謝陽， 黃遠(yuǎn)帥， 楊元， 李作孝(西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，四川瀘州 646000)

·基礎(chǔ)研究·

腹腔注射雷帕霉素的實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎小鼠脊髓神經(jīng)元病理變化及其機(jī)制

謝陽， 黃遠(yuǎn)帥， 楊元， 李作孝
(西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，四川瀘州 646000)

目的 觀察腹腔注射雷帕霉素的實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)小鼠脊髓神經(jīng)元病理變化，并探討其機(jī)制。方法 將45只C57BL/6小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組和觀察組，各15只。對(duì)照組不作任何處理。模型組和觀察組制備EAE模型。觀察組小鼠腹腔注射雷帕霉素0.75 mg/(kg·d)，2 d后再注射百日咳菌稀釋液0.5 mL，滿18 d后處死。取脊髓組織行尼氏染色，光鏡下觀察病理變化。采用DCF化學(xué)熒光法檢測(cè)脊髓組織勻漿活性氧簇(ROS)水平。 采用Western blotting法檢測(cè)各組小鼠自噬標(biāo)志物L(fēng)C3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和Akt/mTOR/P70s6k信號(hào)通路蛋白p-Akt、p-mTOR。結(jié)果 光鏡下觀察模型組小鼠脊髓神經(jīng)元尼氏小體體積變小、數(shù)量減少及顏色變淺，排列松散，胞體與軸突輪廓模糊。與模型組相比，觀察組小鼠脊髓神經(jīng)元內(nèi)排列較整齊，尼氏小體數(shù)量及體積均增多，胞體與軸突輪廓模糊現(xiàn)象少見。對(duì)照組、模型組、觀察組小鼠脊髓組織勻漿ROS含量分別為(43.34±2.67)、(84.22±3.15)、(64.10±3.59)U/mgprot。模型組小鼠脊髓組織勻漿ROS含量高于對(duì)照組(P<0.05)；觀察組小鼠脊髓組織勻漿ROS含量高于對(duì)照組(P<0.05)，低于模型組(P<0.05)。對(duì)照組、模型組、觀察組小鼠脊髓組織自噬標(biāo)志物L(fēng)C3-Ⅱ/LC3-Ⅰ條帶光密度值分別為0.486±0.021、0.251±0.032、0.566±0.054。小鼠脊髓組織自噬標(biāo)志物L(fēng)C3-Ⅱ/LC3-Ⅰ條帶光密度值觀察組高于模型組，模型組低于對(duì)照組，P均<0.05。模型組小鼠小鼠脊髓組織p-Akt、p-mTOR條帶光密度值高于對(duì)照組，P均<0.05；觀察組小鼠小鼠脊髓組織p-Akt、p-mTOR條帶光密度值低于對(duì)照組和模型組，P均<0.05。結(jié)論 腹腔注射雷帕霉素的EAE小鼠脊髓神經(jīng)元病理變化程度減輕。這可能是由于雷帕霉素可抑制AKT/mTOR/P70s6k通路激活自噬活性，清除ROS抑制氧化應(yīng)激。

雷帕霉素；實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎；細(xì)胞自噬；氧化應(yīng)激；PI3K-AKT-mTOR通路

