章諾貝，陳 新

(南昌大學第二附屬醫(yī)院:1.消化科;2.核醫(yī)學科 330006)

論著·基礎研究

O-GlcNAc糖基化修飾和Akt1對胃癌細胞體外增殖及侵襲力的影響

章諾貝1，陳 新2△

(南昌大學第二附屬醫(yī)院:1.消化科;2.核醫(yī)學科 330006)

目的 探討O-連接N-乙酰氨基葡萄糖(O-GlcNAc)糖基化修飾對胃癌細胞體外增殖及侵襲力的影響，并評價Akt1在O-GlcNAc糖基化促進胃癌細胞體外增殖及侵襲過程中的作用。方法 通過使O-GlcNAc轉移酶(OGT)過表達(過表達OGT組)或沉默表達(沉默OGT組)及使用O-GlcNAc水解酶(OGA)特異性抑制劑Thiamet-G(抑制劑組)下調O-GlcNAc水解酶活性(抑制劑組)等構建O-GlcNAc糖基化水平升高或降低的細胞模型；采用MTT法檢測各組胃癌細胞增殖活力；軟瓊脂集落形成實驗觀察各組胃癌細胞集落形成；Transwell細胞遷移實驗各組胃癌細胞體外遷移和侵襲能力；蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測各組胃癌細胞Akt1活性；Thiamet-G處理Akt1表達沉默(沉默Akt1組)的胃癌細胞以評價Akt1在O-GlcNAc糖基化促進胃癌細胞侵襲中的作用；利用Thiamet-G處理Akt1過表達(過表達Akt1組)的胃癌細胞以進一步驗證Akt1在O-GlcNAc糖基化調控胃癌細胞侵襲性過程中的作用。結果 O-GlcNAc糖基化水平升高可促進胃癌細胞增殖并顯著提高細胞集落形成、體外遷移和侵襲的能力；Akt1活性被由O-GlcNAc糖基化水平升高所介導的Ser473磷酸化上調而激活；Thiamet-G誘導的細胞侵襲性被Akt1 shRNA所抑制；Akt1高表達可進一步促進由Thiamet-G誘導的細胞侵襲性增強。結論 O-GlcNAc糖基化可部分通過Akt1途徑增強胃癌細胞的體外增殖及侵襲力。

胃腫瘤；腫瘤侵潤；細胞增殖；O-GlcNAc糖基化；Akt1

O-連接N-乙酰氨基葡萄糖(O-Linked N-acetylglucosamine，O-GlcNAc)糖基化是細胞核與細胞質蛋白的絲氨酸和蘇氨酸殘基以O-GlcNAc修飾的一種高豐度可逆性翻譯后修飾方式，它被認為能夠調節(jié)細胞內蛋白質的功能及活性[1]。調控O-GlcNAc轉換的酶只有兩種：催化靶標蛋白分子添加GlcNAc基團的O-GlcNAc轉移酶(O-GlcNAc transferase，OGT)和去除蛋白質分子中糖基的O-GlcNAc水解酶(O-GlcNAcase，OGA)。O-GlcNAc糖基化廣泛參與多種細胞生物學進程，如轉錄、細胞生長、細胞增殖、細胞周期進程、細胞凋亡、信號轉導、代謝及細胞運動等[1]。

磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)家族通過參與多個信號通路從而調控細胞功能。PI3K活化產(chǎn)生的脂質產(chǎn)物3,4-二磷酸磷脂酰肌醇[PI(3,4)P2]和3,4,5-三磷酸磷脂酰肌醇[PI(3,4,5)P3]作為第2信使結合并激活細胞內的靶蛋白，形成信號級聯(lián)復合物，最終調控細胞的增殖、分化、生存和遷移[2]。Akt 是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是PI3K的下游分子。Akt至少有3個家族成員：Akt1、Akt2和Akt3，每個成員均在調節(jié)細胞功能中發(fā)揮各自的作用。PI3K/Akt信號通路在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要的作用[2]。

