鄧明芬，朱丹，桂傳枝,2，官志忠,3(貴州醫(yī)科大學(xué)病理學(xué)教研室，貴陽(yáng) 550004；2貴州省腫瘤醫(yī)院；3貴州省分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室)

氟及7-NI共培養(yǎng)的SH-SY5Y細(xì)胞nNOS表達(dá)、增殖情況觀(guān)察

鄧明芬1，朱丹1，桂傳枝1,2，官志忠1,3
(1貴州醫(yī)科大學(xué)病理學(xué)教研室，貴陽(yáng) 550004；2貴州省腫瘤醫(yī)院；3貴州省分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室)

目的 觀(guān)察氟及神經(jīng)型一氧化氮合成酶(nNOS)特異性抑制劑7-硝基吲唑(7-NI)共培養(yǎng)的SH-SY5Y細(xì)胞增殖情況和nNOS表達(dá)變化。方法 將體外培養(yǎng)SH-SY5Y細(xì)胞分為對(duì)照組、低氟組、高氟組、7-NI組、低氟+7-NI組、高氟+7-NI組，每組6個(gè)復(fù)孔。低氟組加入0.2 mmol/L NaF，高氟組加入2.0 mmol/L NaF，7-NI組加入1 μmol/L 7-NI，低氟+7-NI組加入0.2 mmol/L NaF和1μmol/L 7-NI，高氟+7-NI組加入2.0 mmol/L NaF和1 μmol/L 7-NI，對(duì)照組加入等體積培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。采用CCK-8法檢測(cè)各組SH-SY5Y細(xì)胞增殖情況(以O(shè)D450表示)；采用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 法檢測(cè)各組SH-SY5Y細(xì)胞NOS mRNA；采用Western blotting法檢測(cè)各組SH-SY5Y細(xì)胞NOS 蛋白。結(jié)果 低氟組、高氟組細(xì)胞OD450均低于對(duì)照組(P均<0.05)，且高氟組細(xì)胞OD450低于低氟組(P<0.05)；7-NI組細(xì)胞OD450與對(duì)照組相比P>0.05；低氟+7-NI組細(xì)胞OD450高于低氟組(P<0.05)；高氟+7-NI組細(xì)胞OD450高于高氟組(P<0.05)。低氟組、高氟組細(xì)胞nNOS mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量均高于對(duì)照組(P均<0.05)，且高氟組細(xì)胞nNOS mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量均高于低氟組(P均<0.05)；7-NI組細(xì)胞nNOS mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量均低于對(duì)照組(P均<0.05)；低氟+7-NI組細(xì)胞nNOS mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量均低于低氟組(P<0.05)；高氟+7-NI組細(xì)胞nNOS mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量均低于高氟組(P<0.05)。結(jié)論 氟可以抑制SH-SY5Y細(xì)胞增殖，7-NI共培養(yǎng)可以減輕氟對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞的增殖抑制作用。

氟;氟中毒；人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞；7-硝基吲唑；神經(jīng)型一氧化氮合成酶；一氧化氮