多發(fā)性硬化(MS)是一種以中樞神經(jīng)系統(tǒng)白質(zhì)慢性炎性脫髓鞘病變?yōu)橹饕攸c(diǎn)的神經(jīng)退行性疾病，免疫失衡在其中發(fā)揮重要作用。活性氧簇(ROS)是需氧細(xì)胞在代謝過程中產(chǎn)生的一系列活性氧族，在生理狀態(tài)下與抗氧化機(jī)制共同維系細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)[1]。中樞神經(jīng)系統(tǒng)氧耗量大，且抗氧化物質(zhì)相對(duì)于外周血中濃度偏低[2]，導(dǎo)致氧化與抗氧化作用失衡，可產(chǎn)生大量氧化中間產(chǎn)物ROS，它通過氧化損傷神經(jīng)元細(xì)胞中的蛋白質(zhì)、DNA及脂質(zhì)成分，并介導(dǎo)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)等引起神經(jīng)元退行性變性[3]。雷帕霉素是一種新型大環(huán)內(nèi)酯類免疫抑制劑，近年來有關(guān)雷帕霉素作為自噬誘導(dǎo)劑用于腫瘤及神經(jīng)退行性疾病治療的研究屢見不鮮，主要通過對(duì)哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)特異性抑制，以及選擇性的抑制mTOR下游P70S6激酶的磷酸化與功能活化，誘導(dǎo)自噬進(jìn)而加強(qiáng)對(duì)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的清除，減少聚集體的形成并抑制神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的死亡[4]。雷帕霉素作為自噬誘導(dǎo)劑在MS及其動(dòng)物模型EAE中是否可以對(duì)神經(jīng)元起到保護(hù)作用及其機(jī)制尚不明確。為此， 本研究觀察了腹腔注射雷帕霉素的EAE小鼠脊髓神經(jīng)元細(xì)胞病理改變程度的變化，并探討氧化應(yīng)激、細(xì)胞自噬和AKT/mTOR/P70s6k通路在其中的作用?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 45只實(shí)驗(yàn)用C57BL/6雌性小鼠(6～8周，17～20 g)購于成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，飼養(yǎng)于西南西科大學(xué)忠山校區(qū)動(dòng)物房中，飼養(yǎng)室溫(24±2)℃，每12 h明暗交替一次，給予足夠的食料與飲水。實(shí)驗(yàn)過程符合《實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物飼養(yǎng)和操作條例》。MOG35-55 (北京中科亞光生物技術(shù)公司)，結(jié)核桿菌H37Ra(Difco 公司)，百日咳毒素(美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品)，福氏完全佐劑(美國(guó)Sigma公司)，雷帕霉素(武漢凱通精細(xì)化工有限公司)，兔抗小鼠多克隆微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(LC3)B(CST公司)，兔抗GAPDH抗體(Abcam公司)，山羊抗兔HRP(KPL公司)，兔抗小鼠AKT、P-AKT抗體(CST公司)，兔抗小鼠P70s6k、P-P70s6k抗體(CST公司)，ROS檢測(cè)試劑盒(南京建成生物工程研究所)，Tunel染色試劑盒(拜意爾生物)。

1.2 小鼠分組、EAE模型制作及雷帕霉素應(yīng)用方法 將45只小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組和觀察組，每組15只。模型組和觀察組制備EAE模型。將抗原MOG35-55用PBS液稀釋成3 mg/mL，用等體積福氏完全佐劑混勻至乳濁液，按0.2 mL/只的劑量于小鼠脊柱段兩側(cè)任選2點(diǎn)處進(jìn)行皮下注射，腹腔注射百日咳菌稀釋液0.5 mL。觀察組小鼠腹腔注射雷帕霉素0.75 mg/(kg·d)，2 d后再注射百日咳菌稀釋液0.5 mL，滿18 d后處死進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 各組小鼠脊髓神經(jīng)元病理變化觀察 水合氯醛麻醉，灌注針從左心室深入升主動(dòng)脈，小心剪開右心耳，用生理鹽水快速灌注直至肝臟發(fā)白,然后用4%多聚甲醛灌流約30 min后取出脊髓組織，常規(guī)石蠟包埋并切片，在脊髓腰膨大處連續(xù)切片，切片厚5 μm，行脊髓神經(jīng)元尼氏染色。光鏡下觀察脊髓神經(jīng)元病理形態(tài)。

1.4 各組小鼠脊髓勻漿ROS水平檢測(cè) 在冰盤上經(jīng)水合氯醛麻醉后，去眼球放血處死并快速斷頭，在冰上迅速取出脊髓組織，快速剪碎脊髓組織，加生理鹽水稀釋10倍，用玻璃勻漿器在冰上研磨，制成脊髓組織勻漿，然后離心(3 000 r/min離心15 min)，取上清液進(jìn)行超濾離心，最后取上清液，放入-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆貌捎肈CF化學(xué)熒光法檢測(cè)脊髓組織勻漿ROS水平。DCFH-DA試劑和PBS按照1∶9的比例配制DCFH-DA工作液。先在測(cè)試孔和對(duì)照孔中均加入上清液190 μL,然后在測(cè)試孔中加入1 mmol/L的DCFH-DA工作液10 μL，在對(duì)照孔中加入PBS液10 μL，用移液器吸打使之充分混勻，37 ℃孵育30 min，最佳激發(fā)波長(zhǎng)為500 nm，最佳發(fā)射波長(zhǎng)為525 nm，測(cè)定其熒光強(qiáng)度。