胃癌是最常見的癌癥之一，也是癌癥相關性死亡的最常見原因之一。在過去的幾十年中，其發(fā)病率、診斷方法和治療手段均已發(fā)生了重要變化，但胃癌患者的預后仍然很差，尤其是在發(fā)病晚期[3]。因此，有必要進一步探討與胃癌惡性程度相關的潛在機制。

為了確定O-GlcNAc糖基化是否參與調控胃癌的進展，筆者利用使胃癌細胞的OGT過表達、OGA抑制或OGT表達沉默等策略來改變O-GlcNAc糖基化水平，并對細胞增殖、遷移、侵襲等與惡性表型相關的細胞生物學功能進行檢測。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞 人胃癌細胞株AGS(ATCC CRL-1739TM，美國)，人胃癌細胞株SGC-7901(凱基生物技術有限公司，江蘇南京)，Phoenix2TM-Ampho包裝細胞(Allele生物技術公司，美國)。

1.1.2 試劑 10%胎牛血清(Wisent公司，加拿大)，RPMI-1640培養(yǎng)基(Gibco公司，美國)，F(xiàn)uGENE 6、蛋白酶抑制劑混合物Flag標記的人核/質OGT(ncOGT)表達載體pCMV-Flag-OGT(Sigma公司，美國)，脂質體LipofectamineTM2000、遺傳霉素(Invitrogen公司，美國)，攜帶豆蔻?；疕A-標記Akt1(MAH)的pLNCX逆轉錄病毒載體(Addgene公司，美國)，聚凝胺、Immobilon-P膜(Millipore公司，美國)，PUGNAc(研究化學用品公司，加拿大)，細胞裂解緩沖液(P0013，碧云天生物技術公司，江蘇)，O-GlcNAc單克隆抗體(RL2，親和生物試劑公司，美國)，Akt1單抗、磷酸化-Akt1單抗(細胞信號技術公司，美國)，OGT多克隆抗體α、GAPDH多抗(圣克魯斯公司，美國)，RevertAidTM第一鏈cDNA合成試劑盒(國際Fermentas公司，立陶宛)，Transwell小室(6.5 mm，Corning公司，美國)，基質膠(1 mg/mL；BD生物科學公司，美國)，總RNA提取試劑盒(A&A生物技術公司，波蘭)，電化學發(fā)光(ECL)檢測試劑盒(Amersham生物科學公司，英格蘭)，蛋白A磁珠(通用電氣醫(yī)療集團，美國)。

1.1.3 儀器 TaqMan?基因表達分析系統(tǒng)(應用生物系統(tǒng)公司，美國)，Rainbow酶標儀(Tecan公司，奧地利)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)和處理 人胃癌細胞株AGS和SGC-7901在含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。所有細胞都在飽和濕度的37 ℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細胞用5 μmol/L的Thiamet-G處理48 h或指定時間用于蛋白免疫印跡法(Western blot)或計數(shù)并傳代用于侵襲性試驗。

1.2.2 OGT或Akt1過表達細胞株的構建 Flag標記的人ncOGT表達載體pCMV-Flag-OGT，用于構建 OGT過表達細胞株(過表達OGT組)。使用脂質體LipofectamineTM2000按照制造商的說明書進行細胞轉染。攜帶豆蔻?；疕A-標記Akt1(MAH)的pLNCX逆轉錄病毒載體用于豆蔻?；疕A-標記Akt1過表達細胞株(過表達Akt1組)的構建。Phoenix2TM-Ampho包裝細胞被用作病毒載體。選用FuGENE 6作為MAH細胞的轉染試劑。胃癌細胞用含10 μg/mL聚凝胺的Phoenix2TM-Ampho包裝細胞的過濾培養(yǎng)基(病毒上清液)感染3次。選用遺傳霉素作為MAH細胞的選擇劑。

