蘇敦，劉松玲，馬雨璇，王雅男，葛紹陽，任發(fā)政，楊子彪，母智深

(1.內(nèi)蒙古蒙牛乳業(yè)（集團(tuán)）股份有限公司，呼和浩特 011500；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京市高等學(xué)校畜產(chǎn)品工程研究中心，北京 100083；3.大理農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院大理 671003)

復(fù)合發(fā)酵菌株對乳中碳源利用能力的分析及菌株間互作關(guān)系預(yù)測

蘇敦1,2，劉松玲2，馬雨璇2，王雅男2，葛紹陽2，任發(fā)政2，楊子彪3，母智深1

(1.內(nèi)蒙古蒙牛乳業(yè)（集團(tuán)）股份有限公司，呼和浩特 011500；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京市高等學(xué)校畜產(chǎn)品工程研究中心，北京 100083；3.大理農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院大理 671003)

發(fā)酵乳制品具有風(fēng)味、營養(yǎng)、功能等特性上的優(yōu)勢，在乳制品消費中比例逐年上升。本研究以菌株間碳源間的互作為中心，分析了傳統(tǒng)酸奶發(fā)酵劑菌株利用碳源的能力及在不同碳源中的生長特性，對菌株間的相互作用進(jìn)行分析預(yù)測。研究發(fā)現(xiàn)：所有菌株均能利用葡萄糖，嗜熱鏈球菌C4和C1-2能利用乳糖，干酪乳桿菌CM1和嗜熱鏈球菌C4能利用半乳糖；通過分析菌株在不同碳源中的生長速率及遲滯期，發(fā)現(xiàn)嗜熱鏈球菌C4在乳糖中的遲滯期最短（1.30±0.02），其降解乳糖產(chǎn)生的葡萄糖和半乳糖供干酪乳桿菌CM1生長（2.84±0.16），隨后嗜熱鏈球菌C1-2利用乳糖生長（2.89±0.22）。在此發(fā)酵劑菌株中C4菌株為發(fā)酵產(chǎn)酸的關(guān)鍵菌株，其快速產(chǎn)酸能力促進(jìn)產(chǎn)品的凝乳，其降解乳糖產(chǎn)生葡萄糖和半乳糖供其他菌株生長；干酪乳桿菌CM1快速利用半乳糖和葡萄糖的能力可進(jìn)一步促進(jìn)產(chǎn)品的凝乳；產(chǎn)酸較慢的嗜熱鏈球菌C1-2是一株產(chǎn)黏的菌，能促進(jìn)酸奶組織狀態(tài)和良好質(zhì)地的形成。本研究對菌株利用碳源能力的分析為復(fù)合發(fā)酵劑的開發(fā)提供了有效數(shù)據(jù)。

發(fā)酵劑；發(fā)酵乳；嗜熱鏈球菌；干酪乳桿菌

發(fā)酵乳制品具有風(fēng)味、營養(yǎng)、功能等特性上的優(yōu)勢，在乳制品消費中比例逐步上升，具有廣闊的市場前景。發(fā)酵劑在發(fā)酵乳的生產(chǎn)過程中起重要作用，對發(fā)酵乳風(fēng)味、質(zhì)構(gòu)等具有關(guān)鍵影響。但是目前為止，國內(nèi)發(fā)酵乳生產(chǎn)所用的發(fā)酵劑多數(shù)依賴于進(jìn)口，國內(nèi)發(fā)酵劑研發(fā)與生產(chǎn)水平均處于較低水平。

發(fā)酵劑菌株是決定發(fā)酵劑質(zhì)量的重要因素。其特性包括∶ 迅速產(chǎn)酸的能力，形成穩(wěn)定平衡的風(fēng)味及良好的質(zhì)地能力。為了達(dá)到發(fā)酵劑的各種要求，目前成功應(yīng)用的發(fā)酵劑多為多菌株復(fù)配。優(yōu)良的復(fù)配發(fā)酵劑在發(fā)酵過程中形成穩(wěn)定的微生態(tài)體系，各菌株之間通過競爭、互利共生、偏利共生、拮抗和寄生等關(guān)系，達(dá)到產(chǎn)品性能穩(wěn)定，風(fēng)味、質(zhì)地優(yōu)良的目的[1,2]。因此發(fā)酵劑菌株之間互作關(guān)系的研究得到了廣泛的開展，并取得了大量的成果[3～5]。

乳中的乳糖是發(fā)酵劑在發(fā)酵過程中的主要碳源，菌株對乳糖及組成乳糖的單糖半乳糖、葡萄糖的降解及利用能力直接影響菌株間的互作關(guān)系及發(fā)酵劑的性質(zhì)。大量的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，常用發(fā)酵劑菌株如保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌、乳酸乳球菌、干酪乳桿菌、鼠李糖乳桿菌等對乳糖、半乳糖及葡萄糖的利用能力具有菌種及菌株之間的差異[6～9]。對這些菌株利用乳源碳源的能力分析將為發(fā)酵劑的復(fù)配提供理論支持。