1.5 各組小鼠脊髓組織自噬標(biāo)志物L(fēng)C3-Ⅱ/LC3-Ⅰ檢測(cè) 采用Western blotting法。將分離出的脊髓腰膨大用RIPA裂解液裂解后提取總蛋白，用BCA蛋白測(cè)定法測(cè)定蛋白濃度，經(jīng)過SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、室溫下封閉處理后加入1∶1 000稀釋的LC3B和GAPDH一抗，并在4 ℃中孵育過夜，用TBST洗滌3次回收的一抗稀釋液，再加入二抗(山羊抗兔HRP抗體)室溫孵育1 h，滴加ECL混合液于暗室中曝光，通過調(diào)整光強(qiáng)度顯影，最后用Alpha Ease FC軟件處理系統(tǒng)分析目標(biāo)帶的光密度值即蛋白表達(dá)水平。

1.6 各組小鼠脊髓組織AKT/mTOR通路蛋白檢測(cè) 采用Western blotting法。一抗為AKT/P-AKT、mTOR/P-mTOR。其余同上。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠脊髓神經(jīng)元病理變化 光鏡下觀察，對(duì)照組小鼠脊髓神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)及分布未見異常，神經(jīng)元胞體與軸突界限清晰，尼氏小體深染區(qū)與胞核淡染區(qū)輪廓清晰，尼氏小體豐富呈虎斑樣分布。模型組小鼠脊髓神經(jīng)元尼氏小體體積變小、數(shù)量減少及顏色變淺，排列松散，胞體與軸突輪廓模糊。與模型組相比，觀察組小鼠脊髓神經(jīng)元內(nèi)排列較整齊，尼氏小體數(shù)量及體積均增多，胞體與軸突輪廓模糊現(xiàn)象少見。

2.2 各組小鼠脊髓組織勻漿ROS水平比較 對(duì)照組、模型組、觀察組小鼠脊髓組織勻漿ROS水平分別為(43.34±2.67)、(84.22±3.15)、(64.10±3.59)U/mgprot。模型組小鼠脊髓組織勻漿ROS水平高于對(duì)照組(P<0.05)；觀察組小鼠脊髓組織勻漿ROS水平高于對(duì)照組(P<0.05)，低于模型組(P<0.05)。

2.3 各組小鼠脊髓組織自噬標(biāo)志物L(fēng)C3-Ⅱ/LC3-Ⅰ條帶光密度值比較 對(duì)照組、模型組、觀察組小鼠脊髓組織自噬標(biāo)志物L(fēng)C3-Ⅱ/LC3-Ⅰ條帶光密度值分別為0.486±0.021、0.251±0.032、0.566±0.054。小鼠脊髓組織自噬標(biāo)志物L(fēng)C3-Ⅱ/LC3-Ⅰ條帶光密度值觀察組高于模型組，模型組低于對(duì)照組，P均<0.05。

2.4 各組小鼠脊髓組織p-AKT、p-mTOR條帶光密度值比較 各組小鼠脊髓組織p-AKT、p-mTOR條帶光密度值見表1。模型組小鼠小鼠脊髓組織p-AKT、p-mTOR條帶光密度值高于對(duì)照組，P均<0.05；觀察組小鼠小鼠脊髓組織p-AKT、p-mTOR條帶光密度值低于對(duì)照組和模型組，P均<0.05。

