姜 朕，李衛(wèi)華，朱 峰，魏海燕，齊共健

(江蘇省徐州市兒童醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科 221006)

·論 著·

5歲以下喘息患兒哮喘預(yù)測指數(shù)與外周血單核細(xì)胞TLR4表達(dá)的相關(guān)性研究

姜 朕，李衛(wèi)華△，朱 峰，魏海燕，齊共健

(江蘇省徐州市兒童醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科 221006)

目的 探討5歲以下喘息患兒外周血單核細(xì)胞(PBMCs)表面Toll 樣受體4(TLR4)及血清白細(xì)胞介素6(IL-6)的表達(dá)。方法 選取該院門診或住院患兒共224例，其中哮喘預(yù)測指數(shù)(API)陽性組116例，陰性組108例。兩組患兒均在喘息癥狀緩解1個月后分別抽取外周血，流式細(xì)胞儀檢測PBMCs TLR4陽性率，酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測血清IL-6水平。結(jié)果 API陽性組患兒CD14+單核細(xì)胞表面TLR4陽性率明顯高于API陰性組[(34.9±10.0)%vs.(30.2±8.8)%]；API陽性組患兒血清IL-6水平明顯高于API陰性組[(46.4±15.1)ng/Lvs.(40.5±13.6)ng/L]；且兩組TLR4陽性率和IL-6水平均呈線性相關(guān)(P<0.05)。結(jié)論 TLR4的激活誘導(dǎo)IL-6等細(xì)胞因子表達(dá)可能和哮喘的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，TLR4可能可以作為喘息發(fā)展為哮喘的預(yù)測指標(biāo)。

Toll樣受體4；白細(xì)胞介素6；哮喘

喘息是嬰幼兒的一種常見癥狀，過敏性哮喘是其中的一種重要表型。從喘息患兒中把可能發(fā)展為持續(xù)性哮喘的患兒識別出來進(jìn)行早期干預(yù)是必要的。然而，由于缺乏特異性的檢測指標(biāo)，很難做到早期識別。哮喘預(yù)測指數(shù)(asthma predictive index,API)是一種較好的預(yù)測嬰幼兒哮喘的指標(biāo)[1-2]，目前認(rèn)為API陽性的嬰幼兒需按哮喘規(guī)范化治療。Toll樣受體4(Toll-like receptor 4,TLR4)是參與非特異性免疫(天然免疫)的一類重要蛋白質(zhì)分子，也是連接非特異性免疫和特異性免疫的橋梁。研究表明，哮喘與TLR4關(guān)系密切，但其與API的關(guān)系尚不明確[3]。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇 2014 年 6月至 2015 年 5月在本院門診就診和住院治療的 5 歲以下喘息患兒 224例。根據(jù)2008年兒童支氣管哮喘診斷與防治指南中API 標(biāo)準(zhǔn)[4]分為API陽性組(116例)與API陰性組(108例)。兩組患兒在月齡、性別、病程等一般情況方面差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

1.2 方法

1.2.1 CD14+單核細(xì)胞表面TLR4表達(dá)檢測 兩組喘息患兒均在喘息癥狀緩解1個月后采集外周靜脈血10 mL。測定外周血CD14+單核細(xì)胞TLR4的表達(dá)。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道采用流式細(xì)胞儀檢測CD14+單核細(xì)胞表面TLR4的表達(dá)[5]。FACS VantageSE流式細(xì)胞儀購自美國BD公司；FITC anti-human CD14+抗體、PE anti-human CD284(TLR4)抗體購自美國Biolegend公司。

表1 兩組患兒一般情況

1.2.2 血清白細(xì)胞介素6(IL-6)水平檢測 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法(ELISA)檢測血清IL-6水平，人IL-6 ELISA試劑盒購自加拿大HCB公司。

2 結(jié) 果

2.1 兩組患兒CD14+單核細(xì)胞表面TLR4及血清IL-6的表達(dá) API陽性組患兒CD14+單核細(xì)胞表面TLR4陽性率明顯高于API陰性組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。API陽性組患兒血清IL-6水平明顯高于API陰性組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 兩組患兒TLR4及IL-6的表達(dá)

