韋祎+梁薇+黃月艷+唐漢慶+李曉華+李清鋒+謝毅強(qiáng)+謝躍琦+溫曉梅

【摘要】目的觀察重癥手足口病（HFMD）患兒血清星形膠質(zhì)源性蛋白（S100B）和神經(jīng)元特異性烯醇化酶（NSE）水平與T淋巴細(xì)胞亞群的變化及相關(guān)性，并討論其臨床價(jià)值。方法選取2015年1～9月收治的HFMD患兒156例，包括普通病例80例（普通組），重癥病例76例（重癥組），另外選取70例健康幼兒作為對(duì)照組。采用流式細(xì)胞技術(shù)檢測外周血T淋巴細(xì)胞亞群，采用ELISA法檢測血清S100B和NSE水平，并分析血清S100B和NSE水平與T淋巴細(xì)胞亞群的相關(guān)性。結(jié)果與對(duì)照組比較，普通組和重癥組T淋巴細(xì)胞總數(shù)、CD4+、CD8+、CD4+ /CD8+均降低，且重癥組降低更加明顯（P<0.01）。與對(duì)照組和普通組比較，重癥組血清S100B水平（1.64±0.28）μg/L和NSE水平（5283±4.68）ng/ml均升高（P<0.01）。重癥組血清S100B和NSE水平與T淋巴細(xì)胞亞群呈負(fù)相關(guān)（P<0.01）。結(jié)論T淋巴細(xì)胞亞群和血清S100B、NSE水平指標(biāo)組合對(duì)于重癥手足口病的早期識(shí)別具有一定的參考價(jià)值。

【關(guān)鍵詞】手足口??；T淋巴細(xì)胞亞群；星形膠質(zhì)源性蛋白；神經(jīng)元特異性烯醇化酶

中圖分類號(hào)：R512.5文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：ADOI：10.3969/j.issn.10031383.2016.05.005

【Abstract】ObjectiveTo investigate the correlation of the serum levels of S100B，NSE and Tlymphocyte subsets in children with severe handfootmouth disease （HFMD） and discuss their clinical value.MethodsA total of 156 children with HFMD admitted to hospital from January to September，2015 were collected and divided into general group （80 cases） and severe group （76 cases），70 healthy children were selected as control group.Changes of peripheral blood Tlymphocyte subsets were examined by flow cytometry and the serum levels of S100B and NSE were detected by ELISA.In addition，the correlation of the serum levels of S100B，NSE and Tlymphocyte subsets was discussed.ResultsCompared with the control group，total amount of T lymphocyte，CD4+，CD8+ and CD4+/CD8+ of both the general group and the severe group all decreased，and those of the severe group decreased more significantly（P<0.01）.Compared with the control group and the general group，both the serum level of S100B（1.64±0.28）μg/L and the serum level of NSE（52.83±4.68）ng/ml in the severe group all increased（P<0.01）.The levels of serum S100B and NSE were negatively correlated with T lymphocyte subsets in the severe group（P<0.01）.ConclusionCombination of Tlymphocyte subsets and the serum levels of S100B and NSE can provide definite reference value in the early identification of severe HFMD.

【Key words】HFMD；Tlymphocyte subsets；S100B； NSE

手足口病（handfootmouth disease，HFMD）是兒科常見傳染病，臨床表現(xiàn)輕重不同，具有傳播較快、傳染性較強(qiáng)的特點(diǎn)。輕型以手、足、口腔、臀部出現(xiàn)斑丘疹、皰疹體征為主，而重癥型多累及神經(jīng)系統(tǒng)，出現(xiàn)腦炎、無菌性腦脊髓膜炎等腦損傷病變。重癥型患兒病情進(jìn)展快，由于對(duì)重癥型辨別主要靠臨床癥狀，當(dāng)出現(xiàn)腦損傷表現(xiàn)時(shí)，病情往往已很嚴(yán)重，臨床治療難度增大，病死率高。因此，早期辨識(shí)重癥型值得探討。HFMD由腸道病毒感染所致，常見的病毒如腸道病毒71型（EV71）及柯薩奇病毒A16型（CoxA16）。研究表明病毒感染后，T淋巴細(xì)胞激活引起的免疫應(yīng)答在HFMD發(fā)病機(jī)制中起著重要作用[1，2]，而血清星形膠質(zhì)源性蛋白（S100B）和神經(jīng)元特異性烯醇化酶（NSE）水平是反映腦損傷程度的靈敏指標(biāo)[3]。本研究通過檢測重癥HFMD患兒外周血T淋巴細(xì)胞亞群和血清S100B、NSE水平變化并探討其相關(guān)性，為重癥HFMD的早期識(shí)別提供組合參考指標(biāo)。

1對(duì)象與方法1.1研究對(duì)象選取2015年1月至9月在兒科收治住院診斷為HFMD的患兒156例為研究對(duì)象。普通病例組（普通組）80例，男48例，女32例；年齡8個(gè)月～8歲，平均（2.45±0.72）歲。重癥病例組（重癥組）76例，男40例，女36例；年齡9個(gè)月～10歲，平均（3.11±1.02）歲。另外選取經(jīng)過健康體檢中心體檢的健康幼兒70例作為對(duì)照組，其中男40例，女30例，年齡10個(gè)月～9歲，平均（3.26±1.15）歲。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)和患兒監(jiān)護(hù)人書面知情同意。