氟中毒可以引起機(jī)體多個(gè)系統(tǒng)和器官的損害。在神經(jīng)系統(tǒng)，氟能透過(guò)血腦屏障進(jìn)入腦組織，過(guò)量的氟可引起腦組織內(nèi)自由基含量增加和抗氧化酶活性下降，使機(jī)體處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，引起神經(jīng)系統(tǒng)損害[1～5]。一氧化氮(NO)是具有生物活性的自由基之一，與氧自由基關(guān)系密切。機(jī)體內(nèi)的NO主要是在一氧化氮合成酶(NOS)作用下，以L(fǎng)-精氨酸為底物合成的。NOS分神經(jīng)型NOS(nNOS)、內(nèi)皮細(xì)胞型NOS(eNOS)和白細(xì)胞/巨噬細(xì)胞性NOS(iNOS)。nNOS廣泛存在于大腦皮層、海馬和杏仁核等神經(jīng)細(xì)胞中。nNOS可被Ca2+激活，過(guò)多的nNOS可合成大量NO，在體內(nèi)NO可與超氧陰離子快速結(jié)合生成過(guò)氧亞硝基陰離子(ONOO-)，引起細(xì)胞和組織損傷，從而參與腦損傷過(guò)程[4，5]。另有研究報(bào)道氟可誘導(dǎo)BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)的NO的釋放增多，且這種誘導(dǎo)作用能被iNOS抑制劑SMT所阻斷[6]。因此，NO和NOS有可能參與氟中毒性神經(jīng)損傷的發(fā)病機(jī)制[7]。 SH-SY5Y細(xì)胞是神經(jīng)母細(xì)胞瘤患者的轉(zhuǎn)移骨瘤灶細(xì)胞SK-N-SH經(jīng)3次克隆后的亞系[8]，屬腫瘤細(xì)胞，但細(xì)胞形態(tài)、生理及生化功能與神經(jīng)元具有相似性[9]，目前已被作為神經(jīng)元替代細(xì)胞廣泛用于替代神經(jīng)元進(jìn)行神經(jīng)系統(tǒng)疾病的研究。7-硝基吲唑(7-NI)是特異性nNOS抑制劑。為進(jìn)一步明確染氟對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞增殖的影響及nNOS在其中發(fā)揮的作用，本研究觀(guān)察了染氟及7-NI共培養(yǎng)的SH-SY5Y細(xì)胞增殖情況和nNOS表達(dá)變化。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、主要試劑與儀器 SH-SY5Y 細(xì)胞，氟化鈉(NaF)溶液、7-NI均購(gòu)于美國(guó)Sigma公司，細(xì)胞增殖-毒性檢測(cè)試劑盒(簡(jiǎn)稱(chēng)CCK-8)購(gòu)于日本Dojindo 公司。BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自Thermo Fisher Scientific公司，兔抗人 nNOS單克隆抗體、鼠抗人 β-actin(內(nèi)參照)單克隆抗體均自美國(guó) Abcam 公司；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔 IgG(H + L)、山羊抗鼠 IgG(H + L)均購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所，ECL 試劑盒購(gòu)自美國(guó)Millipore 公司。RNA 提 取 試 劑 TRIzol購(gòu)自Invitrogen公司，Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及SYBR 熒光染料均購(gòu)自Thermo Fisher Scientific公司； nNOS基因及內(nèi)參照β-actin基因的 PCR引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。ELX800UV酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Rad公司)，實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 儀(美國(guó) BD 公司產(chǎn)品)。

