肖樹榮++鄧益斌++許桂丹++黃贊松??

【摘要】目的探討針對增殖相關基因（Cmyc）第二外顯子翻譯起始區(qū)的反義鎖核酸對肝癌細胞增殖和凋亡的影響。

方法設計合成能特異性封閉Cmyc基因mRNA第二外顯子翻譯起始區(qū)的反義寡核苷酸、硫代寡核苷酸和鎖核酸，分別以陽離子半乳糖配體介導轉(zhuǎn)染HepG2細胞，采用RTPCR法檢測細胞內(nèi)Cmyc的mRNA表達變化；Western blot法檢測細胞內(nèi)Cmyc的蛋白表達變化；流式細胞技術(shù)檢測細胞凋亡情況；MTT法檢測反義鎖核酸的細胞毒性作用。

結(jié)果轉(zhuǎn)染第5 d后，反義鎖核酸組Cmyc mRNA相對表達量為（0.335±0.016），明顯低于對照組（1.014±0.022），差異有統(tǒng)計學意義（P=0.015）；Cmyc蛋白相對表達量為（0.448±0.037），也明顯低于對照組（1.00±0.00），差異有統(tǒng)計學意義（P=0.008）；細胞凋亡比例為（32±6）%，顯著高于對照組（0），差異有統(tǒng)計學意義（P=0.032）。

結(jié)論針對Cmyc第二外顯子翻譯起始區(qū)的反義鎖核酸能有效抑制肝癌細胞增殖和促進細胞凋亡。

【關鍵詞】肝細胞癌；Cmyc基因；反義鎖核酸；外顯子2

中圖分類號：R961文獻標識碼：ADOI：10.3969/j.issn.10031383.2017.01.001

Effects of Cmyc locked nucleic acid mediated by galactose ligand on proliferation and apoptosis of hepatoma carcinoma cell

[HJ1*2][HJ]

XIAO Shurong，DENG Yibin▲，XU Guidan，HUANG Zansong

（Center for Medical Laboratory Science， Affiliated Hospital of Youjiang Medical University for Nationalities， Baise 533000， China）

[HJ2][HJ]

【Abstract】ObjectiveTo observe effect of proliferationassociated gene Myc locked nucleic acid（LNA） on the second exon of translation initiation region on proliferation and apoptosis of hepatoma carcinoma cell.

MethodsAntisense oligonucleotides， phosphorothioate oligonucleotides and nucleic acids on the second exon of translation initiation region which could specifically block Cmyc mRNA were designed and synthesized. And transfection HepG2 cells were mediated by cationic galactose ligand， mRNA expression in Cmyc was detected by RTPCR， expression of Cmyc protein in cells was detected by Western blot method， cell apoptosis was detected by flow cytometry， and cytotoxicity of locked nucleic acid was detected by MTT， respectively.

Results5 days after transfection， relative expression of Cmyc mRNA levels in LNA group was （0.335±0.016）， significantly lower than that （1.014±0.022） of control group， difference was statistically significant（P=0015）. Relative expression quantity of Cmyc protein of the LNA group was （0.448±0.037）， also significantly lower than that（1.00±0.00） of the control group， difference was statistically significant（P=0.008）. The ratio of cell apoptosis in the LNA group was（32±6）%， statistically higher than that（0） of the control group，difference was statistically significant（P=0.032）.

ConclusionAntisense locked nucleic acid that targeting at the translation initiation region of Cmyc exon 2 shows strong inhibitory effects on the proliferation and apoptosis of hepatocellular carcinoma cells.

