蘇艷軍，劉 彬，刁 暢，張建明，錢 軍，程若川

(昆明醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院甲狀腺外科 650032)

論著·基礎(chǔ)研究

甲狀腺術(shù)中甲狀旁腺體外保存后自體移植對其功能影響的研究*

蘇艷軍，劉 彬，刁 暢，張建明，錢 軍，程若川△

(昆明醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院甲狀腺外科 650032)

目的 研究甲狀腺術(shù)中甲狀旁腺自體移植過程中體外臨時保存對其細胞活性和移植后功能的影響，以提高甲狀旁腺自體移植的成活率。方法 (1)以實驗家兔為研究對象，分為A、B、C 3組，每組8只。取出雙側(cè)下甲狀旁腺，A組立即后續(xù)處理；B、C組分別置于4 ℃、室溫(22～24 ℃)生理鹽水中30 min。左側(cè)甲狀旁腺統(tǒng)一行HE染色，觀察細胞形態(tài)；右側(cè)甲狀旁腺統(tǒng)一行透射電子顯微鏡檢查，觀察細胞超微結(jié)構(gòu)變化。(2)實驗家兔分為D、E、F 3組，每組8只，行雙側(cè)甲狀腺全切除術(shù)后，取出雙下甲狀旁腺，D組立即移植(雙側(cè)頸前肌內(nèi)，下同)；E、F組分別置于4 ℃、室溫(22～24 ℃)生理鹽水中30 min后移植；3組動物于術(shù)前1 d，術(shù)后1、3、5、7 d抽血監(jiān)測血鈣、血PTH水平，并于第7天處死動物，切取移植的甲狀旁腺組織行HE染色，高倍鏡下觀察甲狀旁腺組織面積及病理損害。結(jié)果 正常甲狀旁腺以主細胞為主，電鏡下主細胞核圓、居中；4 ℃保存后甲狀旁腺細胞形態(tài)未見明顯變化，主細胞線粒體輕度腫脹；室溫保存后甲狀旁腺細胞稍腫脹，部分空泡變性，電鏡下細胞核形態(tài)不規(guī)則，線粒體極度腫脹變形、嵴斷裂、減少。動物雙下甲狀旁腺移植術(shù)后，血鈣、血PTH均明顯下降，之后逐漸上升；術(shù)后7 d兩組間差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；術(shù)后7 d D組：正常甲狀旁腺細胞密集分布于頸前肌肉組織中；E組部分空泡變性；F組：只有部分健存甲狀旁腺細胞散在分布于肌肉中。結(jié)論 離體甲狀旁腺應(yīng)保存在4 ℃生理鹽水中，并盡可能在30 min內(nèi)完成自體移植。

甲狀旁腺；移植，自體；動物實驗；保存

隨著世界范圍內(nèi)甲狀腺癌發(fā)病率的不斷上升(韓國第1[1]，我國第4[2])，甲狀腺全切除及中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)清掃已成為甲狀腺癌主流的手術(shù)方式[3-4]，術(shù)中喉返神經(jīng)的常規(guī)顯露和精細化被膜解剖及喉返神經(jīng)監(jiān)測儀的應(yīng)用使得喉返神經(jīng)的損傷率逐漸下降[5-8]，而中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)清掃后，甲狀旁腺功能減退癥就成為了最常見的并發(fā)癥之一[9]。甲狀旁腺的原位保留是目前公認的防止術(shù)后甲狀旁腺功能減退的最佳方法，但對于A3型(完全位于甲狀腺組織內(nèi))甲狀旁腺及嚴重缺血、游離的甲狀旁腺，自體移植是最后的彌補方法[10]。1975年Wells等[11]第1次報道甲狀旁腺自體移植后，關(guān)于這方面的研究較多，文獻報道甲狀旁腺自體移植的成功率為55%～100%[12]，差異較大，其原因可能為甲狀旁腺移植數(shù)目的不同，甲狀旁腺離體后體外保存對其活性的影響，還有移植方法的不同等。多個研究證實在甲狀腺術(shù)中常規(guī)移植1～2顆甲狀旁腺，幾乎可以避免嚴重的永久性甲狀旁腺功能低下[13]。甲狀旁腺體外臨時保存是自體移植過程中的一個重要環(huán)節(jié)，目前相關(guān)報道較少，值得深入研究以提高移植成活率。

1 材料與方法

1.1 材料 實驗家兔48只(購于昆明醫(yī)科大學動物實驗中心)，雌雄不限，每只2 500～3 000 g，每籠1只單獨飼養(yǎng)于標準環(huán)境，自由進食。