除了成功應(yīng)用的復(fù)合發(fā)酵劑以外，自然發(fā)酵乳制品的發(fā)酵劑更為穩(wěn)定，應(yīng)用更為成功的復(fù)合發(fā)酵劑，對其中菌株互作關(guān)系的分析將為優(yōu)良商業(yè)發(fā)酵劑的開發(fā)提供新的思路。本研究從內(nèi)蒙傳統(tǒng)酸奶中成功分離到不同發(fā)酵特性的5株乳酸菌，對5株乳酸菌利用乳糖、半乳糖及葡萄糖的能力進(jìn)行分析，為開發(fā)優(yōu)良復(fù)合發(fā)酵劑提供有效數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品

樣品采自內(nèi)蒙古自治區(qū)錫林郭勒盟東烏旗牧區(qū)的牧民家。

1.1.2 設(shè)備及儀器

ME2002電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；連續(xù)可調(diào)移液器，德國Eppendorf公司；ZDX35BI自動高壓蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；DK-98-II2KW潔凈工作臺，天津泰斯特儀器公司；UF/ UVPL5124超純水儀，美國Pall公司；DNP-9082電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海精宏實驗設(shè)備有限公司；ELx808全自動酶標(biāo)儀，美國BioTek儀器有限公司。

1.1.3 試劑

MRS液體培養(yǎng)基：蛋白胨10g，牛肉膏8g，酵母膏4g，葡萄糖18g，吐溫801g，磷酸氫二鉀2g，乙酸鈉5g，檸檬酸三銨2g，MgSO4·7H2O 0.2g，MnSO4·4H2O 0.058g，蒸餾水1000mL，調(diào)至pH7.0±0.2，121℃滅菌15min。

M17培養(yǎng)基：大豆胨5g，蛋白胨2.5g，酪蛋白胨2.5g，酵母浸粉2.5g，牛肉浸粉5g，乳糖5g，抗壞血酸鈉0.5g，β-甘油磷酸鈉19g，MgSO4·7H2O 0.25g，蒸餾水1 000mL，調(diào)至pH 7.0±0.2，121℃滅菌15min。

半合成培養(yǎng)基[10]：碳源（葡萄糖、半乳糖、乳糖）添加量0.1mol/L，細(xì)菌蛋白胨10g，酵母浸粉5g，磷酸氧二鉀2g，乙酸鈉5g，檸檬酸氫二胺2g， MnSO4·4H2O 0.25g，MgSO4·7H2O 0.58g，吐溫-80 1g，CyS-HCl 0.5g，蒸餾水1 000mL，調(diào)至pH 7.0±0.2，121℃滅菌15min。

1.2 方法

1.2.1 菌株分離

以無菌操作吸取樣品1mL于9mL無菌生理鹽水中，呈1∶10的稀釋液，選擇合適的稀釋度。吸取0.2mL的稀釋液，涂布于MRS、改良M17培養(yǎng)基固體平板。分別于37℃、43℃培養(yǎng)48h，觀察菌落生長情況，挑取典型單菌落，并對單菌落進(jìn)行革蘭氏染色，挑取革蘭氏陽性菌作為初步目的菌株，轉(zhuǎn)接至MRS和改良M17平板純化，4℃保存。

1.2.2 菌種純化

無菌條件下，挑取MRS和改良M17平板上呈革蘭氏陽性的菌落，在相應(yīng)的平板上劃線分離，在選定的溫度下倒置培養(yǎng)48h，挑取單菌落進(jìn)行鏡檢，直至確定所得的菌株已經(jīng)純化，作為試驗菌株。

1.2.3 菌株DNA的提取

取1mL培養(yǎng)至對數(shù)生長末期的菌液，室溫下10 000 r/min離心3min。加入200μL溶菌酶，反復(fù)吹打重懸，置于37℃培養(yǎng)箱恒溫培養(yǎng)1h。分別加入350μL TE、30μL 10% 的SDS、20μL 蛋白酶K（20mg/mL），吹打混勻后65℃水浴10min。分別加入100μ L NaCl（5 mol/L）溶液、80μL CTAB，混勻后65℃水浴10min。加入等體積酚/氯仿/異戊醇（25∶24∶1），混勻，4℃條件下12 000r/min離心3min。將上清轉(zhuǎn)入新的離心管中。重復(fù)上一步，直到看不見界面為止，以除去多糖和其他污染的大分子。用等體積的氯仿/異戊醇抽提，混勻，4℃條件下12 000r/min離心3min。將上清轉(zhuǎn)入新管，加入0.6倍體積異丙醇，輕輕混勻至DNA沉淀，4℃條件下12 000r/min離心10min。除去上清液，加入1mL 70%乙醇進(jìn)行洗滌。4℃條件下10 000r/min離心2min。棄上清，干燥沉淀，重溶于20～50μL TE。