【Key words】hepatoma carcinoma cell； Cmyc gene； LNA； exon2

原發(fā)性肝細胞癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）是世界上最常見的惡性腫瘤之一，占我國肝癌的90%以上，嚴重威脅著人類的生命健康，自20世紀90年代起，我國肝癌死亡率上升為腫瘤的第二位。增殖相關基因（Cmyc）是細胞原癌基因之一，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關系密切，位于人類染色體8q24區(qū)，由3個外顯子和2個內(nèi)含子組成，其中第1個外顯子無編碼序列，只起調(diào)控作用，第2、3外顯子共同編碼包含439個氨基酸殘基的蛋白質(zhì)，該蛋白主要與Max形成異二聚體后再與DNA核心序列結(jié)合，調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄與表達[1～3]。據(jù)此推測，針對Cmyc第二外顯子翻譯起始區(qū)設計合成反義鎖核酸有可能會影響Cmyc mRNA及蛋白的表達，進而影響腫瘤細胞增殖和凋亡，從而發(fā)揮抗腫瘤作用。因此，在前期研究基礎上[4～5]，我們進一步設計合成能特異性封閉Cmyc基因mRNA第二外顯子翻譯起始區(qū)的反義鎖核酸（locked nucleic acid，LNA），以陽離子半乳糖配體介導轉(zhuǎn)染HepG2細胞，觀察其對Cmyc基因mRNA及蛋白表達的影響，以期為抗肝癌基因治療尋找一種新型分子藥物。

1材料與方法

1.1材料

HepG2肝癌細胞株（中國人民解放軍廣州軍區(qū)空軍醫(yī)院劉光澤博士惠贈）常規(guī)培養(yǎng)于含G418（380 ITI1）、10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，37℃、5% CO2條件下5～6 d傳代1次。DMEM培養(yǎng)基和G418購自Gibco公司；胎牛血清購自杭州四季清公司；陽離子半乳糖配體購自美國Invitrogen公司；RNA抽提試劑盒購自美國Sangon公司；寡聚脫氧胸腺嘧啶核苷酸、禽成髓細胞瘤病毒逆轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑、Taq酶、緩沖液、三磷酸脫氧核苷酸等購自日本TaKaRa公司；Annexin VFITC細胞凋亡檢測試劑盒購自南京凱基生物公司；BCA Protein Assay Kit試劑盒、十二烷基磺酸鈉（SDS）、硝酸纖維膜、ECL Western blotting Kit試劑盒等購自美國Sigma公司；實時定量PCR儀（美國ABI公司）；FACS AriaTM流式細胞分析儀（美國BD公司）；半干電轉(zhuǎn)系統(tǒng)（美國BioRad公司）。

1.2方法

1.2.1反義LNA設計與合成

根據(jù)反義寡核苷酸作用原理及設計原則，利用RNAstructure 5.0 軟件設計并篩選出一條總自由能最低的互補于Cmyc的mRNA第二外顯子翻譯起始區(qū)（368390 nt）的寡核苷酸片段，修飾如下：（1）LNA：5TGA△AGCT△ACCGT△ACT△ACGA△C3；（2）硫代寡核苷酸：5TGA#AGCT#ACCGT#ACT#ACGA#C3；（3）未修飾寡核苷酸：5TGA AGCTACCGTACTACGAC3；（4）無關序列：5CGC TATGTAATGCGCTATGG3。其中，△代表LNA修飾，#代表硫代修飾。各序列經(jīng)BLAST排除與人同源后由Genelink公司合成修飾并純化。

1.2.2實驗設計與脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染

實驗設對照組和實驗組。對照組包括空白對照組（半乳糖配體DMEM混合液）和無關序列組。實驗組包括未修飾寡核苷酸組（ODN）、硫代寡核苷酸組（SODN）和反義鎖核酸組（AntiLNA）。將HepG2細胞按1×105個/ml接種于16孔培養(yǎng)板，每孔100 μL，共設6個組，每組各設6個復孔，待細胞貼壁后，分別在各組每孔中加入含LNA（或寡核苷酸）的半乳糖配體DMEM混合液1 ml，培養(yǎng)后第5 d收集細胞進行mRNA、蛋白等指標檢測。轉(zhuǎn)染按脂質(zhì)體說明書操作。