1.2 方法 實驗家兔分為A、B、C、D、E、F 6組，每組8只。3%戊巴比妥鈉(購于昆明醫(yī)科大學動物實驗中心)1.0 mL/kg沿耳緣靜脈緩慢注射麻醉，生效后，動物仰臥位固定，頸部備皮，碘伏消毒，于環(huán)狀軟骨下至胸骨切跡上2 cm做縱向切口，依次切開皮膚、皮下組織、頸白線，暴露氣管，于環(huán)狀軟骨下甲狀腺周圍、氣管食管溝及頸鞘內(nèi)探查、顯露甲狀旁腺，見圖1。

手術(shù)切取A、B、C 3組實驗動物雙下甲狀旁腺。A組(對照組)：甲狀旁腺立即后續(xù)處理；B組(冷缺血組)：甲狀旁腺放置于4 ℃生理鹽水中30 min；C組(熱缺血組)：甲狀旁腺放置于室溫(22～24 ℃)生理鹽水中30 min。左側(cè)甲狀旁腺統(tǒng)一行HE染色，觀察細胞形態(tài)；右側(cè)甲狀旁腺統(tǒng)一行透射電子顯微鏡檢查，觀察甲狀旁腺細胞內(nèi)細胞核、線粒體等超微結(jié)構(gòu)變化。

D、E、F 3組，行雙側(cè)甲狀腺全切除術(shù)后，切取雙下甲狀旁腺，D組甲狀旁腺立即用精細剪將腺體剪成體積約1 mm3的碎粒，在頸前肌鈍性分離形成“口袋”，將甲狀旁腺移植其內(nèi)，并用不可吸收線縫合做標記；E組甲狀旁腺放置于4 ℃生理鹽水中30 min后處理同D組；F組甲狀旁腺放置于室溫(22～24 ℃)生理鹽水中30 min后處理同D組。D、E、F 3組動物于術(shù)前1 d，術(shù)后1、3、5、7 d抽血監(jiān)測血鈣(微板比色法)、血PTH[酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)]水平，并于第7天處死動物切取移植的甲狀旁腺組織行HE染色，高倍鏡下觀察甲狀旁腺組織面積及病理損害。

2 結(jié) 果

2.1 A組、B組、C組HE染色及鏡檢情況 (1)A組：HE染色，甲狀旁腺以主細胞為主，伴少許嗜酸細胞，細胞巢周圍有脂肪組織浸潤(圖2A)；透射電子顯微鏡檢查，可見細胞核圓、居中，超微結(jié)構(gòu)未見明顯改變(圖2B)。(2)B組：HE染色，甲狀旁腺細胞形態(tài)無明顯改變，少量空泡變性(1%～5%)(圖2C)；透射電子顯微鏡檢查，甲狀旁腺細胞核圓、居中，線粒體腫脹、嵴斷裂、灶性空化，可見分泌顆粒(圖2D)。(3)C組：HE染色，甲狀旁腺細胞部分空泡變性(5%～10%)，局部腺泡間纖維組織增生(5%～10%)(圖2E)；行透射電子顯微鏡檢查，甲狀旁腺細胞核形態(tài)不規(guī)則、細胞質(zhì)內(nèi)可見大量空泡樣結(jié)構(gòu)(圖2F)，線粒體極度腫脹、嵴斷裂、減少，可見分泌顆粒(圖2G)。

2.2 D、E、F 3組血鈣的變化 D、E、F 3組血鈣術(shù)后均低于術(shù)前水平，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，以術(shù)后1 d最低，并呈緩慢恢復(fù)趨勢；3組間不同時間點血鈣在術(shù)前1 d、術(shù)后1、3、5 d差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，但術(shù)后7 d兩組間差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1。

A：甲狀腺(白色箭頭)，甲狀旁腺(黑色箭頭)；B：精細剪將甲狀旁腺腺體剪成體積約1 mm3的碎粒；C：將腺體移植于頸前肌“口袋”內(nèi)(黑色箭頭)；D：用4-0不可吸收線縫合并標志移植處(黑色箭頭)。