1.2.3 OGT或Akt1組RNA干擾細胞株的構建 將以人OGT mRNA編碼序列為靶標的小干擾RNA(siRNA)用于抑制AGS和SGC-7901細胞中OGT的表達(沉默OGT組)。shOGT靶向序列是5′-GGA TGC TTA TAT CAA TTT AGG-3′。用一段shRNA寡核苷酸作為對照，靶向序列為:5′-ACG TGA CAC GTT CGG AGA ATT-3′。設計靶向人Akt1 mRNA序列編碼區(qū)的siRNA并用于抑制AGS和SGC-7901細胞中Akt1的表達。靶向序列：干擾Akt1-1，5′-GCT ACT TCC TCC TCA AGA ACG-3′；干擾Akt1-2，5′-GGA CGG GCA CAT CAA GAT AAC-3′；對照為5′-ACG TGA CAC GTT CGG AGA ATT-3′。將合成的寡核苷酸退火并克隆到AgeⅠ/EcoRⅠ雙酶切的pLKO.1-puro慢病毒載體?；赑LKO.1-puro載體的慢病毒通過將△8.2和VSV-G質粒共轉染至HEK293T細胞包裝生成。被感染的細胞用8 μg/mL的嘌呤霉素選擇2周。

1.2.4 實時熒光定量PCR(RT-PCR) 用總RNA提取試劑盒按照制造商的說明書提取細胞總RNA。取1 μg細胞總RNA使用RevertAidTM第一鏈cDNA合成試劑盒按照試劑盒說明書逆轉錄獲得第一鏈cDNAs。使用TaqMan?基因表達分析系統(tǒng)按照制造商的說明書進行cDNA實時擴增。采用熒光FAM標記的探針及編碼Akt1和內參 GAPDH基因的序列特異性引物進行擴增。經(jīng)GAPDH表達水平歸一化的Akt1表達的倍數(shù)差異用公式2△△Ct進行計算。siRNA處理細胞的mRNA相對量以未經(jīng)處理細胞mRNA量的百分比表示。

1.2.5 細胞增殖實驗 用噻唑藍(MTT)染料轉化來評估細胞增殖。按1×104/孔將細胞接種至96孔板。讓細胞生長24或48 h后，每孔加入20 μL MTT(5 mg/mL的PBS溶液)。在37 ℃經(jīng)過4 h的孵育后，加入200 μL二甲基亞砜裂解細胞。使用Rainbow酶標儀測量570 nm吸光度(A)值。

1.2.6 集落形成能力試驗 將細胞5×103重懸于1 mL的頂層瓊脂培養(yǎng)基(添加0.4%瓊脂的細胞培養(yǎng)基)。然后將細胞懸液覆蓋到6孔板中1.5 mL底層瓊脂培養(yǎng)基 (添加0.8%瓊脂的細胞培養(yǎng)基)上，設置3個復孔。每4天向板中加入新鮮的培養(yǎng)基用作飼養(yǎng)層。2周后，在40倍光鏡下選擇6個視野進行集落計數(shù)。每個樣本進行3次獨立實驗。

1.2.7 細胞遷移和侵襲試驗 細胞遷移試驗用帶8 μm微孔膜的Transwell小室完成。將小室插入Transwell儀器。進行細胞侵襲試驗時，將小室用基質膠包被。下室用600 μL含或不含OGA抑制劑的細胞條件培養(yǎng)液填充。將細胞5×104用100 μL含1%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基重懸后置于有或無OGA抑制劑的上室。20 h后，在100倍光鏡下選取6個視野，對碳酸酯膜底面上出現(xiàn)結晶紫染色的細胞進行計數(shù)。侵襲試驗中的孵化時間延長至24 h。