1.2入選及排除標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)衛(wèi)生部手足口病臨床專家組研究制定的《手足口病診療指南（2010年版）》診斷標(biāo)準(zhǔn)以及《腸道病毒71型感染重癥病例臨床救治專家共識(shí)（2011）》[4]。普通病例：急性起病，發(fā)熱，口腔黏膜出現(xiàn)散在皰疹，手、足、臀部出現(xiàn)斑丘疹、皰疹，皰疹周圍出現(xiàn)炎性紅暈，皰內(nèi)液體較少，可伴有咳嗽、流涕、食欲不振等癥狀，部分病例僅表現(xiàn)為皮疹或皰疹性咽峽炎。重癥病例：神經(jīng)系統(tǒng)受累表現(xiàn)為精神差、嗜睡、頭痛、易驚、譫妄、昏迷；肢體抖動(dòng)、肌陣攣、共濟(jì)失調(diào)、眼球震顫；無力或急性遲緩性麻痹；驚厥；查體可見腦膜刺激征；腱反射減弱或消失。呼吸系統(tǒng)受累表現(xiàn)為呼吸淺促、呼吸困難或節(jié)律改變，紫紺、血性泡沫樣痰、肺部濕啰音或痰鳴音。循環(huán)系統(tǒng)受累表現(xiàn)為面色蒼白或灰白、四肢發(fā)涼、指（趾）發(fā)紺、脈搏淺速等。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）有腦發(fā)育不良、結(jié)核感染者；（2）近1個(gè)月有呼吸道等感染病史；（3）顱腦外傷性損傷，遺傳性免疫性疾病，合并嚴(yán)重心、肝、腎等系統(tǒng)疾病。

1.3血清S100B和NSE水平檢測無菌非抗凝管空腹采集各組新鮮外周血2 ml，4℃ 1000 r/min離心10 min，吸取血清，每管50 μL分裝于EP管中，置-70℃冰箱保存待檢。采用雙抗體夾心ELISA法測定血清S100B、NSE水平，在酶標(biāo)儀450 nm波長測各孔的OD值，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較并計(jì)算相應(yīng)樣品的濃度。操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行，試劑盒由北京生物科技有限公司提供。

1.4T淋巴細(xì)胞亞群檢測各組空腹抽取靜脈血2 ml，置于EDTA抗凝管。管中依次加入 CD4+Ftc、CD8+pe、CD3+Percp三色抗體各10 μL，室溫避光孵育25 min，每管加入200 μL溶血素，輕輕吹打，在室溫下避光靜置 15 min，裂解紅細(xì)胞；觀察溶液澄清透明后，加入預(yù)冷 PBS 液1 ml，室溫下3000 r/min離心10 min，去上清，加入1 ml PBS液搖勻，滴加1%多聚甲醛液100 μL固定，上流式細(xì)胞儀檢測外周血T淋巴細(xì)胞亞群。所有抗體由北京生物科技有限公司提供。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩組間比較采用LSDt檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Pearson檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)：α=0.05。

2結(jié)果2.1各組血清S100B和NSE水平比較與對(duì)照組比較，重癥組血清S100B和NSE水平均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.01）；與普通組比較，重癥組血清S100B和NSE水平均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.01）。見表1。

2.2各組T淋巴細(xì)胞亞群檢測結(jié)果比較與對(duì)照組比較，普通組和重癥組T淋巴細(xì)胞總數(shù)、CD4+百分比、CD8+百分比、CD4+/CD8+比值均降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.01），以重癥組降低明顯。見表2。

2.3血清S100B和NSE水平與T淋巴細(xì)胞亞群相關(guān)性Pearson相關(guān)分析結(jié)果表明，重癥組血清S100B和NSE水平與T淋巴細(xì)胞亞群呈負(fù)相關(guān)（均P<0.01）。見表3。

3討論HFMD主要致病原是腸道病毒EV71以及CoxA16，是兒科急性傳染病，分為普通型和重型、危重型。重型和危重型屬于重癥HFMD，進(jìn)展快，病死率高。早期對(duì)重癥HFMD實(shí)施干預(yù)措施，能防止其惡性進(jìn)展，眾多臨床實(shí)踐已經(jīng)表明干預(yù)越早，效果越好。對(duì)于重癥HFMD的早期診斷，相關(guān)血清學(xué)指標(biāo)或敏感參照物的選擇尚未達(dá)成共識(shí)，有研究[5]通過動(dòng)態(tài)監(jiān)測D二聚體水平可為危重型HFMD的危險(xiǎn)度分層、病情嚴(yán)重程度的預(yù)測及預(yù)后評(píng)估提供血清學(xué)指標(biāo)的參考。另外有研究[6]觀察危重型HFMD在有神經(jīng)系統(tǒng)受累癥狀體征基礎(chǔ)上，通過分析基礎(chǔ)生命體征包括體溫、心率、呼吸頻率、血壓的變化，以期對(duì)危重型HFMD的早期識(shí)別提供有價(jià)值的參考。鑒于目前對(duì)重癥HFMD的臨床診斷主要依靠癥狀體征、顱腦影像學(xué)檢查，存在一定的滯后性，因此，如何早期辨識(shí)重癥HFMD值得探討。本研究通過檢測HFMD血清S100B和NSE水平及T淋巴細(xì)胞亞群的變化并觀察其相關(guān)性，從血清學(xué)指標(biāo)和免疫功能變化角度為早期識(shí)別重癥HFMD提供思路，以供同仁討論。