圖1 甲狀腺自體移植方法 表1 3組血鈣變化情況

#：P<0.05，與術(shù)前比較；@：P<0.05，與D組同時間點比較；*：P<0.05，與E組同時間點比較。

2.3 D、E、F 3組血PTH的變化 D、E、F 3組血PTH術(shù)后均低于術(shù)前水平，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，以術(shù)后1 d最低，并呈緩慢恢復(fù)趨勢；3組間不同時間點血PTH在術(shù)前1 d、術(shù)后1、3、5 d血鈣差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，術(shù)后7 d D、E兩組間差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，而F組與D、E兩組差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表2。

A：甲狀旁腺以主細胞為主，伴少許嗜酸細胞，細胞巢周圍有脂肪細胞浸潤(HE，×400)；B：甲狀旁腺主細胞核圓、居中(電鏡，×5 000)；C：甲狀旁腺細胞形態(tài)無明顯改變，少量空泡變性(HE，×400)；D：線粒體稍腫脹、核斷裂(電鏡，×10 000)；E：甲狀旁腺部分空泡變性，局部腺泡間纖維組織增生(HE，×400)；F：甲狀旁腺細胞核不規(guī)則變形，包漿內(nèi)可見大量空泡樣結(jié)構(gòu)(電鏡，×1 500)；G：線粒體極度腫脹、嵴斷裂、減少(電鏡，×50 000)。

圖2 甲狀腺體外保存后并病理改變 表2 3組血PTH變化情況

#：P<0.05，與術(shù)前比較；@：P<0.05，與D組同時間點比較；*：P<0.05，與E組同時間點比較。

A：D組；B：E組；C：F組。

圖3 甲狀腺自體移植后病理改變

2.4 D、E、F 3組術(shù)后7 d時甲狀旁腺病理結(jié)果 D組自體移植的甲狀旁腺組織大量存活下來，密集分布于頸前肌肉中，細胞形態(tài)無明顯改變(圖3A)；E組甲狀旁腺細胞同樣存活較多，但部分空泡變性(圖3B)；F組甲狀旁腺細胞呈散在分布于肌肉中，部分細胞壞死，健存細胞密度明顯低于D、E組(圖3C)。3 討 論

在尿毒癥晚期繼發(fā)性甲狀旁腺功能亢進患者手術(shù)方式之一就是甲狀旁腺全切除，為預(yù)防術(shù)后持續(xù)性甲狀旁腺功能低下，通常將部分甲狀旁腺組織冰凍保存，需要時再進行移植，常用的保存介質(zhì)為RPMI1640培養(yǎng)基，也有報道術(shù)中將甲狀旁腺組織臨時保存在DMEM中來維持其活性,胎兒甲狀旁腺在液氮中保存90 d后異體移植仍能存活[14-16]。由于甲狀腺術(shù)中甲狀旁腺體外保存時間相對較短，通常為術(shù)中快速冰凍所需時間，將其保存在培養(yǎng)基中操作過程復(fù)雜且耗時較長，因此不適合術(shù)中即刻、短暫的保存，生理鹽水廉價、方便、易取，目前臨床最常用，所以本實驗仍然選擇生理鹽水作為保存介質(zhì)。

另一因素就是保存溫度，甲狀旁腺在離體后理論上就形成了“熱缺血”損傷，借鑒其他器官移植研究，為了減少“熱缺血”損傷，通常將待移植器官保存在0～4 ℃灌注液中，因此本研究將離體甲狀旁腺保存在4 ℃生理鹽水中，30 min后，甲狀旁腺細胞形態(tài)未見明顯改變，電鏡下也只有少量線粒體腫脹、嵴斷裂；而在室溫保存30 min后，甲狀旁腺細胞開始腫脹、空泡變性增多，電鏡下細胞核變形、不規(guī)則，線粒體極度腫脹、減少。再者為體外臨時保存的時間，有研究在甲狀旁腺延時自體移植中證明保存時間是移植成功率的關(guān)鍵因素，同樣本實驗也觀察到甲狀旁腺組織在體外保存30 min后開始出現(xiàn)空泡變性，細胞核變形，細胞內(nèi)線粒體腫脹、嵴斷裂等細胞失活表現(xiàn)的改變。

甲狀旁腺作為內(nèi)分泌腺體，其作用就是分泌PTH，從而調(diào)節(jié)機體鈣、磷代謝，進行自體移植后體內(nèi)循環(huán)的血PTH、血鈣能間接地反映移植后功能恢復(fù)情況，而切除后的病理檢查更是直接、客觀地反映出細胞存活與否。從D、E、F 3組實驗結(jié)果：甲狀旁腺自體移植均存活，實驗動物血鈣、血PTH均在逐漸的上升恢復(fù)，術(shù)后第7天時，D組恢復(fù)最快，E組次之，F(xiàn)組最慢；病理結(jié)果:D、E組甲狀旁腺細胞均大量存活，而F組甲狀旁腺細胞部分健存于肌肉組織中?？梢钥闯觯翰煌捏w外保存方式對甲狀旁腺自體移植后的存活情況是有影響的。

