周浩，上官愛(ài)哨，南梁康，梁秋曼，張淑君

（華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)動(dòng)物遺傳育種與繁殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430070）

小鼠性染色體在精子發(fā)生過(guò)程中的轉(zhuǎn)錄活性與基因表達(dá)

周浩，上官愛(ài)哨，南梁康，梁秋曼，張淑君

（華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)動(dòng)物遺傳育種與繁殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430070）

小鼠性染色體在精子發(fā)生過(guò)程中經(jīng)歷了與常染色體不同的基因表達(dá)水平。性染色體在減數(shù)分裂過(guò)程中會(huì)發(fā)生轉(zhuǎn)錄失活（MSCI，meiotic sex chromosome inactivation），并且還會(huì)有部分基因表達(dá)(PSCR，postmeiotic sex chromosome repression)。本文綜述了小鼠性染色體在減數(shù)分裂過(guò)程中發(fā)生轉(zhuǎn)錄失活的過(guò)程及機(jī)制，然后利用最近的小鼠減數(shù)分裂后精細(xì)胞測(cè)序的RNA數(shù)據(jù)，對(duì)小鼠精子發(fā)生過(guò)程中起重要作用的Akap4、Cypt、Asb9基因進(jìn)行了功能描述。

精子發(fā)生；減數(shù)分裂；MSCI；PSCR

小鼠是哺乳動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中研究得比較多的動(dòng)物模型。近幾年有報(bào)道指出，小鼠精卵受精時(shí)精子攜帶RNA進(jìn)入卵細(xì)胞會(huì)調(diào)控卵子的表觀遺傳特征，進(jìn)而影響后代性狀。即后天雄性動(dòng)物的環(huán)境因素通過(guò)精子RNA也可以遺傳給后代改變后代表型。所以了解和借鑒小鼠性染色體在精子發(fā)生過(guò)程中的基因表達(dá)情況對(duì)改善奶牛等哺乳動(dòng)物的繁殖性能有重要意義。小鼠精子的發(fā)生是嚴(yán)密的周期過(guò)程，精原干細(xì)胞經(jīng)歷了兩次減數(shù)分裂，由雙倍體的精原干細(xì)胞分化成單倍體的精母細(xì)胞，再分化成圓形精細(xì)胞（RS，Round Sperm）。隨后在精子發(fā)生過(guò)程中，單倍體的圓形精細(xì)胞經(jīng)歷延長(zhǎng)過(guò)程形成長(zhǎng)形精細(xì)胞（ES，Elongated Sperm）。精細(xì)胞在這個(gè)過(guò)程中發(fā)生顯著的形態(tài)變化，如丟失一部分細(xì)胞質(zhì)，生成頂體和鞭毛，精細(xì)胞的核發(fā)生濃縮，包裹DNA的組蛋白逐步由魚精蛋白取代[1,2]。之前有研究通過(guò)H-uridineincorporation和放射自顯影技術(shù)觀察小鼠精子發(fā)生過(guò)程中基因的轉(zhuǎn)錄情況，發(fā)現(xiàn)減數(shù)分裂粗線期精細(xì)胞（PS，Pachytene Sperm）性染色體的轉(zhuǎn)錄活性被抑制[3]，這個(gè)過(guò)程稱為MSCI。而減數(shù)分裂完成后，在長(zhǎng)形精子形成過(guò)程中會(huì)有一部分性染色體的基因表達(dá)。這部分表達(dá)的基因逃脫了性染色體的抑制（PSCR），對(duì)減數(shù)分裂后長(zhǎng)形精細(xì)胞的形成起了重要的作用（圖1）。

圖1 精子生成過(guò)程中性染色體經(jīng)歷了MSCI和PSCR過(guò)程（注：PS-粗線期精母細(xì)胞；RS-圓形精細(xì)胞；ES-長(zhǎng)形精細(xì)胞）