1.2.4 菌株16S rRNA 的擴(kuò)增

PCR擴(kuò)增采用50μL體系，其中DNA模板2.5μL，Mastermix（內(nèi)含酶及dNTPs等）25μL，引物UNIF、UNIR各1.25μL [UNIF：5′-AGAGTTTGATC (A/ C) TGGCTCAG-3′，UNIR：5′-TACGG (C/T) TACCTTGTTACGACTT-3′]，超純水20μL。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3min；94℃變性15s，52℃退火30s，72℃延伸40s，循環(huán)30次；再72℃延伸5min。采用瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物的片段大小是否正確。將檢驗正確的樣品用膠回收試劑盒 (Tiangen) 進(jìn)行PCR產(chǎn)物回收與純化。

將純化的樣品交北京奧科鼎盛生物技術(shù)有限公司測序，并將結(jié)果與Genebank 數(shù)據(jù)庫中的標(biāo)準(zhǔn)株進(jìn)行比對。

1.2.5 生長曲線的測定

將第三代的5株乳酸菌分別以2%接種于MRS液體培養(yǎng)基、M17液體培養(yǎng)基（只對球菌）和不同碳源（葡萄糖、半乳糖、乳糖）半合成培養(yǎng)基，在37℃和43℃下培養(yǎng)24h，每隔1h測一次OD值（波長600nm），每個樣品做3個平行。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株鑒定結(jié)果

表1 菌株鑒定結(jié)果

通過菌株分離、DNA提取、16S rDNA PCR擴(kuò)增，從發(fā)酵劑中成功獲得5株菌，分別為嗜熱鏈球菌C1-2，嗜熱鏈球菌C4，保加利亞乳桿菌LB3，嗜酸乳桿菌CM5和干酪乳桿菌CM1，見表1。

2.2 菌株在不同碳源條件下的生長情況

2.2.1 菌株對碳源的利用范圍

由圖1可知，從傳統(tǒng)酸奶分離得到的各菌株利用乳源碳源的范圍不同。其中，Streptococcus thermophilus C4、Lactobacillus acidophilusCM5可以在乳中常見的全部三種碳源中生長；Streptococcus thermophilus C1-2 可以在乳糖及葡萄糖中生長，而不能在半乳糖中生長；Lactobacillus casei CM1不能利用乳糖，而能利用半乳糖和葡萄。在本實驗條件下Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricusLB3生長速度緩慢，其原因可能在于該菌株對營養(yǎng)要求較高，實驗所用半合成培養(yǎng)基中的氮源不能滿足菌株生長的需要[11,12]。該菌株在酸奶發(fā)酵過程中的氮源營養(yǎng)可能依賴于其他菌株對乳蛋白的降解，所以在所研究復(fù)合發(fā)酵菌株體系內(nèi)可能還存在菌株間的氮源營養(yǎng)物質(zhì)的互作[13]。

表2 生長曲線參數(shù)

2.2.2 菌株在不同碳源中的生長速度

圖1 菌株在不同碳源中的生長曲線A:C1-2 B：C4 C:CM1 D:CM5 E:LB3

比較各菌株在不同碳源中的生長速度可知，Streptococcus thermophilus C1-2在葡萄糖中的生長速率高于乳糖；Streptococcus thermophilus C4在乳糖中的生長速率最大，其次為葡萄糖，最慢為半乳糖；Lactobacillus casei CM1在葡萄糖中的生長速率與在半乳糖中相近；Lactobacillus acidophilusCM5 在乳糖中的生長速率大于半乳糖，在葡萄糖中的生長速率最低。在不同糖中的生長速率可能反映了菌株在乳源環(huán)境中對多種碳源的選擇性。在發(fā)酵初期，乳中僅存在為降解的乳糖，在發(fā)酵過程中由于微生物的降解，乳糖逐步降解為半乳糖和葡萄糖[14]。所以利用乳糖最快的Streptococcus thermophilus C4 及Lactobacillus acidophilus CM5可能在發(fā)酵初期生長較快，在發(fā)酵末期生長較慢；而在葡萄糖和半乳糖中生長較快的Streptococcus thermophilus C1-2和 Lactobacillus casei CM1可能在發(fā)酵過程中隨著環(huán)境中的葡萄糖和半乳糖含量的增加生長速度逐步加快。尤其是不能利用乳糖的Lactobacillus casei CM1，只能利用其他菌株降解乳糖產(chǎn)生的葡萄糖和半乳糖。

