摘要：質(zhì)譜技術(shù)是抗體藥物分析最重要的技術(shù)手段之一。本文簡(jiǎn)述了抗體藥物的發(fā)展和質(zhì)譜技術(shù)的原理。對(duì)于質(zhì)譜技術(shù)在抗體藥物的分析中應(yīng)用進(jìn)行了歸類整理，主要分為在一級(jí)結(jié)構(gòu)和高級(jí)結(jié)構(gòu)分析中的應(yīng)用。

關(guān)鍵詞：抗體藥物 質(zhì)譜 一級(jí)結(jié)構(gòu) 高級(jí)結(jié)構(gòu)

單克隆抗體藥物的發(fā)展起源于1975年，Kohler 和Milstein 創(chuàng)立雜交瘤技術(shù)，為大量制備鼠源單克隆抗體提供了技術(shù)條件，開創(chuàng)了大規(guī)模制備單克隆抗體時(shí)代?？贵w類藥物是指含有抗體片段的蛋白類藥物，所以在惡性腫瘤、自身免疫性疾病、心血管疾病、感染和器官移植排斥等重大疾病上得到了快速的發(fā)展，是當(dāng)前生物藥物領(lǐng)域增長(zhǎng)最快的一類藥物。[1]

1.抗體藥物發(fā)展新趨勢(shì)

在生物藥物領(lǐng)域，抗體藥物占據(jù)著越來(lái)越重要的地位，2015年全球銷售排名前10 位的藥物中有6 個(gè)為抗體藥物，分別是humira、enbrel、remicade、rituxan、avastin和Herceptin?？贵w藥物按來(lái)源分類可以分為：鼠源單克隆抗體、人鼠嵌合抗體、人源化抗體和全人源抗體。目前，F(xiàn)DA 批準(zhǔn)的單克隆抗體藥物中，人源化單抗和全人源單抗數(shù)量已占據(jù)72%[2]

1.1抗體藥物偶聯(lián)物（ADC）

抗體藥物偶聯(lián)物（ADC）由單克隆抗體和小分子化合物兩部分組成。通過(guò)抗體的靶向作用，ADC 的抗體部分和腫瘤細(xì)胞表面抗原特異性識(shí)別并結(jié)合，通過(guò)細(xì)胞內(nèi)吞作用，將抗體和小分子化合物一起帶進(jìn)腫瘤細(xì)胞內(nèi)部，釋放出小分子化合物。[3]這樣既可以降低小分子藥物的毒性，同時(shí)具有靶向結(jié)合的作用。已經(jīng)上市的兩個(gè)ADC是Kadyla和Adcetris。

1.2雙特異性抗體（BsAb）

雙特異性抗體（BsAb）是含有兩種特異性抗原結(jié)合位點(diǎn)的人工抗體，能在靶細(xì)胞和功能分子（細(xì)胞）之間架起橋梁，。由于基因工程的發(fā)展，目前雙特異性抗體已經(jīng)研發(fā)出多種類型[4]，主要類型有三功能雙特異性抗體、IgG-scFv、三價(jià)雙特異性分子、串聯(lián)單鏈抗體（串聯(lián)scFv）、DVD-Ig 等多種形式。

2.質(zhì)譜技術(shù)

近年來(lái)質(zhì)譜儀性能的顯著改進(jìn)主要基于開發(fā)出的兩種離子化技術(shù)：一種是介質(zhì)輔助的激光解吸/離子化[5]技術(shù)。另一種是電噴霧離子化[6]技術(shù)。由于這兩種電離技術(shù)的出現(xiàn)，使原本只能檢測(cè)小分支的質(zhì)譜技術(shù)，可以運(yùn)用于檢測(cè)生物大分子。

在過(guò)去質(zhì)譜技術(shù)主要運(yùn)用于對(duì)一級(jí)結(jié)構(gòu)和序列的表征，而現(xiàn)在質(zhì)譜技術(shù)越來(lái)越多地運(yùn)用于高級(jí)結(jié)構(gòu)的分析，而高級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)于抗體藥物的生物活性至關(guān)重要。

3.質(zhì)譜技術(shù)在抗體藥物一級(jí)結(jié)構(gòu)分析中的應(yīng)用

3.1完整抗體藥物精確分子量測(cè)定

當(dāng)?shù)玫娇贵w藥物時(shí)，可以直接通過(guò)高分辨率的MALDI-TOF或者ESI-MS進(jìn)行分子量的檢測(cè)。通過(guò)對(duì)于脫糖后分子量的檢測(cè)，可以對(duì)于抗體藥物進(jìn)行初步定性分析，并將可以作為藥物常規(guī)放行的分析方法[7]。對(duì)于脫糖前的抗體藥物進(jìn)行分析，可以得到抗體藥物的糖基化類型的信息及糖基化水平的分布[8]，對(duì)于快速了解生產(chǎn)工藝與藥物質(zhì)量的關(guān)系具有十分重要的意義。