表1 三組小鼠脊髓組織p-AKT、p-mTOR表達(dá)量比較

注：與對(duì)照組相比，*P<0.05；與模型組相比，#P<0.05。

3 討論

MS發(fā)病機(jī)制至今尚未明確，在過去的研究中已經(jīng)證實(shí)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和免疫失衡參與其中[6]。隨著對(duì)其研究的深入，在MS病灶中還可以發(fā)現(xiàn)髓鞘脫失、軸索損傷、神經(jīng)元變性及血腦屏障破壞等病理改變，而這些病理損傷都與氧化應(yīng)激有著密切的聯(lián)系[7]。這與中樞神經(jīng)系統(tǒng)氧耗量大，抗氧化能力低，氧化與抗氧化作用失衡時(shí)產(chǎn)生大量氧化中間產(chǎn)物ROS而遭受氧化應(yīng)激損傷有關(guān)[8]。已有研究證實(shí)在MS急性期發(fā)病中,活化的巨噬細(xì)胞與小膠質(zhì)細(xì)胞大量釋放活性氧而造成氧化應(yīng)激,它可以直接損傷細(xì)胞器的脂膜、DNA及蛋白質(zhì)，而受損的細(xì)胞器及異常的蛋白質(zhì)大量積聚于胞內(nèi)破壞細(xì)胞的平衡與穩(wěn)態(tài)[9]。并且Dasgupta等[10]在EAE小鼠脊髓束的大部分細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)有不同程度的碳素化蛋白質(zhì)積聚，并且此機(jī)制貫穿EAE整個(gè)病情進(jìn)展始末。自噬作為正常真核細(xì)胞清除蛋白質(zhì)和細(xì)胞器的主要途徑，是由單層或多層膜結(jié)構(gòu)包裹對(duì)受損細(xì)胞器等形成自噬小體，然后運(yùn)送至溶酶體中形成自噬溶酶體并降解消化其內(nèi)容物的過程[11]，在真核細(xì)胞中，當(dāng)發(fā)生氧化應(yīng)激損傷時(shí)，機(jī)體啟動(dòng)相關(guān)防御機(jī)制，可通過自噬對(duì)受損細(xì)胞器及異常的蛋白質(zhì)進(jìn)行降解而抵抗氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而維持細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)態(tài)及細(xì)胞器的更新[12]。已有研究表明由于谷胱甘肽的缺陷及蛋白酶體抑制可以引起氧化應(yīng)激的發(fā)生及碳素化蛋白質(zhì)的大量積聚，導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞死亡[13]。

mTOR作為經(jīng)典的調(diào)節(jié)自噬的蛋白激酶，在自噬的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中，mTOR是被發(fā)現(xiàn)參與其中的第一個(gè)分子，Ⅰ類PI3K/AKT信號(hào)通路是mTOR參與自噬的一條經(jīng)典的信號(hào)途徑，在它的下游信號(hào)中，絲/蘇氨酸激酶P70s6k可通過調(diào)控核糖體蛋白S6的磷酸化而抑制自噬的發(fā)生[14]。作為mTOR特異性抑制劑的雷帕霉素在1977年就被Martel發(fā)現(xiàn)它對(duì)EAE動(dòng)物模型的病情進(jìn)展進(jìn)行完全的阻遏，并在慢性EAE小鼠模型中也證實(shí)了雷帕霉素可以延緩EAE臨床癥狀的出現(xiàn)及降低嚴(yán)重程度[16]。雷帕霉素可與FK506結(jié)合蛋白(FKBP12)相結(jié)合而形成Rapa-FKBP12復(fù)合物，并在靠近mTOR的C末端激酶結(jié)構(gòu)域上游與該復(fù)合物的結(jié)合位點(diǎn)(FRB)結(jié)合對(duì)mTOR特異性抑制，并且可以選擇性的抑制P70s6激酶的磷酸化與功能活化，從而誘導(dǎo)自噬的發(fā)生，被抑制的mTOR通過增加對(duì)溶酶體的生物合成，從而促進(jìn)自噬溶酶體的形成，加強(qiáng)對(duì)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的清除，減少聚集體的形成并抑制神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的死亡。雷帕霉素作為免疫抑制劑在EAE及MS發(fā)病機(jī)制中的作用已被證實(shí)，但其作為自噬誘導(dǎo)劑在EAE中神經(jīng)元保護(hù)作用的機(jī)制尚無報(bào)道，所以筆者設(shè)計(jì)了該實(shí)驗(yàn)初步探討雷帕霉素在EAE中神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制。