1.2 細(xì)胞分組及NaF、7-NI應(yīng)用方法 用含10%胎牛血清和1%雙抗的高糖DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)SH-SY5Y細(xì)胞，培養(yǎng)條件為37 ℃、5%CO2。取生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期SH-SY5Y細(xì)胞接種于96孔板，每孔100 μL細(xì)胞懸液，細(xì)胞密度1×104/mL。設(shè)對(duì)照組、低氟組、高氟組、7-NI組、低氟+7-NI組、高氟+7-NI組，每組6個(gè)復(fù)孔。低氟組加入0.2 mmol/L NaF，高氟組加入2.0 mmol/L NaF，7-NI組加入1 μmol/L 7-NI，低氟+7-NI組加入0.2 mmol/L NaF和1 μmol/L 7-NI，高氟+7-NI組加入2.0 mmol/L NaF和1 μmol/L 7-NI，對(duì)照組加入等體積培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.3 各組細(xì)胞增殖情況觀(guān)察 各孔加入CCK-8試劑10 μL，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2 h，在 ELx800UV 酶標(biāo)儀波長(zhǎng)450 nm 處檢測(cè)各孔的吸光度(OD450)值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 各組細(xì)胞nNOS mRNA和蛋白檢測(cè) ①nNOS mRNA：采用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 法。收集各組細(xì)胞，采用TRIzol、氯仿、異丙醇等試劑提取細(xì)胞的總RNA，用核酸蛋白定量?jī)x檢測(cè)RNA的純度及濃度。參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。反應(yīng)體系為：3 μg總RNA、1 μL Oligo(dT)18 primer，最后加超純水至總體積為12 μL，65 ℃水浴5 min，加入4 μL 5×Reaction Buffer、1 μL Ribolck RNase Inhibitor、2 μL 10 mM dNTP Mix、1 μL RevertAid M- MuLV RT，至總反應(yīng)體系為20 μL。反應(yīng)條件為：42 ℃孵育60 min，70 ℃加熱5 min，4 ℃降溫保存；將轉(zhuǎn)錄所得的cDNA置于-80 ℃保存，備用。以上述cDNA為模板，行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。反應(yīng)體系為：2 μL cDNA、10 μL SYBR Green PCR Maser mix、上下游引物各1 μL、6 μL超純水，總反應(yīng)體系為20 μL。nNOS正向引物5′-TCCAGAACTCACACAAGGT-3′，反向引物5′-GGAGACGCACGAAGATAG-3′，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度168 bp；內(nèi)參照β-actin正向引物5′-CTACCTCATGAAGATCCTCACCGA-3′，反向引物5′-TTCTCCTTAATGTCACGCACGATT-3′，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度590 bp。反應(yīng)條件如下：第一步95 ℃解鏈10 min；，第二步95 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min，共40個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt值表示nNOS mRNA的相對(duì)表達(dá)量。②nNOS蛋白：采用Western blotting法。收集各組細(xì)胞，用RIPA 裂解液裂解并提取蛋白，采用BCA法進(jìn)行蛋白定量；蛋白質(zhì)上樣量為25 μg每孔，制8% SDS-PAGE分離膠分離蛋白，將分離后的蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移至0.22 μm硝酸纖維素(PVDF)膜上，封閉液室溫下封閉處理1 h，分別加入一抗[兔抗人 nNOS 單克隆抗體(體積稀釋比例為1∶1 000)、鼠抗人β-actin單克隆抗體(內(nèi)參照,體積稀釋比例為1∶10 000)]，將載有蛋白的PVDF膜置于冰袋之上，于搖床上反應(yīng)過(guò)夜；PBST洗滌3次，分別加入二抗[辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔 IgG(H + L)和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠 IgG(H+L，體積稀釋比例均為 1∶1 000]于室溫下?lián)u床上反應(yīng)1 h；PBST洗滌3次，采用 ECL試劑盒進(jìn)行發(fā)光反應(yīng)顯色，膠片曝光；使用Image J 軟件進(jìn)行圖像分析，以nNOS蛋白條帶與內(nèi)參照β-actin蛋白條帶灰度值的比值表示各組nNOS蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞OD450比較 對(duì)照組、低氟組、高氟組、7-NI組、低氟+7-NI組、高氟+7-NI組OD450分別為0.85±0.01、0.71±0.01、0.44±0.03、0.81±0.02、0.80±0.02、0.71±0.04。低氟組、高氟組細(xì)胞OD450均低于對(duì)照組(P均<0.05)，且高氟組細(xì)胞OD450低于低氟組(P<0.05)；7-NI組細(xì)胞OD450與對(duì)照組相比P>0.05；低氟+7-NI組細(xì)胞OD450高于低氟組(P<0.05)；高氟+7-NI組細(xì)胞OD450高于高氟組(P<0.05)。

2.2 各組細(xì)胞nNOS mRNA和蛋白比較 各組細(xì)胞nNOS mRNA和蛋白見(jiàn)表1。由表1可見(jiàn)，低氟組、高氟組細(xì)胞nNOS mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量均高于對(duì)照組(P均<0.05)，且高氟組細(xì)胞nNOS mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量均高于低氟組(P均<0.05)；7-NI組細(xì)胞nNOS mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量均低于對(duì)照組(P均<0.05)；低氟+7-NI組細(xì)胞nNOS mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量均低于低氟組(P<0.05)；高氟+7-NI組細(xì)胞nNOS mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量均低于高氟組(P<0.05)。