1.2.8 Western blot分析 用含有蛋白酶抑制劑混合物和5 μmmol/L PUGNAc(一種OGA抑制劑)的細胞裂解緩沖液裂解細胞后獲取細胞總蛋白，用于Western blot分析和免疫沉淀。蛋白質樣品(50 μg)用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)在還原態(tài)下進行分離，并轉移至Immobilon-P膜。檢測用抗體有：O-GlcNAc單克隆抗體，Akt1單抗，磷酸化-Akt1單抗(Ser473)，HA-標記單抗，OGT多克隆抗體和GAPDH多抗；用ECL檢測試劑盒檢測。在免疫沉淀中，細胞裂解產(chǎn)物與特異性抗體和蛋白A磁珠在4 ℃輕柔混合3 h。免疫沉淀物用裂解緩沖液清洗，用SDS樣品緩沖液洗脫，之后用SDS-PAGE分離。檢測磷酸化Akt1時，細胞裂解物中的Akt1蛋白用Akt1抗體免疫沉淀。

2 結 果

2.1 胃癌細胞株的O-GlcNAc糖基化水平被升高或降低 為了探討O-GlcNAc糖基化是否對胃癌惡性程度具有重要的作用，以過表達OGT或抑制OGA(5 μmmol/L Thiamet-G處理，抑制劑組)來提高胃癌細胞株AGS和SGC-7901的O-GlcNAc糖基化水平，并通過沉默OGT表達來降低O-GlcNAc糖基化水平。(1)與未經(jīng)任何處理的AGS和SGC-7901細胞(對照組)相比，過表達OGT組與經(jīng)Thiamet-G處理(抑制劑組)，在24 h后，O-GlcNAc糖基化水平有效升高。(2)與對照組相比，感染CGT siRNA的沉默OGT組AGS和SGC-7901細胞中OGT蛋白表達和O-GlcNAc糖基化水平均顯著降低，見圖1。

A：AGS細胞;B:SGC-7901。

圖1 OGT過表達和OGA受抑制或沉默

OGT表達O-GlcNAc修飾水平降低

2.2 O-GlcNAc糖基化促進胃癌細胞的增殖活力 各組細胞相應處理24 h和48 h后，用MTT法檢測細胞增殖率。結果表明，與對照組細胞相比，處理24 h的胃癌細胞株AGS和SGC-7901的增殖率受O-GlcNAc糖基化的影響并不明顯。然而，48 h后與對照組細胞相比，過表達OGT組、抑制劑組AGS和SGC-7901細胞株增殖率分別增加約45%、22%和44%、27%。相反，沉默OGT組兩種細胞的增殖率分別降低約34%和25%，見圖2。

2.3 O-GlcNAc糖基化增強胃癌細胞集落形成能力 軟瓊脂集落試驗表明，與對照組細胞相比，兩種細胞中抑制劑組細胞集落形成能力增加；同時，與對照組細胞相比，沉默OGT組細胞集落形成能力降低，見圖3。

A：AGS細胞;B:SGC-7901細胞;a:P<0.05；b:P<0.01，與對照組比較。

圖2 O-GlcNAc修飾可促進胃癌細胞增殖

2.4 O-GlcNAc糖基化促進胃癌細胞遷移 遷移試驗顯示，與對照組細胞相比，過表達OGT組和抑制劑組細胞遷移能力增加，而沉默OGT組細胞的遷移能力明顯抑制，見圖4。

2.5 O-GlcNAc糖基化增強胃癌細胞侵襲性 O-GlcNAc糖基化在胃癌細胞轉移中的作用也通過24 h體外侵襲試驗進行檢測。結果表明，與對照組細胞相比，過表達OGT和抑制劑組的侵襲性增強，相反，沉默OGT組細胞侵襲性明顯受抑制，見圖5。

a:P<0.01，與對照組比較。

圖3 O-GlcNAc糖基化可增強胃癌細胞集落形成能力

a:P<0.01，與對照組比較。

圖4 O-GlcNAc糖基化可促進胃癌細胞體外遷移

a:P<0.01，與對照組比較。

圖5 O-GlcNAc糖基化可促進胃癌細胞體外侵襲性

2.6 上調O-GlcNAc糖基化會提高Akt1 Ser473位點磷酸化水平 與對照組細胞相比，抑制劑組細胞Akt1 Ser473位點磷酸化水平增加(AGS:t=2.764，P=0.031；SGC-7901：t=2.586,P=0.027)，沉默OGT組細胞的Ser473位點磷酸化水平降低(AGS:t=2.694，P=0.029；SGC-7901：t=2.766,P=0.027)，見圖6。