精細(xì)胞經(jīng)歷發(fā)生過(guò)程后轉(zhuǎn)移到附睪中成熟，成熟的精子具有高密度的核結(jié)構(gòu)，細(xì)胞質(zhì)較少。精細(xì)胞核包含RNA轉(zhuǎn)錄酶和豐富的轉(zhuǎn)錄因子[4]，但是Grunewald研究發(fā)現(xiàn)在精子中沒(méi)有放射性的尿苷[1]，即證明在成熟的精細(xì)胞中沒(méi)有轉(zhuǎn)錄活性。現(xiàn)在有研究表明在精子中只有線粒體里存在轉(zhuǎn)錄和翻譯活性[5,6]。成熟的精子缺少28S 和18S rRNAs，它們是組成細(xì)胞質(zhì)核糖體80S的重要成分，80S核糖體是翻譯的主要細(xì)胞器[7]?？傮w上來(lái)說(shuō)，在成熟精子的細(xì)胞質(zhì)中是不具備轉(zhuǎn)錄和翻譯功能的。所以成熟精子中攜帶的RNA主要是精子發(fā)生過(guò)程中產(chǎn)生的并且大部分都是由這個(gè)過(guò)程遺留下來(lái)的。性染色體對(duì)精子的發(fā)育具有極其重要的作用，所以研究這個(gè)時(shí)間段性染色體基因的表達(dá)，對(duì)了解精子的生成過(guò)程及精子攜帶的轉(zhuǎn)錄本的作用有重要意義。

1 精子形成過(guò)程中性染色體的轉(zhuǎn)錄活性

在小鼠精細(xì)胞減數(shù)分裂的粗線期，XY染色體會(huì)形成一種特殊的結(jié)構(gòu)，稱之為XY小體，性染色體會(huì)在這一過(guò)程中轉(zhuǎn)錄失活[8～10]。性染色體轉(zhuǎn)錄失活會(huì)產(chǎn)生一個(gè)潛在的問(wèn)題，即精子發(fā)生過(guò)程中需要來(lái)自性染色體的基因參與，因此，所需的性染色體基因要么在MSCI過(guò)程之前轉(zhuǎn)錄，要么它們?cè)跍p數(shù)分裂后精子發(fā)生過(guò)程中擺脫轉(zhuǎn)錄抑制進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。已經(jīng)明確的是，雖然在MSCI后性染色體的基因大部分還是沉默不表達(dá)的，但是其中有一部分性染色體上的基因會(huì)擺脫轉(zhuǎn)錄抑制具有轉(zhuǎn)錄活性[11,12]。Gennady Margolin通過(guò)對(duì)小鼠精子發(fā)生波各個(gè)階段的精細(xì)胞進(jìn)行測(cè)序，證實(shí)了MSCI的存在[13]。之前有報(bào)道13%～18%的X染色體基因在小鼠減數(shù)分裂后的精細(xì)胞中表達(dá)。在作者的分析中，相對(duì)于X染色體，常染色體在減數(shù)分裂之后有46%～59%的基因表達(dá)，小鼠X染色體只有27%的基因表達(dá)。表1中列舉了作者在小鼠減數(shù)分裂后精細(xì)胞中測(cè)序得到的RNA（RPKM＞50，Reads Per Kilobases per Millionreads，RPKM為代表每百萬(wàn)reads中來(lái)自于某基因每千堿基長(zhǎng)度的reads數(shù)）。