1.2.3Cmyc mRNA檢測

（1）RNA提取：于細胞收集管中加入RNA抽提試劑1 ml，迅速置于冰上，加入0.2 ml氯仿，室溫靜置15 min，4℃ 12 000 rpm離心15 min；取上清液，加入0.5 ml異丙醇，室溫靜置10 min，4℃ 12 000 rpm離心10 min；棄上清液，加入75%焦碳酸二乙酯乙醇溶液1 ml，4℃ 7500 rpm離心5 min；棄上清液室溫干燥5 min，溶于焦碳酸二乙酯無菌水中。（2）RNA逆轉(zhuǎn)錄：根據(jù)目的基因片段堿基序列利用軟件設計并評價引物，交由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成純化。在微反應管中配制模板RNA和引物（各組均取上游引物）混合液，總體積為12 μL。65℃保溫5 min后，冰上迅速冷卻；加入2×PCR預反應液8 μL，輕輕混勻，室溫靜置10 min，移入42℃恒溫箱中保溫60 min后，升至70℃保溫10 min，移到冰中冷卻2 min。（3）cDNA擴增：上述反應管移入PCR擴增儀中，按Cmyc基因設計的上游引物為5TCAACGTTAGCTTCACCAAC3；下游引物為5TGGGCGAGCTGCTGTCGT3，產(chǎn)物長度為245 bp。反應條件：94℃預變性5 min，94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 1 min，共35個循環(huán)；72℃終延伸10 min。取PCR擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，并與內(nèi)參βactin（550 bp）電泳條帶比較，計算相對灰度比值。

1.2.4Cmyc蛋白檢測

（1）總蛋白提取：收集細胞棄上清，用RIPA細胞裂解液（0.01 M Tris.HCl pH75，0.15M NaCl，1% Triton X100，0.1% SDS pH7.4，臨用前加入1 mM PMSF 100 μmol/ml）重懸，轉(zhuǎn)入Eppendorf管，冰上靜置1 h，4℃ 12 000 rpm離心15 min。取上清于新Eppendorf管，用BCA Protein Assay Kit定量，于-70℃保存。（2）電泳：取30 μg蛋白質(zhì)樣品與緩沖液（100 mM Tris.HCl pH6.8，200 Mm DTT，4% SDS，0.2%溴酚藍，20%甘油）混合煮沸5 min變性后點樣于預先制備好的12% SDSPAGE電泳膠板上，30～40 mA電泳，當溴酚藍到達膠板底部時停止電泳。（3）轉(zhuǎn)膜：取預處理過的2張3MM濾紙和1張硝酸纖維膜，按下列順序放入半干電轉(zhuǎn)儀的正極板上：濾紙、凝膠、硝酸纖維膜、濾紙，接好負極板后，10～12 V電轉(zhuǎn)30 min。（4）Western blot分析：采用ECL Western blotting Kit試劑盒進行檢測，并利用凝膠圖像分析系統(tǒng)曝光、拍照和定量分析。

1.2.5HepG2細胞凋亡檢測

采用Annexin VFITC/PI雙染色流式細胞技術(shù)檢測HepG2細胞凋亡情況。根據(jù)雙變量流式細胞儀的散點圖來判斷結(jié)果，左上象限（Q1）為損傷細胞，右上象限（Q2）為壞死細胞，左下象限（Q3）為活細胞，右下象限（Q4）為凋亡細胞。嚴格按試劑盒說明書和儀器說明書操作。

1.2.6反義LNA的細胞毒性檢測

采用MTT比色法檢測反義LNA對細胞活性的影響。

1.3統(tǒng)計學方法

所有數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差（±s）表示，應用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件分析，組間比較采用重復測量單因素方差分析的LSD檢驗，檢驗水準：α=0.05，雙側(cè)檢驗。

2結(jié)果

2.1反義LNA對Cmyc mRNA表達的抑制作用

各組肝細胞Cmyc mRNA逆轉(zhuǎn)錄cDNA與內(nèi)參βActin（設為1）灰度比值，1～4泳道分別為（1014±0022）、（0.843±0.028）、（0661±0021）和（0.335±0016），與對照組相比，硫代寡核苷酸組和反義鎖核酸組肝細胞中Cmyc mRNA表達量均明顯下調(diào)，其中反義鎖核酸組下調(diào)尤為明顯（P=0.015）。見圖1。

注：M：DNA 相對分子質(zhì)量標準；1：空白對照組；2：未修飾寡核苷酸組；3：硫代寡核苷酸組；4：反義鎖核酸組。

圖1各組肝細胞Cmyc mRNA表達水平電泳圖

2.2反義LNA對Cmyc蛋白表達的抑制作用

Western blot檢測各組肝細胞中Cmyc蛋白相對表達量分別為（1.00±0.00）、（0.915±0.031）、（0.846±0041）和（0.448±0.037），與對照組相比，反義鎖核酸組肝細胞中Cmyc蛋白相對表達量明顯下降（P=0008）。見圖2。