本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比較，模型組小鼠脊髓神經(jīng)元中尼氏小體數(shù)量及體積減少，神經(jīng)元結(jié)構(gòu)模糊，損傷嚴(yán)重；觀察組小鼠脊髓神經(jīng)元結(jié)構(gòu)清晰，尼氏小體數(shù)量及體積介于對(duì)照組與EAE模型組之間。模型組小鼠脊髓勻漿ROS水平升高，自噬相關(guān)標(biāo)記物L(fēng)C3-Ⅱ/LC3-Ⅰ降低；觀察組小鼠脊髓勻漿ROS水平低于模型組，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ升高。表明雷帕霉素可以保護(hù)受到損傷的小鼠脊髓神經(jīng)元，降低氧化應(yīng)激，提高自噬水平。Shringarpure等[19]在EAE小鼠研究中發(fā)現(xiàn)大量積聚于神經(jīng)元細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)的蛋白質(zhì)中含有許多被氧化的蛋白酶。有研究證實(shí)雷帕霉素可以通過誘導(dǎo)自噬減輕聚集蛋白質(zhì)的毒性作用從而減緩神經(jīng)退行性變。我們推測(cè)EAE發(fā)病高峰期ROS大量釋放誘發(fā)氧化應(yīng)激，造成細(xì)胞器及蛋白質(zhì)等損害，而EAE發(fā)病高峰期中存在自噬缺陷，使大量的受損細(xì)胞器及蛋白質(zhì)無法得到有效清除而積聚于胞內(nèi)，大量積聚的已破壞的細(xì)胞器及蛋白質(zhì)等可正反饋促進(jìn)ROS釋放，持續(xù)遭受攻擊損害致病情進(jìn)行性加重。雷帕霉素可通過對(duì)自噬誘導(dǎo)，加強(qiáng)對(duì)受損細(xì)胞器和蛋白質(zhì)等物質(zhì)的清除，對(duì)氧化應(yīng)激產(chǎn)生抑制效應(yīng)而使ROS水平降低，減輕神經(jīng)元損傷，從而起保護(hù)作用。為進(jìn)一步驗(yàn)證我們的推測(cè)，我們對(duì)自噬通路中AKT/P70s6蛋白磷酸化水平進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示模型組小鼠脊髓組織p-AKT、p-mTOR條帶光密度值高于對(duì)照組，觀察組小鼠脊髓組織p-AKT、p-mTOR條帶光密度值低于對(duì)照組和模型組。提示模型組小鼠因磷酸化AKT及P70s6高表達(dá)而對(duì)自噬產(chǎn)生抑制效應(yīng)，從而出現(xiàn)自噬缺陷。雷帕霉素可對(duì)mTOR信號(hào)通路中上下游磷酸化AKT及P70s6蛋白激酶的抑制而誘導(dǎo)自噬的發(fā)生，并對(duì)胞內(nèi)大量積聚的受損細(xì)胞器及異常蛋白質(zhì)進(jìn)行有效的清除，從而使氧化/抗氧化作用得以平衡，抑制了氧化應(yīng)激的進(jìn)展，限制ROS對(duì)脊髓神經(jīng)元的損傷破壞，從而對(duì)EAE小鼠脊髓神經(jīng)元細(xì)胞起保護(hù)作用。

[1] Ohl K, Tenbrock K, Kipp M. Oxidative stress in multiple sclerosis: central and peripheral mode of action[J]. Exp Neurol，2016，277:58-67.

[2] Miller E, Mrowicka M, Zolynski K, et al. Oxidative stress in multiple sclerosis[J]. Polski Merkur Lek，2009，27(162):499-502.

[3] Gandhi S, Abramov AY. Mechanism of oxidative stress in neurodegneration[J]. Oxid Med Cell Long，2012，2012(3):428010-428010.

[4] Ravikumar B, Duden R, Rubinsztein DC. Aggregate-prone proteins with polyglutamine and polyalanine expansions are degraded by autophagy[J]. Hum Mol Gen，2002，11(9):1107-1117.

[5] Bergamini E.Autophagy: a cell repair mechanism that retards ageing and age-associated diseases and can be intensified pharmacologically[J]. Mol Aspects Med，2006，27(5-6):403-410.

[6] Nakajima H, Fukuda K, Doi Y, et al. Expression of TH1/TH2-related chemokine receptors on peripheral T cells and correlation with clinical disease activity in patients with multiple sclerosis[J]. Eur Neurol，2004，52(3):162-168.

[7] Gonsette RE. Neurodegeneration in multiple sclerosis: the role of oxidative stress and excitotoxicity[J]. J Neurol Sci，2008，274(1-2):48-53.

[8] Miller E, Walczak A, Saluk J, et al. Oxidative modification of patient's plasma proteins and its role in pathogenesis of multiple sclerosis[J]. Clinical Biochemistry, 2012, 45(1-2):26-30.

[9] Qi X, Lewin AS, Sun L, et al. Mitochondrial protein nitration primes neurodegeneration in experimental autoimmune encephalomyelitis[J]. Biol Chem， 2006，281(42):31950-31962.