表1 減數(shù)分裂后小鼠精細(xì)胞中高表達(dá)的RNA（RPKM＞50）

2 性染色體減數(shù)分裂時(shí)期的轉(zhuǎn)錄失活機(jī)制

在精細(xì)胞減數(shù)分裂過(guò)程中，性染色體形成的XY小體中也存在Xist RNA （Xist基因參與X染色體轉(zhuǎn)錄失活），這種現(xiàn)象與在雌雄動(dòng)物中存在一條不轉(zhuǎn)錄的X染色體一致，其中Xist RNA參與了對(duì)其轉(zhuǎn)錄失活的調(diào)控，Xist RNA招募一些蛋白復(fù)合物調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄失活的X染色體[14]。這種現(xiàn)象表示雄性動(dòng)物在減數(shù)分裂中性染色體失活，可能與雌性動(dòng)物一條X染色體失活的原理一樣[15]。雖然，研究已經(jīng)證實(shí)對(duì)于MSCI過(guò)程，Xist RNA并不能啟動(dòng)沉默和維持X染色體的失活[16,17]，但是目前也不排除可從其他方面導(dǎo)致X染色體失活。

關(guān)于XY小體形成的機(jī)制也有研究表明：在粗線期，BRCA1蛋白會(huì)招募ATP激酶，使H2AX蛋白磷酸化，隨后啟動(dòng)了一系列反應(yīng)導(dǎo)致染色體濃縮和轉(zhuǎn)錄抑制。與此相同的是，在雌性動(dòng)物失活的一條X染色體中，BRCA1蛋白和磷酸化的H2AX蛋白結(jié)合發(fā)生在S階段的細(xì)胞周期[18]。推測(cè)BRCA1蛋白和磷酸化的H2AX蛋白能快速招募各種各樣的修復(fù)因子和染色體重塑及整合特定的組蛋白。在雌性動(dòng)物中，這是維持X染色體失活所必須的[15,19]。在小鼠精細(xì)胞減數(shù)分裂期精細(xì)胞中的BRCA1蛋白和磷酸化H2AX（γН2АХ）蛋白，也能起快速形成性染色體失活結(jié)構(gòu)的作用。如，γН2АХ蛋白能招募Mre11和Rad50蛋白，這些蛋白涉及到染色體重組和核小體的替換[18,20]。但是，BRCA1蛋白和γН2АХ蛋白能引起X染色體失活的原理至今仍不清楚，確定的是BRCA1蛋白和磷酸化的H2AX蛋白會(huì)綁定在一些失活的基因上。另一方面，在小鼠的XY小體中還發(fā)現(xiàn)了MAEL蛋白可以與MILLI 和 MIWI蛋白作用，這些蛋白能對(duì)生殖細(xì)胞系的特異RNA起到干擾作用。這個(gè)過(guò)程也會(huì)參與到XY小體轉(zhuǎn)錄沉默的過(guò)程中。

3 常染色體的轉(zhuǎn)座補(bǔ)償

常染色體基因在減數(shù)分裂和減數(shù)分裂后階段的轉(zhuǎn)錄活性沒(méi)有很大變化。相比之下，性染色體基因經(jīng)歷了在減數(shù)分裂階段完全轉(zhuǎn)錄失活到減數(shù)分裂后部分轉(zhuǎn)錄失活的過(guò)程[12]。性染色體基因在減數(shù)分裂前期和減數(shù)分裂后對(duì)精子的發(fā)生和成熟有很重要的作用，雖然在減數(shù)分裂過(guò)程中缺乏作用，但是在MSCI過(guò)程中因阻斷了一部分X染色體上基因表達(dá)能阻斷重要的細(xì)胞生物過(guò)程，而正常的MSCI過(guò)程卻沒(méi)有對(duì)減數(shù)分裂造成干擾，這說(shuō)明可能這些基因能被常染色體上的轉(zhuǎn)座子基因替代表達(dá)，稱之為減數(shù)分裂時(shí)期常染色體對(duì)性染色體的表達(dá)補(bǔ)償。研究共發(fā)現(xiàn)14個(gè)只在睪丸中表達(dá)的轉(zhuǎn)座基因，它們的X連鎖轉(zhuǎn)座子是看家基因[21]。其中磷酸激酶就是一個(gè)例子，在人類的PGK1/PGK2中，PGK2定位于6號(hào)染色體，只在睪丸中表達(dá)，然而PGK1定位在X染色體，在任何組織都表達(dá)，但在MSCI時(shí)期沉默[22]，相反的是PGK2會(huì)在減數(shù)分裂終止時(shí)表達(dá)，補(bǔ)償在減數(shù)分裂后被抑制的PGK1基因。