2.2 PBMCs TLR4表達(dá)水平與血清IL-6水平線性相關(guān)分析 經(jīng)線性相關(guān)分析表明，在API陰性組及API陽性組患兒TLR4陽性率水平與血清IL-6表達(dá)水平均呈正相關(guān)(圖1)，API陽性組相關(guān)系數(shù)r=0.861，P<0.05；API陰性組相關(guān)系數(shù)r=0.901，P<0.05。

圖1 兩組患兒PBMCs表面TLR4表達(dá) 和血清IL-6水平散點(diǎn)圖

3 討 論

目前，嬰幼兒喘息主要有3種表型[4]：(1)早期一過性喘息，表現(xiàn)為在3歲前有1次以上的喘息，到3歲后就無喘息癥狀，其喘息的機(jī)制可能是由環(huán)境因素導(dǎo)致肺發(fā)育延遲所致，個體過敏證據(jù)較少。(2)早期起病的持續(xù)性喘息(3歲前起病)，主要表現(xiàn)為與急性呼吸道病毒感染相關(guān)的反復(fù)喘息。(3)遲發(fā)性喘息/哮喘，即真正意義上的支氣管哮喘，患兒有典型的特應(yīng)性背景，哮喘癥狀常遷延至成人期，氣道有典型的哮喘病理特征。從喘息的嬰幼兒中把可能發(fā)展為哮喘的患兒識別出來存在一定的困難，這也是目前的一大研究熱點(diǎn)。Castro-Rodíguez等[6]于2000年提出哮喘API的概念，其能有效地預(yù)測3歲內(nèi)喘息兒意發(fā)展為持續(xù)性哮喘的危險(xiǎn)性，它的應(yīng)用價值日益受到重視。

在哮喘的發(fā)病機(jī)制方面，TLR4在哮喘中的生物學(xué)作用越來越受到人們的重視。TLR4是Toll樣受體家族成員之一。其作為一種模式識別受體，在抗感染與免疫信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中起重要作用。當(dāng)脂多糖等配體與TLR4結(jié)合后，通過髓樣分化因子88(MyD88)介導(dǎo)下游的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，激活A(yù)P-1、NF-κB 和IRF3等轉(zhuǎn)錄因子，誘導(dǎo)促炎性細(xì)胞因子(如IL-6 和TNF-α等)和趨化性細(xì)胞因子(如IL-8)等多種細(xì)胞因子的表達(dá)，啟動炎癥和適應(yīng)性免疫應(yīng)答[7]。研究表明，TLR4信號通路的激活可以引起局部慢性炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激等增加，從而導(dǎo)致哮喘、代謝綜合征、糖尿病等疾病的發(fā)生[8]。大量的研究表明，TLR4基因多態(tài)性和哮喘的發(fā)生及嚴(yán)重程度相關(guān)。TLR4 rs1927907基因多態(tài)性和CD4+T細(xì)胞表面TLR4的表達(dá)量及哮喘的嚴(yán)重程度相關(guān)[9]。2015年11月4日在美國公共衛(wèi)生協(xié)會會議中，Bravo 等[10]報(bào)道了1項(xiàng)研究前瞻性研究，該研究選取了1 823名志愿者，研究了基因多態(tài)性和居住環(huán)境的關(guān)系，研究表明，高應(yīng)答者(攜帶CD14、TNF-α和野生型 TLR4、TIRAP基因)較低應(yīng)答者(攜帶TLR4、TIRAP 和野生型CD14、TNF-α基因)更容易的哮喘；白人較黑人或非洲裔美國人更容易的哮喘；居住地離馬路較近(<250 m)的人群中，高應(yīng)答者較低應(yīng)答者更易得哮喘。Lee等[3]觀察了7 389名中學(xué)生發(fā)現(xiàn)抗生素暴露及毛細(xì)支氣管炎病史是哮喘的危險(xiǎn)因素，TLR4 rs1927911多態(tài)性可以減輕這種遺傳易感性。Kim等[11]研究發(fā)現(xiàn)，房塵螨可以通過TLR4/PKCδ/ERK/NF-κB信號通路抑制中性粒細(xì)胞凋亡，促進(jìn)IL-6、IL-8、TNF-α、G-CSF、GM-CSF等炎癥因子的表達(dá)，從而介導(dǎo)過敏性鼻炎、哮喘等的發(fā)生。Liu等[12]研究表明，房塵螨可以同時激活TLR2和TLR4受體，調(diào)整肺泡巨噬細(xì)胞激活模式，導(dǎo)致Th2為主導(dǎo)的優(yōu)勢免疫，從而介導(dǎo)了哮喘的發(fā)生。Th1/Th2亞群數(shù)目和功能失衡是哮喘重要的免疫學(xué)特征。近期研究發(fā)現(xiàn)，哮喘不僅與Th1/Th2細(xì)胞功能失調(diào)相關(guān)，還與Th17細(xì)胞的激活有著重要關(guān)系[13]?；罨腡h17細(xì)胞可以進(jìn)一步激活平滑肌細(xì)胞、支氣管纖維母細(xì)胞及上皮細(xì)胞，促使它們分泌IL-6等多種細(xì)胞因子，導(dǎo)致氣道局部慢性炎癥反應(yīng)[14]。而誘導(dǎo)Th17細(xì)胞分化的關(guān)鍵細(xì)胞因子就是IL-6[15]。研究表明，IL-6水平和哮喘的嚴(yán)重程度及肺功能密切相關(guān)[16]。IL-6與TLR4可以相互影響，在哮喘的發(fā)病及進(jìn)展中起重要作用[17]。