A：AGS細胞;B:SGC-7901細胞。

圖6 O-GlcNAc糖基化對胃癌細胞侵襲性

的調控與PI3K/Akt1信號通路有關

2.7 胃癌細胞中Akt1蛋白的沉默 為了評價Akt1在O-GlcNAc糖基化調控胃癌細胞侵襲性中的作用，本研究用兩個siRNA (干擾Akt1-1和干擾Alt1-2)下調AGS和SGC-7901細胞株中Akt1的表達水平。對照細胞則轉染非沉默亂序RNA(Ctrl組)。用實時RT-PCR和Western blot分析評估RNAi的沉默效果。兩個siRNA均可明顯降低Akt1 mRNA水平和蛋白表達水平(圖7)。然而，與siAkt1-1比較，siAkt1-2在降低Akt1水平上更為有效，因此其被選擇用于后續(xù)實驗(沉默Akt1組)。

A：Akt1 mRNA分析圖；B：Akt1 Western blot圖。

圖7 siRNA沉默胃癌細胞Akt1基因的表達

2.8 Akt1沉默可阻斷O-GlcNAc糖基化對胃癌細胞侵襲性的促進作用 Akt1表達沉默的AGS細胞株用5 μmol/L Thiamet-G處理以評估Akt1對O-GlcNAc糖基化增強胃癌細胞侵襲性的影響。結果表明，Akt1表達沉默可顯著減弱由Thiamet-G處理所誘導的細胞侵襲性，但其侵襲性仍然高于僅轉染Akt1 shRNA的細胞。換言之，Thiamet-G能恢復Akt1表達沉默胃癌細胞的侵襲性，但仍相對低于僅被Thiamet-G處理的細胞而又相對高于對照組細胞(圖8C、D)。Western blot分析(圖8B)結果顯示了Akt1蛋白水平及其 Ser473位點磷酸化水平。在SGC-7901細胞株也得到了類似結果(圖8B)。

2.9 Akt信號通路激活可增強O-GlcNAc糖基化對胃癌細胞侵襲性作用 為進一步驗證Akt1在O-GlcNAc糖基化調控胃癌細胞侵襲性過程中的作用，筆者向AGS和SGC-7901細胞株轉染攜帶HA-標記豆蔻酰化Akt1(MAH組)的表達載體。發(fā)現(xiàn)相對于對照組細胞，MAH組細胞株顯示出高水平的Akt1表達(圖9A)。將MAH細胞用5 μmol/L Thiamet-G處理后檢測其侵襲性，結果表明，Akt1過表達可進一步增強由Thiamet-G所誘導的細胞侵襲性(圖9B)，此結果進一步支持了上述關于Akt1與O-GlcNAc糖基化一齊促進胃癌細胞侵襲性相關的結論。

A：AGS細胞侵襲性試驗分析圖；B：AGS細胞Western blot；C:Western blot分析圖；a:P<0.05,b:P<0.01。

圖8 沉默Akt1基因表達可阻遏O-GlcNAc糖基化對胃癌細胞侵襲性的促進作用

A：Western blot；B：Western blot分析圖。a：P<0.05,b：P<0.01。

圖9 促進Akt1基因表達可增強O-GlcNAc糖基化對胃癌細胞侵襲性的促進作用

3 討 論

胃癌在最常見惡性腫瘤類型中排第4位，而且是最常見的癌癥死亡原因之一。盡管早期胃癌的臨床治療已經(jīng)取得了重大成效，但晚期胃癌患者的長期存活率仍然相當有限。晚期或轉移性胃癌的5年生存率是僅為5%～20%，中位生存期少于1年[4]。因此，調控胃癌發(fā)生、發(fā)展的確切分子機制有待進一步探索。