4 在精子發(fā)生過(guò)程中性染色體的轉(zhuǎn)錄豐度

Akap4基因在減數(shù)分裂后X染色體上表達(dá)的豐度最高，為1006.81 RPKM. 其編碼的蛋白為A-激酶錨定蛋白4。Akap4基因編碼蛋白質(zhì)與纖維鞘的形成有關(guān)系，纖維鞘是一種細(xì)胞骨架，結(jié)構(gòu)位置在精子鞭毛的主段。敲除AKAP4基因的雄鼠，精子缺乏AKAP4蛋白，精子的數(shù)量雖沒(méi)有減少，但精子沒(méi)有向前的運(yùn)動(dòng)能力和缺失受精能力。雖然可以形成纖維鞘間葉原基，但完整的纖維鞘沒(méi)有形成，鞭毛不僅縮短，而且與纖維鞘相聯(lián)系的蛋白質(zhì)在數(shù)量上大幅減少。所以，AKAP4是維持纖維鞘完整性的支架蛋白，因?yàn)槿笔KAP4蛋白，與其相關(guān)聯(lián)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和糖酵解酶無(wú)法進(jìn)行，精子將失去能動(dòng)性[23]。Cypt基因編碼Cysteine-rich perinuclear theca蛋白，其中高表達(dá)的RNA中存在兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本Cypt8和Cypt3，Cypt的轉(zhuǎn)錄本由過(guò)渡蛋白Tnp2和魚精蛋白Prm1啟動(dòng)，這兩個(gè)蛋白都是涉及到精子的核濃縮，Cypt家族的蛋白可能與精子染色質(zhì)的形成和其核濃縮有關(guān)[24]。Asb9基因編碼Ankyrin repeat and SOCS box protein 9，這個(gè)基因是編碼錨定蛋白重復(fù)區(qū)和細(xì)胞因子傳導(dǎo)抑制因子家族成員之一。這個(gè)家族的成員可以通過(guò)SOCS域與延伸適配器B-C復(fù)合物相互作用，再與滯環(huán)蛋白相互作用，形成E3泛素連接酶復(fù)合物。它們可以起到介導(dǎo)底物識(shí)別E3泛素連接酶的作用[25]。減數(shù)分裂完成后，精子的形態(tài)發(fā)生很大的變化，這其中涉及很多蛋白降解過(guò)程。Asb9蛋白可能在其中起泛素化作用。

5 小結(jié)