目前，TLR4和喘息的關(guān)系方面的研究較少，本研究觀察了API陽性組與陰性組PBMCs TLR4陽性率及血清IL-6水平。研究表明，API陽性組PBMCs TLR4陽性率及血清IL-6明顯高于API陰性組，且兩組TLR4陽性率和IL-6水平呈正相關(guān)，提示部分喘息患兒通過TLR4的激活產(chǎn)生IL-6等炎癥因子，誘發(fā)哮喘的發(fā)生、發(fā)展。TLR4可能成為預(yù)防喘息患者發(fā)展為哮喘的重要干預(yù)靶點(diǎn)。另外，喘息患者中可以通過檢測患者PBMCs TLR4陽性率及相關(guān)炎癥因子水平預(yù)測哮喘的發(fā)生，從而早期干預(yù)，但仍需要大規(guī)模臨床試驗(yàn)的證實(shí)。

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Correlation between Toll-like receptor 4 in peripheral blood monocytes and asthm predictive index in wheezing children under 5 years of age

JiangZhen,LiWeihua△,ZhuFeng,WeiHaiyan,QiGongjian

(DepartmentofIntensiveCareUnit,XuZhouChildren′sHospital,XuZhou,Jiangsu221006,China)

Objective To study the expression of Toll-like receptor 4(TLR4) in peripheral blood mononuclear cell (PBMCs) and serum interleukin-6(IL-6) in wheezing children under 5 years of age.Methods A total of 224 wheezing children under 5 years of age were divided into API(asthma predictive index)-positive (n=116) and API-negative groups (n=108).Serum level of IL-6 and TLR4 expression on CD14+monocytes were measured after wheezing was stable for one month.TLR4 expression on CD14+monoeytes was quantified via flow-cytometry.Serum level of IL-6 was detected by ELISA.Results Serum level of IL-6 and TLR4 expression on CD14+monocytes of API-positive group were higher than API-negative group [LR4(%):34.9±10.0vs. 30.2±8.8;IL-6(ng/L):46.4±15.1vs. 40.5±13.6].There was a significant positive correlation between the expression of TLR4 and the content of serum IL-6 in two groups of wheezing children(P<0.05).Conclusion TLR4 may play a role in the pathogenesis of asthma through promoting the expression of IL-6.TLR4 may be a index to predicting asthma in wheezing children.

Toll-like receptor 4;interleukin-6;asthma

姜朕(1981-)，副主任醫(yī)師，本科，主要從事兒童危重癥研究工作?！?/p>

，E-mail:13685177688@163.com。

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.08.002

R725.6

A

1671-8348(2017)08-1012-03

2016-09-28

2016-12-16)