3 討論

氟是活性最強(qiáng)的鹵族化學(xué)元素，是一種強(qiáng)氧化劑和氟化劑。氟元素廣泛存在于我們的生活環(huán)境之中，人體可通過(guò)不同途徑如空氣、食物、飲水等將之?dāng)z入體內(nèi)，適量的氟可以滿(mǎn)足機(jī)體生理所需，而過(guò)量的氟則會(huì)在體內(nèi)聚集引起氟中毒。地方性氟中毒則是由于當(dāng)?shù)鼐用耖L(zhǎng)期生活在高氟環(huán)境(飲水、燃煤、磚茶等)中，導(dǎo)致人體的多個(gè)器官系統(tǒng)的病變[1]。前期的研究表明[2，3,10,11]，氟中毒可致大鼠神經(jīng)系統(tǒng)損害，仔鼠學(xué)習(xí)和記憶能力下降；氟中毒能導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)的損害，但其發(fā)病機(jī)制尚不十分清楚。且如今尚存許多地方性氟中毒患者，仍然缺乏治療地方性氟中毒的相關(guān)藥物。NO具有多種生物活性，在體內(nèi)由NOS催化合成。NOS在體內(nèi)按其來(lái)源不同分為nNOS、eNOS和iNOS三種類(lèi)型，其中nNOS主要存在神經(jīng)元中。NO可以在神經(jīng)細(xì)胞之間傳遞信息，影響早期的記憶及學(xué)習(xí)功能。NO也是具有很強(qiáng)活性的自由基，過(guò)量的NO可在體內(nèi)與活性氧發(fā)生反應(yīng)生成強(qiáng)效氧化劑硝基過(guò)氧化物，后者參與體內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)引起機(jī)體損傷。本研究結(jié)果顯示，低氟組、高氟組SH-SY5Y細(xì)胞OD450均低于對(duì)照組，且高氟組SH-SY5Y細(xì)胞OD450低于低氟組；低氟組、高氟組SH-SY5Y細(xì)胞nNOS mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量均高于對(duì)照組，且高氟組SH-SY5Y細(xì)胞nNOS mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量均高于低氟組。提示染氟對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞增殖有抑制作用，且染氟量高者細(xì)胞增殖活性低；這種作用可能是由于染氟的SH-SY5Y細(xì)胞nNOS mRNA和蛋白表達(dá)升高。氟可使大鼠腦組織及神經(jīng)細(xì)胞中NOS活性增高[7,10]，引起中樞神經(jīng)興奮，神經(jīng)系統(tǒng)NOS活性的增高可催化合成過(guò)多的NO，過(guò)量的NO在神經(jīng)系統(tǒng)中蓄積，作為自由基與體內(nèi)活性氧發(fā)生反應(yīng)生成強(qiáng)效氧化劑硝基過(guò)氧化物，參與體內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)引起機(jī)體損傷。

表1 各組細(xì)胞nNOS mRNA和蛋白表達(dá)比較

注：與對(duì)照組相比，*P<0.05；與低氟組相比，#P<0.05；與高氟組相比，※P<0.05。

NO是具有很強(qiáng)活性的自由基，過(guò)量的NO可在體內(nèi)與活性氧發(fā)生反應(yīng)生成強(qiáng)效氧化劑硝基過(guò)氧化物，后者參與體內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)引起機(jī)體損傷。nNOS主要存在神經(jīng)元中，過(guò)量的Ca2+可激活體內(nèi)多余的nNOS，引起神經(jīng)元的損傷和死亡[4，5]，這可能與被激活的nNOS催化產(chǎn)生過(guò)量的NO有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，低氟組、高氟組SH-SY5Y細(xì)胞OD450均低于對(duì)照組，且高氟組SH-SY5Y細(xì)胞OD450低于低氟組；低氟組、高氟組SH-SY5Y細(xì)胞nNOS mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量均高于對(duì)照組，且高氟組SH-SY5Y細(xì)胞nNOS mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量均高于低氟組。提示染氟對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞增殖有抑制作用，且染氟量高者細(xì)胞增殖活性低；這種作用可能是由于染氟使SH-SY5Y細(xì)胞nNOS mRNA和蛋白表達(dá)升高，NOS活性增高[11,12]，引起細(xì)胞內(nèi)NO釋放過(guò)多[6]。