性染色體作為染色體中特殊的一部分，在減數(shù)分裂中基因的表達(dá)與常染色體基因表達(dá)不一樣。Jacob L Mueller通過(guò)微陣列分析精子發(fā)生過(guò)程中基因的表達(dá)證實(shí)了X染色體在減數(shù)分裂過(guò)程中經(jīng)歷轉(zhuǎn)錄失活，后有約18%的X染色體重新恢復(fù)轉(zhuǎn)錄活性。而這部分基因主要是X染色體上的多拷貝基因，而具有重要作用的單拷貝基因即使不表達(dá)，與其同源的常染色體的基因也會(huì)表達(dá)對(duì)其進(jìn)行補(bǔ)償。Gennady Margolin 近些年通過(guò)對(duì)精子發(fā)生過(guò)程中細(xì)胞表達(dá)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，相對(duì)于常染色體在減數(shù)分裂之后有46%～59%的基因表達(dá)，小鼠X染色體只有27%表達(dá)。進(jìn)一步證實(shí)了小鼠生殖細(xì)胞減數(shù)分裂完成后性染色體只有部分表達(dá)。通過(guò)對(duì)作者在此階段細(xì)胞X染色體表達(dá)測(cè)序數(shù)據(jù)分析，根據(jù)Spermatogenesis和MGI數(shù)據(jù)庫(kù)中的注解，可以推測(cè)Akap4、Cypt、Asb9基因在減數(shù)分裂后期精子形成過(guò)程起了重要作用。隨著第三代轉(zhuǎn)錄組測(cè)序時(shí)代的到來(lái)，對(duì)精子發(fā)生過(guò)程中的各個(gè)時(shí)間段的精細(xì)胞進(jìn)行測(cè)序，將會(huì)得到精子發(fā)生過(guò)程中各個(gè)時(shí)間段染色體基因表達(dá)更為準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)，推進(jìn)對(duì)其表達(dá)RNA功能的了解。同樣，由于受精時(shí)精子攜帶RNA進(jìn)入卵細(xì)胞，攜帶的RNA會(huì)調(diào)控卵子的表觀遺傳特征，后天雄性動(dòng)物的環(huán)境因素通過(guò)精子也可以遺傳給后代改變后代表型。Upasna Sharma研究發(fā)現(xiàn)，親代小鼠飲食的蛋白質(zhì)含量會(huì)影響子代的表型[8]。未來(lái)，對(duì)已知種公牛RNA數(shù)據(jù)分析找出能影響其產(chǎn)奶量的RNA，通過(guò)調(diào)控RNA改善后代母牛的產(chǎn)奶量也是繁殖方面很有意義的課題。

[1] Grunewald S,Paasch U,Glander H, et al. Mature Human Spermatozoa Do Not Transcribe Novel Rna[J]. Andrologia, 2005, 37(2):69-71.

[2] Moldenhauer JS,Ostermeier GC,Johnson A, et al. Diagnosing Male Factor Infertility Using Microarrays[J]. Journal of Andrology, 2003, 24(6):783-789.

[3] Dadoune J,Siffroi J,Alfonsi M. Transcription in Haploid Male Germ Cells[J]. International Review of Cytology, 2004, 237(3):1-56.

[4] Pittoggi C,Magnano AR,Sciamanna I, et al. Specific Localization of Transcription Factors in the Chromatin of Mouse Mature Spermatozoa[J]. Molecular Reproduction and Development, 2001, 60(1):97-106.

[5] Maclaughlin J,Terner C. Ribonucleic Acid Synthesis By Spermatozoa From the Rat and Hamster[J]. Biochemical Journal, 1973, 133(4):635-639.

[6] Miller D,Ostermeier GC. Towards a Better Understanding ofRna Carriage By Ejaculate Spermatozoa[J]. Human Reproduction Update, 2006, 12(6):757-767.

[7] Cappallo-obermann H,Schulze W,Jastrow H, et al. Highly Purified Spermatozoal Rna Obtained By a Novel Method Indicates an Unusual 28s/18s Rrna Ratio and Suggests Impaired Ribosome Assembly[J]. Molecular Human Reproduction, 2011, 17(11):669-678.

[8] Sharma U,Conine CC,Shea JM, et al. Biogenesis and Function of Trna Fragments During Sperm Maturation and Fertilization in Mammals[J]. Science, 2016, 351(6271):391-396.

[9] Turner JM. Meiotic Sex Chromosome Inactivation[J].Development, 2007, 134(10):1823-1831.

[10] Burgoyne PS,Mahadevaiah SK,Turner JM. The Consequences of Asynapsis for Mammalian Meiosis[J]. Nature Reviews Genetics, 2009, 10(3):207-216.

[11] Namekawa SH,Park PJ,Zhang L, et al. Postmeiotic Sex Chromatin in the Male Germline of Mice[J]. Current Biology, 2006, 16(7):660-667.

[12] Mueller JL,Mahadevaiah SK,Park PJ, et al. The Mouse X Chromosome Is Enriched for Multicopy Testis Genes Showing Postmeiotic Expression[J]. Nature Genetics, 2008, 40(6):794-799.