研究發(fā)現(xiàn)，O-GlcNAc糖基化在多種人類癌癥的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮關鍵作用。許多原癌基因和抑癌基因如c-Fos、c-Jun、c-Myc、pRB和p53均被 O-GlcNAc修飾[5]。Gu等[6]發(fā)現(xiàn)，O-GlcNAc和OGT蛋白表達水平在高轉移性乳腺癌細胞系中顯著升高；此外，Mi等[7]也指出，乳腺腫瘤組織中O-GlcNAc表達水平明顯高于與之配對的相鄰組織。以上研究結果提示，高O-GlcNAc糖基化水平可能參與乳腺腫瘤的發(fā)生發(fā)展。另外，還有報道指出，O-GlcNAc與胰腺癌、前列腺癌、卵巢癌惡性程度的調控相關[8-10]。綜上所述，O-GlcNAc糖基化對腫瘤的發(fā)生發(fā)展起到了關鍵的調控作用。

然而，O-GlcNAc糖基化同胃癌的關系目前尚不清楚。在本研究中，筆者分析了O-GlcNAc糖基化在胃癌發(fā)生、發(fā)展中的作用。本研究結果表明，O-GlcNAc糖基化通過促進體外細胞增殖、錨定非依賴性生長、遷移和侵襲進而增強胃癌惡性程度。不過，胃癌細胞的增殖在O-GlcNAc糖基化水平升高或降低處理24 h并未受到顯著影響(圖2)，而細胞的遷移能力和侵襲性在O-GlcNAc糖基化升高或降低處理24 h卻均被促進或抑制，這提示細胞遷移能力和侵襲性受O-GlcNAc糖基化的調控可能并不依賴于其對細胞活力的影響。而在處理48 h后，O-GlcNAc糖基化則表現(xiàn)出對細胞增殖的調控作用。這些結果提示，O-GlcNAc糖基化水平升高可能會啟動和促進胃癌的形成和轉移。并且，一系列有關O-GlcNAc糖基化在腫瘤發(fā)展中作用的研究均支持了本研究結果[5-11]。

作為一種應激傳感器，O-GlcNAc糖基化水平在受不同應激作用的多種哺乳動物細胞株中出現(xiàn)迅速且動態(tài)性升高，細胞借此重建其代謝和信號途徑以促進生存[12]。腫瘤細胞的異常代謝或生長由多種形式的刺激和應激作用引起，它們包括活性氧、細胞外基質成分、基底膜、營養(yǎng)缺乏、缺氧和免疫系統(tǒng)攻擊。O-GlcNAc糖基化可通過增強FOXO4轉錄活性從而保護細胞免受氧化應激損傷[13]。此外，通過降低OGT表達水平或阻斷己糖胺生物合成途徑(hexosamine biosynthetic pathway,HBP)來降低 O-GlcNAc糖基化能夠使細胞對凋亡刺激更加敏感[12]。因此，O-GlcNAc糖基化水平升高也可能有利于胃癌細胞抵抗凋亡刺激，從而加速腫瘤的形成和發(fā)展。