2.2.3 在同類碳源中不同菌株的生長速度比較

在乳糖中能生長的菌株包括：Streptococcus thermophilus C4，Streptococcus thermophilus C1-2 和Lactobacillus acidophilusCM5。就生長速度而言，Streptococcus thermophilus C4大于Streptococcus thermophilus C1-2。在半乳糖中能生長的菌株為Lactobacillus casei CM1大于Streptococcus thermophilus C4。各菌株均能在葡萄糖中生長，Lactobacillus casei CM1生長速度最快，Lactobacillus acidophilusCM5生長速度最慢。

2.2.4 在同類碳源中不同菌株的生長遲滯期比較

遲滯期代表菌株開始生長的時間，預(yù)示在發(fā)酵劑中開始起作用的時間。從表2中可以看到，在乳糖中生長速率較大的兩株嗜熱鏈球菌C4和C1-2相比，C4的遲滯期較短，所以C4可能是在發(fā)酵過程中最早發(fā)揮作用的菌株。在葡萄糖中CM1的遲滯期短于C1-2，在半乳糖中CM1的遲滯期短于C4。

3 結(jié)論

結(jié)合菌株利用碳源的范圍，在不同碳源中的生長速度及生長的遲滯期，對菌株間碳源間的互作關(guān)系進(jìn)行預(yù)測：嗜熱鏈球菌C4在乳糖中的遲滯期最短(1.30±0.02)，可能是發(fā)酵過程中最先發(fā)揮作用的菌株，其降解乳糖產(chǎn)生的葡萄糖和半乳糖供干酪乳桿菌CM1生長(2.84±0.16)，隨后嗜熱鏈球菌C1-2利用乳糖生長（2.89±0.22）。在此發(fā)酵劑菌株中C4菌株為發(fā)酵產(chǎn)酸的關(guān)鍵菌株，其快速產(chǎn)酸能力可促進(jìn)產(chǎn)品的凝乳，其降解乳糖產(chǎn)生葡萄糖和半乳糖供其他菌株生長；干酪乳桿菌CM1快速利用半乳糖和葡萄糖的能力可進(jìn)一步促進(jìn)產(chǎn)品的凝乳；產(chǎn)酸較慢的嗜熱鏈球菌C1-2是一株產(chǎn)黏的菌，能促進(jìn)酸奶組織狀態(tài)和良好質(zhì)地的形成。本研究對菌株利用碳源能力的分析為復(fù)合發(fā)酵劑的開發(fā)提供了有效數(shù)據(jù)。

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The Analysis of Utilization of Carbohydrates in Milk and the Predition of Their Cross-feeding of Starter Strains

SU Dun1,2, LIU Song-ling2, MA Yu-xuan2, WANG Ya-nan2, GE Shao-yang2, REN Fa-zheng2, YANG Zi-biao3, MU Zhi-shen1
(1.Inner Mongolia Mengniu Dairy (Group) Co., Ltd, Hohhot, 011500; 2.College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing Higher Instititution Engineering Research Center of Animal Product, Beijing 100083; 3.Dali Vocational and Technical College of Agriculture and Forestry Dali 671000)

Fermented milk is of favorable flavour, rich nutrition, and special function and is becoming the most popular production. The starter, the strains in the starter and their cross-feeding is the most important influence of the quality and propoerty of the fermented milk. In this study, we focused on the cross-feeding of the five strains from a cultural milk starter. The five strains all can ultilize glucose, Streptococcus thermophilus C4 and Cl-2 can ultilize lactose, Lactobacillus casei CM1 and Streptococcus thermophilus C4 can ultilize galctose. The growth rate and lag time were analyzed. The lag time of C4 in lactose is the shortest (1.30±0.02), then is the CM1 in glucose and galactose, and the third is C1-2 in lactose. It is predicted that C4 is the key strain in the starter which is responsible for the acidifiction in the fermentation. The glucose and galactose from the degradation of lactose by C4 is the substract of CM1, which reinforce the acidifying rate. C1-2 is viscosity producing strain and help improve structre characterics.

Starter; Fermented milk; Streptococcus thermophilus; Lactobacillus casei

TS252.1

A

1004-4264（2017）04-0048-05

10.19305/j.cnki.11-3009/s.2017.04.013

2016-12-05

云南省科技計劃生物重大專項（奶業(yè)專項）（2014ZA001）；北京市教育委員會中央在京高校重大成果轉(zhuǎn)化項目“益生菌生產(chǎn)關(guān)鍵技術(shù)科技成果轉(zhuǎn)化”。

蘇敦（1983-），女，博士，研究方向為乳品微生物。

母智深（1968-），男，研究員，博士，研究方向為乳品微生物。