[13] Margolin G,Khil PP,Kim J, et al. Integrated Transcriptome Analysis of Mouse Spermatogenesis[J]. Bmc Genomics, 2014, 15(1):1.

[14] Heard E,Disteche CM. Dosage Compensation in Mammals: Fine-tuning the Expression of the X Chromosome[J]. Genes & Development, 2006, 20(14):1848-1867.

[15] Ayoub N,Richler C,Wahrman J. Xist Rna Is Associated with the Transcriptionally Inactive Xy Body in Mammalian Male Meiosis[J]. Chromosoma, 1997, 106(1):1-10.

[16] Mccarrey JR,Watson C,Atencio J, et al. X-chromosome Inactivation During Spermatogenesis Is Regulated By an Xist/ tsix-independent Mechanism in the Mouse[J]. Genesis, 2002, 34(4):257-266.

[17] Turner JM,Mahadevaiah SK,Elliott DJ, et al. Meiotic Sex Chromosome Inactivation in Male Mice with Targeted Disruptions of Xist[J]. Journal of Cell Science, 2002, 115(21): 4097-4105.

[18] Fernandez-capetillo O,Mahadevaiah SK,Celeste A, et al. H2ax Is Required for Chromatin Remodeling and Inactivation of Sex Chromosomes in Male Mouse Meiosis[J]. Developmental Cell, 2003, 4(4):497-508.

[19] Shevchenko A,Pavlova S,Dementyeva E, et al. Chromatin Modifications During X-chromosome Inactivation in Female Mammals[J]. Russian Journal of Genetics, 2006, 42(9):1019-1029.[20] Van attikum H,Gasser SM. The Histone Code at Dna Breaks: a Guide to Repair?[J]. Nature Reviews Molecular Cell Biology, 2005, 6(10):757-765.

[21] Wang PJ. X Chromosomes, Retrogenes and Their Role in Male Reproduction[J]. Trends in Endocrinology & Metabolism, 2004, 15(2):79-83.

[22] Mccarrey JR,Thomas K. Human Testis-specific Pgk Gene Lacks Introns and Possesses Characteristics of a Processed Gene[J].Nature, 1987, 326(6112):501-505.

[23] Miki K,Willis WD,Brown PR, et al. Targeted Disruption of the Akap4 Gene Causes Defects in Sperm Flagellum and Motility[J].Developmental Biology, 2002, 248(2):331-342.

[24] Elliot MK. Tales of Parenthood From the Crypt: the Predicament of the Posthumously Conceived Child[J]. Real Prop. Prob. & Tr.J., 2004, 39(4):47.

[25] Kwon S,Kim D,Rhee JW, et al. Asb9 Interacts with Ubiquitous Mitochondrial Creatine Kinase and Inhibits Mitochondrial Function[J]. Bmc Biology, 2010, 8(1):1.

The Transcription of Sex Chromosome of Mouse in Spermatogenesis

ZHOU Hao, SHANGGUAN Ai-shao, NAN Liang-kang, LIANG Qiu-man, ZHANG Shu-jun
(Key Laboratory of Agricultural Animal Genetics, Breeding and Reproduction, Education Ministry of China, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070)

The mouse sex chromosomes exhibit a different degree of expression as autosomal genes in spermatogenesis. Mouse sex chromosomes become transcriptional inactivation at meiosis (MSCI). But after meiosis, post-meiotic sex chromosome repression (PSCR) is incomplete, it still has expression of some genes. This paper reviews transcriptional inactivation process and mechanism of mouse chromosomes during meiosis and choose Akap4, Cypt, Asb9 from recent RNA sequencing data of mouse germ cell at post meiosis, to show their important role in spermatogenesis.

Spermatogenesis; Meiosis; MSCI; PSCR

S823.3

A

1004-4264（2017）04-0017-04

10.19305/j.cnki.11-3009/s.2017.04.005

2016-11-20

周浩（1992-），男，碩士研究生。

張淑君，教授。