PI3K/Akt信號通路可通過多種途徑傳遞侵襲和轉移信號并且還參與多種因素介導的腫瘤血管生成過程。PI3K通過與E-鈣黏蛋白、β-連環(huán)蛋白及血管內皮生長因子受體2(VEGFR-2)相互作用從而參與血管內皮生長因子(VEGF)介導的內皮細胞信號，進而激活PI3K/Akt通路；此外，VEGFR-2和αVβ3復合體也可通過PI3K依賴信號通路介導內皮細胞的黏附和遷移[14]；PI3K/Akt還能夠通過促進由腫瘤壞死因子誘導的內皮細胞遷移從而調節(jié)腫瘤血管生成[15]。有報道指出，O-GlcNAc糖基化的上調會通過增加Akt1活性從而促進甲狀腺未分化癌細胞的增殖[16]。本研究發(fā)現(xiàn)O-GlcNAc糖基化能提高胃癌細胞的侵襲性。Akt1表達沉默可減弱由Thiamet-G所誘導的細胞侵襲性，但其侵襲性仍然僅高于Akt1表達沉默的細胞(圖8A、C)。此外，Akt1過表達還能夠增強由Thiamet-G所誘導的細胞侵襲性。以上結果提示，O-GlcNAc糖基化可部分經(jīng)Akt1調節(jié)胃癌細胞侵襲性，不過，還可能有其他信號通路或蛋白質參與該調控過程。細胞表面E-鈣黏蛋白的減少和細胞黏附的減弱可能是 O-GlcNAc糖基化誘導乳腺癌轉移的潛在分子機制[7]。肌動蛋白結合蛋白-人肌動蛋白素(cofilin)在OGT的作用下發(fā)生O-GlcNAc糖基化，并在由OGT調控的細胞遷移過程中發(fā)揮關鍵的介導作用[17]。在乳腺癌細胞三維細胞侵襲過程中，cofilin的Ser-108位點的O-GlcNAc糖基化是其正確定位于乳腺癌細胞前緣侵襲性偽足的必要條件[17]。近年來，越來越多的證據(jù)表明，O-GlcNAc糖基化的靶標蛋白和O-GlcNAc調節(jié)的信號通路與腫瘤發(fā)生、發(fā)展有關[8-11]。因此，有必要進一步深入研究以更好地理解由 O-GlcNAc糖基化誘導的胃癌侵襲的潛在機制。此外，Akt至少包括3個家族成員:Akt1、Akt2和Akt3，每個成員在調節(jié)細胞功能中均發(fā)揮各自作用。除Akt1外，其他Akt家族成員的活性變化對O-GlcNAc糖基化調控細胞惡性的影響仍有待闡明。

總之，本研究提供的以上證據(jù)表明，O-GlcNAc糖基化能夠影響胃癌的惡性程度。顯然，理解異常O-GlcNAc糖基化與腫瘤生物學行為之間的明確關系必將有利于癌癥的診斷和治療。

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Effects of O-GlcNAcylation modification and Akt1 on proliferation and invasion of gastric cancer cells

ZhangNuobei1，ChenXin2△

(1.DepartmentofGastroenterology;2.DepartmentofNuclearMedicine,theSecondAffiliatedHospitalofNanchangUniversity,Nanchang,Jiangxi330006,China)

Objective To study the influence of O-GlcNAcylation on on proliferation and invasion of gastric cancer cells and evaluate the role of Akt1 on O-GlcNAcylation promotting cells proliferation and invasion in gastric cancer.Methods Build the cell model:O-GlcNAc glycosylation levels rise or fall.The cell viability was determine by MTT.To investigate whether O-GlcNAcylation affected colony formation ability of gastric cancer cells,soft agar colony assays were carried out.Cell migration or invasion was using transwell chambers.The expression of Akt1 was detected through Western blot.Thiamet-G was used to eualuate the role of Akt1 on O-Gcnac cylation regulating invasion in gastric Cancei.Results O-GlcNAcylation was increased the gastric cancer cells proliferation ability,colony formation ability,migration and invasion ability in vitro.Akt1 was activated by Ser473 phosphorylation upregulation though O-GlcNAcylation.Akt1 shRNA was inhibition the cell invasive which induced by Thiamet-G.Akt1 overexpression was promoted by Thiamet-G-induced cell invasion.Conclusion O-GlcNAcylation enhanced oncogenic phenotypes possibly partially involving Akt1.

stomach neoplasms;neoplasm invasiveness;cell proliferation;O-GlcNAcylation;Akt1

章諾貝(1982-)，副主任醫(yī)師，碩士，主要從事消化系腫瘤基因治療研究?！?/p>

，E-mail:13870979404@163.com。

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.08.007

R735.7

A

1671-8348(2017)08-1027-05

2016-10-22

2016-12-20)