T淋巴細(xì)胞在免疫應(yīng)答中起著重要作用，根據(jù)表型的不同分為CD4+細(xì)胞和CD8+細(xì)胞亞群，其中的CD4+細(xì)胞作為免疫輔助性細(xì)胞，功能上主要與促進(jìn)體液免疫和細(xì)胞免疫相聯(lián)系，而CD8+是細(xì)胞毒性細(xì)胞或抑制性細(xì)胞，功能上是抑制免疫應(yīng)答[7]，生理情況下，CD4+細(xì)胞數(shù)量、CD8+細(xì)胞數(shù)量維持穩(wěn)定以及CD4+/CD8+比值保持在一個(gè)平衡狀態(tài)，使機(jī)體免疫功能處于與內(nèi)外環(huán)境相適應(yīng)狀態(tài)。因此，通過檢測T淋巴細(xì)胞亞群可以了解機(jī)體的免疫功能，對(duì)于免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展和預(yù)后具有重要的臨床參考價(jià)值[8]。

腸道病毒EV71以及CoxA16感染人體后，人體抗病毒感染的免疫應(yīng)答啟動(dòng)，T淋巴細(xì)胞亞群變化可以反映機(jī)體免疫功能，在本實(shí)驗(yàn)工作中，我們注意到普通組和重癥組T淋巴細(xì)胞總數(shù)、CD4+百分比、CD8+百分比、CD4+/CD8+比值均降低，而以重癥組降低明顯，提示T淋巴細(xì)胞亞群變化有作為較早識(shí)別重癥HFMD的潛在性。

S100B主要存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的星狀膠質(zhì)細(xì)胞，NSE主要存在于神經(jīng)元和神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞中，重癥HFMD主要表現(xiàn)為中樞神經(jīng)系統(tǒng)受累，意味著腦組織在不同程度上受損，由于病毒感染、免疫應(yīng)答傷害或繼之引起的炎癥損害等都可能損傷腦神經(jīng)元和血腦屏障，導(dǎo)致S100B和NSE進(jìn)入血液或腦脊液，引起其水平升高[9，10]，這一改變先于重癥HFMD臨床表現(xiàn)和相關(guān)影像學(xué)檢查出現(xiàn)，是反映腦損傷程度的靈敏指標(biāo)。

T淋巴細(xì)胞亞群在機(jī)體的免疫方面發(fā)揮著重要的免疫調(diào)節(jié)和免疫作用，對(duì)病毒的清除以及疾病的轉(zhuǎn)歸有重要影響。若T淋巴細(xì)胞總數(shù)或相關(guān)亞群數(shù)量下降則提示其功能低下，對(duì)病毒清除能力減弱，則病毒感染對(duì)腦神經(jīng)元造成的損害越大，表現(xiàn)為血液中S100B和NSE水平持續(xù)升高，因此，S100B和NSE水平與T淋巴細(xì)胞亞群在病毒感染損傷與抗病毒感染能力之間產(chǎn)生了聯(lián)系，這樣就為綜合S100B、NSE水平與T淋巴細(xì)胞亞群以推知HFMD的病情或預(yù)后提供了途徑。

在本實(shí)驗(yàn)中，普通組血清S100B和NSE水平雖比對(duì)照組有升高，但差異不大，而重癥組與普通組、對(duì)照組比較，重癥組血清S100B和NSE水平升高，差異明顯，提示病毒感染早期，重癥HFMD在血清S100B和NSE水平上即可表現(xiàn)出與普通組和對(duì)照組的顯著差別，而且，血清S100B和NSE水平與T淋巴細(xì)胞亞群的相關(guān)性顯示，重癥組血清S100B和NSE水平與T淋巴細(xì)胞亞群呈負(fù)相關(guān)，表明重癥HFMD免疫功能低下，抗病毒感染能力嚴(yán)重下降，與之對(duì)應(yīng)的是腦損傷程度已很嚴(yán)重。因此，綜合考慮，血清S100B和NSE水平與T淋巴細(xì)胞亞群變化組合對(duì)于重癥HFMD的早期辨識(shí)有可能成為一條有效的思路。參考文獻(xiàn)[1]Wang YF，Zheng R，Chen BG.Casecontrol study on immuneparameters and clinical significance of handfootmouth disease[J].Zhejiang Prev Med，2010，22（10）：1521.

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（收稿日期：2016-07-25修回日期：2016-10-25）