[10] Dasgupta A, Zheng J, Perrone-Bizzozero NI, et al. Increased carbonylation, protein aggregation and apoptosis in the spinal cord of mice with experimental autoimmune encephalomyelitis[J]. ASN Neuro，2013，5(2):111.

[11] Kiffin R, Bandyopadhyay U, Cuervo AM. Oxidative stress and autophagy[J]. Antioxid Redox Signal，2006，8(1-2):152-162.

[12] He LQ, Lu JH, Yue ZY. Autophagy in ageing and ageing-associated diseases[J]. Acta Pharmacologica Sinica，2013，34(5):605-611.

[13] Divald A,Powell SR. Proteasome mediates removal of proteins oxidized during myocardial ischemia[J]. Free Radic Biol Med, 2006,40(1):156-164.

[14] Kumar S, Patel R, Moore S, et al. Estrogen receptor beta ligand therapy activates PI3K/Akt/mTOR signaling in oligodendrocytes and promotes remyelination in a mouse model of multiple sclerosis[J]. Neurobiol Dis, 2013,56(4):131-144.

Pathological changes of spinal cord neurons in EAE mice with intraperitoneal injection of rapamycin

XIEYang,HUANGYuanshuai,YANGYuan,LIZuoxiao

(TheAffiliatedHospitalofSouthwestMedicalUniversity,Luzhou646000,China)

Objective To investigate the pathological changes of spinal cord neurons in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) mice with intraperitoneal injection of rapamycin and the mechanisms underlying it.Methods C57BL/6 mice were randomly divided into the control group, model group and observation group, 15 mice in each group. In the model group and observation group, we prepared the EAE models. The mice in the observation group were injected with rapamycin 0.75 mg/(kg·d) intraperitoneally and were injected with 0.5 mL of the pertussis bacteria dilution after 2 days and killed after 18 days. Collecting the spinal tissues to observe pathological changes with nissl staining, detecting the content of ROS with DCF chemical fluorescence, the expression of autophagy markers LC3-II/LC3-I and mTOR, Akt proteins in Akt/mTOR signaling pathway with Western blotting. Results Compared with the control group, the nissl bodies had smaller volumes, less number and fuzzy boundaries in spinal cord neurons of mice in the model group. Compared with the model group, the spinal cord neurons were neatly arranged, the number and the volume of the nissl bodies were increased, fuzzy boundaries phenomenons were rare in the observation group. The content of ROS in the control group, model group and observation group were (43.34±2.67), (84.22±3.15) and (64.10±3.59) U/mgprot, respectively. The content of ROS in the model group was higher than that of the control group (P<0.05). The content of ROS in the observation group was higher than that in the control group (P<0.05), which was lower than that in the model group (P<0.05). The autophagy marker LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰstrip optical density (OD) values in the spinal cord tissues of three groups were 0.486±0.021, 0.251±0.032 and 0.566±0.054, respectively; the observation group was higher than the model group, and the model group was lower than the control group (all P<0.05). Meanwhile, the OD values of p-Akt and p-mTOR proteins in the model group were higher than those of the control group (bothP<0.05), and the OD values of p-Akt and p-mTOR proteins in the observation group were lower than those of the control group and model group (allP<0.05). Conclusions Intraperitoneal injection of rapamycin reduces the pathological changes of spinal cord neurons in EAE mice. This may be due to the fact that rapamycin inhibits autophagic activity of AKT/mTOR/P70S6 pathway, removes ROS and inhibits oxidative stress.rapamycin can inhibit the mTOR signaling pathways to activate the autophagy activities, and reduce the ROS levels to inhibit the oxidative stress ,thus protecting the spinal cord neurons in EAE mice.

rapamycin; experimental autoimmune encephalomyelitis; cell autophagy; oxidative stress; PI3K-AKT-mTOR signaling pathways

四川省衛(wèi)生廳科研基金資助項(xiàng)目(120336)。

謝陽(1992-)，男，碩士研究生，醫(yī)師，主要研究方向?yàn)樯窠?jīng)免疫學(xué)。E-mail： 464418617@qq.com

李作孝(1964-)，男，碩士，教授，主要研究方向?yàn)樯窠?jīng)免疫學(xué)。E-mail： lzx3235@sina.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.11.008

R744.5

A

1002-266X(2017)11-0026-04

2016-09-22)