2.3反義LNA對HepG2細胞凋亡的影響

采用Annexin VFITC/PI雙染色流式細胞技術(shù)檢測HepG2細胞凋亡情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染第5 d后，凋亡細胞數(shù)比例，硫代寡核苷酸組（18±4）%和反義鎖核酸組（32±6）%均顯著高于對照組（0），差異有統(tǒng)計學意義（P=0.032），反義鎖核酸組的細胞凋亡數(shù)比例更高一些。見圖3。

2.4反義LNA對細胞的毒性作用

用藥5 d后，采用MTT比色法測定各組A值，未修飾寡核苷酸組、硫代寡核苷酸組和反義鎖核酸組的A值分別為（118±0.05）、（1.16±0.04）和（1.15±0.05），與空白對照組的（1.39±004）比較均無統(tǒng)計學意義（P>005）。

注：1：空白對照組；2：無關序列組；3：未修飾寡核苷酸組；4：硫代寡核苷酸組；5：反義鎖核酸組。

圖2各組肝細胞Cmyc蛋白表達水平電泳圖

注：A：空白對照組；B：無關序列組；C：未修飾寡核苷酸組；D：硫代寡核苷酸組；E：反義鎖核酸組。

圖3各組肝細凋亡散點圖

3討論

目前認為，腫瘤細胞的惡性轉(zhuǎn)化是一個由多細胞信號轉(zhuǎn)導通路異常活化，使多種癌基因或抑癌基因表達異常，進一步促進癌癥細胞異常增殖的多環(huán)節(jié)、多階段、多步驟的復雜過程，而癌基因突變則是腫瘤細胞增殖的分子基礎[6]。常見的癌基因有Cmyc、Nras（轉(zhuǎn)化基因）等，其中Cmyc是新近研究發(fā)現(xiàn)的與肝細胞癌變密切相關的癌基因，是myc基因家族的重要成員之一，其編碼蛋白屬于核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子，介導細胞生物信號轉(zhuǎn)導，在細胞凋亡與增殖調(diào)控中發(fā)揮重要作用[7～8]。因而推測，封閉Cmyc第二外顯子翻譯起始區(qū)的基因表達有可能會影響Cmyc mRNA及蛋白的表達，進而可能會影響腫瘤細胞增殖和凋亡，從而發(fā)揮抗腫瘤作用。

本研究利用計算機輔助藥物設計軟件設計合成能特異性封閉Cmyc基因mRNA第二外顯子翻譯起始區(qū)的反義鎖核酸片段，以陽離子半乳糖配體介導轉(zhuǎn)染HepG2細胞，利用RTPCR、Western blot等分子生物學技術(shù)檢測細胞內(nèi)Cmyc mRNA及蛋白的表達情況，評估反義鎖核酸的抗病毒效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，反義鎖核酸作用 5 d后，Cmyc mRNA及蛋白質(zhì)表達均較對照組明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），且細胞凋亡較對照組明顯增多。這一結(jié)果與蔣建偉等[9]利用半乳糖配受體介導Cmyc反義寡核苷酸抑制肝癌移植瘤生長的研究結(jié)果基本一致，不同的是本研究所采用的鎖核酸比寡核苷酸具有更強的抗核酸酶降解能力、熱穩(wěn)定性、分子雜交能力及脂溶性等優(yōu)勢，使鎖核酸更容易穿過細胞膜進入細胞內(nèi)，迅速精準識別并與靶基因位點結(jié)合，發(fā)揮“基因封閉”作用。此外，另一個不同點是本研究所封閉的基因位點為Cmyc基因第二外顯子翻譯起始區(qū)，封閉此位點可直接從翻譯水平干擾Cmyc基因的表達，我們的實驗結(jié)果也證實了這點。因此認為，針對Cmyc基因mRNA第二外顯子翻譯起始區(qū)的反義鎖核酸可有效干擾Cmyc基因的表達，進而抑制肝癌細胞的增殖和促進癌細胞凋亡。

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[9]蔣建偉，張洹.受體介導的Cmyc反義核酸抑制肝癌移植瘤生長[J].中國腫瘤臨床，2006，33（22）：13071311.

（收稿日期：2016-11-17修回日期：2016-12-30）

A：空白對照組；B：無關序列組；c：未修飾寡核苷酸組；d：硫代寡核苷酸組；e：反義鎖核酸組。

圖3 各組肝細胞凋亡散點圖