3.2藥物抗體偶聯(lián)比（DAR）

對(duì)于賴氨酸鏈接的抗體偶聯(lián)藥物，采用C4 色譜柱及聯(lián)用的質(zhì)譜對(duì)去糖基化樣品進(jìn)行分析，根據(jù)偶聯(lián)不同數(shù)目藥物分子的質(zhì)量數(shù)增加判斷偶聯(lián)數(shù)目[9]。對(duì)于質(zhì)譜測(cè)定的結(jié)果，不僅可以給出確切的藥物抗體偶聯(lián)比值，更能夠給出鏈接不同個(gè)小分子藥物的分布情況，及反應(yīng)過(guò)程副產(chǎn)物空鏈接頭的分布情況。[10]

3.3肽指紋圖譜

蛋白被特異酶切微店的蛋白酶水解后得到的肽片段質(zhì)量圖譜。由于不同的抗體藥物具有不同的氨基酸序列，蛋白質(zhì)被酶水解后，產(chǎn)生的肽片段也各不相同，肽混合物的質(zhì)量數(shù)醫(yī)具有指紋特征?？梢酝ㄟ^(guò)LC-ESI-MS進(jìn)行肽片段的一級(jí)質(zhì)量數(shù)的鑒定，也可以通過(guò)LC-ESI-MS/MS對(duì)于每個(gè)肽片段進(jìn)行進(jìn)一步確證，提高肽指紋圖譜的準(zhǔn)確性。

3.4翻譯后修飾研究

蛋白質(zhì)的翻譯后修飾（PTM）對(duì)于抗體藥物的生物學(xué)功能十分重要。常見(jiàn)的翻譯后修飾有：磷酸化、脫酰胺、甲硫氨酸氧化、糖基化修飾、N 端焦谷氨酸環(huán)化，C 端賴氨酸切除等。質(zhì)譜分析儀檢測(cè)蛋白和肽片段的分子量偏差，可以實(shí)現(xiàn)高靈敏、高通量和高精確地鑒別蛋白質(zhì)的翻譯后修飾的種類。[11]

3.5 N端氨基酸序列檢測(cè)

常規(guī)N端氨基酸檢測(cè)用Edman 降解法進(jìn)行檢測(cè)，但是抗體藥物有時(shí)候會(huì)出現(xiàn)N端環(huán)化的現(xiàn)象，在這種情況下用Edman 降解法需要先對(duì)抗體進(jìn)行去封閉處理，而直接使用質(zhì)譜可以直接測(cè)出N端的氨基酸序列，同時(shí)可以檢測(cè)出N端環(huán)化的相對(duì)比例。[12]

4.質(zhì)譜技術(shù)在抗體藥物高級(jí)結(jié)構(gòu)分析中的應(yīng)用

4.1氫/氘交換質(zhì)譜（HDX-MS）

常規(guī)的質(zhì)譜只能獲得蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)信息。氫/氘交換質(zhì)譜（HDX-MS）可以進(jìn)行蛋白質(zhì)構(gòu)象，溶液動(dòng)力學(xué)和表位映射進(jìn)行分析。在能夠調(diào)查的蛋白質(zhì)的高階結(jié)構(gòu)和動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)技術(shù)中，HDX-MS已經(jīng)證明適合單克隆抗體和單克隆抗體 - 抗原復(fù)合物的構(gòu)象分析。

4.2離子淌度質(zhì)譜法（IM-MS）。

離子淌度是根據(jù)蛋白的電荷和形狀選擇性分離的方法，可以區(qū)分相同分子量的蛋白和肽段，可用于檢測(cè)蛋白的簡(jiǎn)單高級(jí)結(jié)構(gòu)。

4.3高分辨率傅立葉變換離子回旋共振質(zhì)譜（FTICR-MS）

高分辨率傅立葉變換離子回旋共振質(zhì)譜（FTICR-MS）能夠檢測(cè)最高質(zhì)量數(shù)的質(zhì)譜儀器，并且有著很高的分辨率。FTICR-MS是目前被公認(rèn)為是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的有力工具，特別是和完整的蛋白質(zhì)鑒定和上/下調(diào)翻譯后修飾（PTM）蛋白質(zhì)的鑒定。

4.小結(jié)

隨著抗體藥物的不斷發(fā)展，需要對(duì)于抗體藥物的結(jié)構(gòu)信息不斷進(jìn)行深入的分析，質(zhì)譜技術(shù)也隨著這一要求不斷進(jìn)步。在現(xiàn)階段，由于生物質(zhì)譜分析的成本很高，并且對(duì)于人員的要求比較高，所以使其應(yīng)用受到了限制。當(dāng)然隨著技術(shù)的進(jìn)步，可以預(yù)見(jiàn)質(zhì)譜分析會(huì)越來(lái)越多地運(yùn)用于抗體分析中，特別是在高級(jí)結(jié)構(gòu)分析的領(lǐng)域，通過(guò)質(zhì)譜分析，可以讓我們更多獲得高級(jí)結(jié)構(gòu)的信息，這對(duì)于抗體藥物的分析是極為重要的。

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作者簡(jiǎn)介：高燕波（1990～），女，研究方向?yàn)榭贵w藥物研發(fā)。正在攻讀上海交通大學(xué)生物工程專業(yè)碩士；Email：gaoyanbo_1990@163.com