7-NI是一種具有較強(qiáng)選擇性的nNOS抑制劑，具有保護(hù)神經(jīng)元的作用，且對(duì)許多疾病都顯示出了一定的療效。作為nNOS特異性抑制劑，7-NI主要通過(guò)抑制nNOS活性，阻斷NO在體內(nèi)的主要合成途徑，減少NO等自由基在體內(nèi)的蓄積和釋放，從而抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑，減輕氧化應(yīng)激損傷，減少神經(jīng)元死亡，從而產(chǎn)生神經(jīng)元保護(hù)作用[13,14]。本研究結(jié)果顯示，7-NI組SH-SY5Y細(xì)胞OD450與對(duì)照組相比P>0.05，但7-NI組SH-SY5Y細(xì)胞nNOS mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量低于對(duì)照組。提示7-NI共培養(yǎng)可以抑制SH-SY5Y細(xì)胞nNOS mRNA和蛋白表達(dá)，但對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞增殖無(wú)影響。低氟+7-NI組SH-SY5Y細(xì)胞OD450高于低氟組，高氟+7-NI組SH-SY5Y細(xì)胞OD450高于高氟組；低氟+7-NI組SH-SY5Y細(xì)胞nNOS mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量低于低氟組，高氟+7-NI組SH-SY5Y細(xì)胞nNOS mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量低于高氟組。提示7-NI共培養(yǎng)可以減輕染氟對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞增殖的抑制作用，這可能與7-NI抑制染氟導(dǎo)致的SH-SY5Y細(xì)胞nNOS mRNA和蛋白表達(dá)上調(diào)有關(guān)。本研究結(jié)果提示，NO/nNOS在氟中毒所致神經(jīng)系統(tǒng)損傷中起著一定作用，并且這種損傷作用可被nNOS的特異性抑制劑7-NI所阻斷，這可能對(duì)地方性氟中毒神經(jīng)系統(tǒng)損害藥物治療的研究提供了一條新思路和新靶點(diǎn)。

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Cell proliferation and nNOS expression in SH-SY5Y cells with co-cultivation of fluorosis and 7-nitroindazole

DENGMingfen1,ZHUDan,GUIChuanzhi,GUANZhizhong

(1DepartmentofPathology,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,China)

Objective To observe the cell proliferation and neuronal nitric oxide synthase (nNOS) expression in human neuroblastoma (SH-SY5Y) cells with co-cultivation of fluorosis and 7-nitroindazole. Methods SH-SY5Y cells cultured in vitro were divided into six groups, the control group, low-and high-dose fluoride exposure groups (0 mmol/L NaF, 0.2 mmol/L NaF and 2.0 mmol/L NaF), 7-NI group, low-and high-dose fluoride exposure combined with 7-NI groups (1 μmol/L 7-NI, 0.2 mmol/L NaF+1 μmol/L 7-NI , and 2.0 mmol/L NaF+1 μmol/L 7-NI), and cells in the above groups were treated for 24 h, and setting six holes in each group. The proliferation of SH-SY5Y cells was detected by CCK-8 (shown as OD450). The expression levels of nNOS mRNA and protein were detected by real-time fluorescent quantitative PCR and Western blotting.Results Compared with the control group, low-and high-dose fluoride exposure groups exhibited significantly lower OD450of SH-SY5Y cells (all P<0.05), while there was no statistically significant difference in 7-NI group (P>0.05). Compared with the low-dose fluoride group, the high-dose fluoride group exhibited significantly lower OD450(P<0.05). Compared with the cells only treated with NaF, the OD450of SH-SY5Y cells in the fluoride combined with 7-NI groups were significantly increased (allP<0.05). Compared with the control group, the expression levels of nNOS mRNA and protein in the low-and high-dose fluoride groups were significantly increased (allP<0.05), and the high-dose fluoride group was significantly higher than low-dose fluoride fluoride group (P<0.05). Compared with cells only treated with NaF, the expression levels of nNOS mRNA and protein in the fluoride combined with 7-NI groups were significantly decreased (allP<0.05).Conclusion Fluoride can inhibit the proliferation of SH-SY5Y cells, and co-cultivation of fluorosis and 7-nitroindazole can reduce the inhibitory effect of fluoride on the proliferation of SH-SY5Y cells.

fluorine; fluorosis; human neuroblastoma cells; 7-nitroindazole; neuronal nitric oxide synthase; nitric oxide

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81460482)；教育部博士學(xué)科點(diǎn)專(zhuān)項(xiàng)科研基金資助項(xiàng)目(20115215120003)。

鄧明芬(1991-)，女，碩士在讀，主要研究方向?yàn)榈胤讲〔±韺W(xué)。E-mail： 1250104629@qq.com

桂傳枝(1972-)，女，博士，教授，主要研究方向?yàn)榈胤叫苑卸?。E-mail： guichuanzhi07@sina.cn

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.11.007

R995；R977.3；R994.6

A

1002-266X(2017)11-0022-04

2016-11-18)