號(hào)篩)約0.25 g，6份，精密稱定，分別加入對(duì)照品，按“2.1.2供試品溶液的配制”項(xiàng)下方法，制備供試品溶液，精密吸取試品溶液20 μL，按“2.1.3色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性”項(xiàng)下方法進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定黃酮a、黃酮b、camelliasaponin B1峰面積，計(jì)算回收率和RSD值，結(jié)果見(jiàn)表1，說(shuō)明該方法加樣回收率合格，符合定量分析要求。

2.2 不同批次油茶枯餅有效指標(biāo)性成分含量測(cè)定結(jié)果

取不同產(chǎn)地油茶枯餅粉末(過(guò)四號(hào)篩)約 0.5 g，精密稱定，按“2.1.2供試品溶液的配制”項(xiàng)下方法，制備供試品溶液，精密吸取試品溶液20 μL，按“2.1.3色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性”項(xiàng)下方法進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定黃酮a、黃酮b、camelliasaponin B1峰面積，計(jì)算各自含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 3種成分加樣回收率(n=6)

表2 3批油茶枯餅有效指標(biāo)性成分的平均含量(n=3，%)

3 討論

本文基于自然藥學(xué)觀藥物體系導(dǎo)向[18-21]，發(fā)現(xiàn)油茶枯餅抗血栓、抗心肌缺血和抗癡呆藥物體系構(gòu)架的主要有效物質(zhì)基礎(chǔ)為皂苷類和黃酮類，并首次建立同時(shí)測(cè)定其有效指標(biāo)性成分含量的方法。在選擇流動(dòng)相時(shí)，考察了乙腈-水、乙腈-甲酸、乙腈-磷酸溶劑系統(tǒng)，結(jié)果表明：以乙腈-磷酸(0.05%)為流動(dòng)相時(shí)色譜峰峰形和分離效果較好，分離度大于1.5，因此選用乙腈-磷酸(0.05%)為測(cè)定方法的流動(dòng)相，同時(shí)在不同波長(zhǎng)下檢測(cè)黃酮類(265 nm)和皂苷類(203 nm)成分。本文建立了同時(shí)測(cè)定皂苷和黃酮類成分的方法，縮短了檢測(cè)時(shí)限，有助于油茶枯餅的整體性、系統(tǒng)性研究，能直觀地反映油茶枯餅化學(xué)成分的特征[22]，且本方法已成功應(yīng)用于油茶枯餅及其系列制備物的藥物質(zhì)量表征之中，從而為油茶枯餅的質(zhì)量控制與開(kāi)發(fā)應(yīng)用奠定了藥學(xué)質(zhì)量評(píng)價(jià)方法學(xué)基礎(chǔ)。

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(本文編輯： 韓虹娟)

Simultaneous determination of saponins，flavonoids in oil-tea camellia defatted cake by reversed phase high performance liquid chromatography

SHENLifeng，WANGYali，LIQian，etal.

SchoolofTraditionalChineseMedicine，CapitalUniversityofMedicalSciences，Beijing100069，China

Corresponingauthor:SHIRenbing,E-mail:Shirb@126.com

Objective To establish a HPLC method for the determination of index components of flavonoids and saponins in oil-tea camellia defatted cake based on drug system.Methods Reversed phase high performance liquid chromatography was used for determination of index components of flavonoids and saponins in acid system at the same time， Waters×bridge C18(4.6×250mm, 5μm) chromatographic column was used；moving phase was acetonitrile and 0.05% phosphoric acid water，gradient elution，flow rate was 1 mL/min, column temperature was 30℃. The detection wavelength of flavonoids was 265 nm. The detection wavelength of saponins was 203nm, the injection volume was 20μL. Results The kaempferol 3-O-[2-O-β-D-xylose -6-O-α-L-rhamnopyranosyl]-β-D-glucopyranoside, kaempferol3-O-[2-O-β-D- galactosel-6-O-α-L-rhamnopyranosyl]-β-D-glucopyranoside and camelliasaponin B1showed a good linear relationship with peak area respectively in 0.0876～8.76 mg/mL, 0.0885～8.85 mg/mL, 0.0872～8.72 mg/mL, and the correlation coefficient was 0.9999. Precision, stability and repeatability were reached the requirements. The average recoveries were 99.22%, 101.50%, 100.44%, and RSD were 1.66%, 1.72%, 1.58%, respectively. Conclusion The method is quick, simple, accurate and reproducible, and can be used for the quality control and content determination of oil-tea camellia defatted cake.

Oil-tea camellia defatted cake； Flavonoids; Saponins； Reversed phase high performance liquid chromatography； Content determination

國(guó)家“十二五”科技支撐計(jì)劃(2012BAI29B06)；北京中醫(yī)藥大學(xué)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)資助項(xiàng)目(2011-CXTD-12)

100069 北京，首都醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院[申立峰(碩士研究生)、李倩(碩士研究生)、王夢(mèng)林 (碩士研究生)]；北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院國(guó)家中醫(yī)藥管理局中藥經(jīng)典名方有效物質(zhì)發(fā)現(xiàn)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室[王亞利(碩士研究生)、劉璐(碩士研究生)、譚立(碩士研究生)、孔靜(碩士研究生)、石任兵]；北京市教委中藥質(zhì)量控制技術(shù)工程中心(石任兵)；河南省食品藥品檢驗(yàn)所中藥室(楊元)；北京同仁堂研究院(彭平)

申立峰(1991- )，2014級(jí)在讀碩士研究生。研究方向：中藥(復(fù)方)有效物質(zhì)基礎(chǔ)研究與藥物創(chuàng)新。E-mail：13366927181@163.com

石任兵(1957- )，博士，教授，博士生導(dǎo)師。研究方向：中藥(復(fù)方)有效物質(zhì)基礎(chǔ)研究與藥物創(chuàng)新。E-mail：shirb@126.com

R284

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2017.05.001

2017-01-06)