甲狀腺手術(shù)中甲狀旁腺的自體移植是避免術(shù)后永久性甲狀旁腺功能減退的重要方法，術(shù)中甲狀旁腺體外臨時保存是移植過程中的重要環(huán)節(jié)，從實驗可以看出體外保存時間、溫度都是影響其活性的重要因素，那么在臨床工作中應(yīng)該盡量減少其在體外保存時間。因此,筆者建議對術(shù)中可疑甲狀旁腺組織務(wù)必及時送檢，同時聯(lián)系病理科做到優(yōu)先處理，在等待結(jié)果的過程中應(yīng)保存在4 ℃生理鹽水中，并盡量在30 min內(nèi)進行移植，最大程度地維持其細胞活性，對于術(shù)中明確是甲狀旁腺組織的可以不再經(jīng)病理確認，立即移植以提高自體移植的成活率。

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Study on the effect of temporary in vitro preservation of parathyroid on auto-transplantation during thyroid surgery*

SuYanjun,LiuBin,DiaoChang,ZhangJianming,QianJun,ChengRuochuan△

(DepartmentofThyroidSurgery,theFirstAffiliatedHospitalofKunmingMedicalUniversity,Kunming,Yunnan650032,China)

Objective To study the effect of temporary in vitro preservation of parathyroid on the activity of cells in the process of parathyroid auto-transplantation and function of postoperative in order to improve the survival rate of transplantation.Methods (1)Experimental rabbits for the study were randomly divided into three groups:group A,group B,group C,with 8 rabbits in each group.Then we remove the bilateral inferior parathyroid,in group A,the parathyroid glands were immediately formaldehyde-fixed;in group B and group C,the parathyroid glands were placed in normal saline in 4 ℃ and in room temperature (22-24 ℃) for 30 minutes respectively and then fixed;HE staining was performed on the left parathyroid glands to observe the morphology of the cells;Electron microscopic examination of the right parathyroid glands were performed to observe the ultrastructural changes of the cells.(2)Experimental rabbits were randomly divided into three groups:group D group E and group F,with 8 rabbits in each group,after total thyroidectomy,the double inferior parathyroid glands were took out,in group D,the parathyroid glands were immediately transplanted in bilateral anterior cervical muscles;in group E and group F,the parathyroid glands were placed in normal saline 4 ℃ and in room temperature (22-24 ℃) for 30 minutes respectively and then transplanted.All animals were monitored of serum calcium and PTH on preoperative 1 d and postoperative 1 d,3 d,5 d,7 d;the parathyroid was took out for HE staining to observed survival of parathyroid tissue and pathology damage when 7d after operation.Results (1)The normal parathyroid gland is mainly dominated by the chief cells,the nucleus of the chief cell was round and centered under electron microscope；there were no significant change in the morphology of parathyroid cells,and the mitochondria of the cells were slightly swollen under 4 ℃;but the parathyroid gland cells were slightly swollen and partially vacuole degeneration,the morphology of the nucleus was irregular,and the mitochondria were extremely swollen and deformed,and the ridge was broken under room temperature.(2)three groups of rabbits after transplantation of parathyroid,serum calcium and PTH decreased significantly,and increased gradually,there was significant difference on the 7th day after the operaion between the two groups (P<0.05);(3)in group D,the normal parathyroid cells densely distributed in the anterior cervical muscle tissue;in group E,A large number of parathyroid cells survived in muscle tissue,with some vacuolated;in group F,only part of healthy parathyroid cells scattered in the muscle.Conclusion Parathyroid should be preserved in 4 ℃ normal saline during the operation,and the transplant should be completed in 30 minutes as far as possible.

parathyroid glands;transplantation,autologous;animal experiment;in vitro preservation

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.08.008

云南省衛(wèi)生科技計劃項目(2016NS056)。 作者簡介：蘇艷軍(1980-)，講師，博士，主要從事甲狀腺、甲狀旁腺的基礎(chǔ)與臨床研究?！?/p>

，E-mail：cruochuan@foxmail.com。

R653

A

1671-8348(2017)08-1032-04

2016-10-18

2016-12-10)