高立容，于慧，周井祥

（1.長春市水產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測中心，吉林 長春 130033；2.吉林農(nóng)業(yè)大學動物科學技術(shù)學院，吉林 長春 130118）

白山市鴨綠江網(wǎng)箱養(yǎng)鯉冰下爆發(fā)錦鯉皰疹病毒病的鑒定

高立容1，于慧2，周井祥2

（1.長春市水產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測中心，吉林 長春 130033；2.吉林農(nóng)業(yè)大學動物科學技術(shù)學院，吉林 長春 130118）

錦鯉皰疹病毒?。↘io herpesvirus disease，KHVD）是由錦鯉皰疹病毒（Kio herpesvirus，KHV）引起的鯉（Cyprinus carpio L）、錦鯉、框鏡鯉的一種高傳染率和致死率的疾病，發(fā)病季節(jié)多為春秋季，常發(fā)水溫為18～28℃。2015年3月初，低溫條件下，吉林省白山市鴨綠江某網(wǎng)箱養(yǎng)殖場鯉魚大量死亡，其因不明。本實驗采用PCR方法進行鑒定，對其編碼的膜糖蛋白基因ORF25和囊膜蛋白ORF81基因進行檢測，測序結(jié)果顯示該病毒的目的基因片段與KHV-cj同源性達96%。綜上所述，可判定該養(yǎng)殖場鯉爆發(fā)的疾病為錦鯉皰疹病毒病。目前該病在低溫下爆發(fā)的報道還比較少，因此本實驗為錦鯉皰疹病毒病爆發(fā)的溫度條件提供了參考，同時也為該病的防治提出了一些措施及建議。

錦鯉皰疹病毒；網(wǎng)箱養(yǎng)殖；冰下

錦鯉皰疹病毒病是由錦鯉皰疹病毒引起的一種急性魚類傳染性疾病，1997年在以色列首次發(fā)現(xiàn)，曾在瑞典、英國、德國、美國、印尼和中國臺灣等十幾個國家和地區(qū)先后傳播與流行[1-5]。從2003年開始，我國東北地區(qū)的框鏡鯉和普通鯉魚爆發(fā)該病，病死率高達80%～90%。錦鯉皰疹病毒病是世界動物衛(wèi)生組織（Office International Des Epizooties，OIE）必報疫病。由于其傳染性強與致死率高，2007年我國質(zhì)檢總局將錦鯉皰疹病毒作為必檢項目。

錦鯉皰疹病毒為雙股的線形DNA病毒，是魚類皰疹病毒中基因組最大的病毒[6]。錦鯉皰疹病毒有156個開放性閱讀框（ORF），研究較多的有ORF25、ORF81和ORF83，這些基因主要在細胞質(zhì)中表達，ORF25主要編碼膜糖蛋白，ORF81主要編碼囊膜蛋白[7-9]，因此本實驗采用ORF25和ORF81兩個基因進行檢測。

錦鯉皰疹病毒病在水溫為18～28℃時多發(fā)，該病鮮少有在低溫下爆發(fā)的報道。2015年3月初，吉林省白山市鴨綠江某網(wǎng)箱養(yǎng)殖場鯉魚出現(xiàn)不明原因大量死亡情況，病魚體色暗淡、灰白色、眼微凹，初步判定為錦鯉皰疹病毒病，實驗室從該養(yǎng)殖場采集病魚樣品，進行實驗室鑒定。

1 材料

1.1 病料來源

2015年3月初，實驗室從白山市鴨綠江某網(wǎng)箱養(yǎng)殖場采集病鯉。該批病鯉平均體質(zhì)量為（1 200± 15）g，平均體長為（28±2）cm。

1.2 實驗試劑

試劑主要有：蛋白酶K、無水乙醇、70%乙醇、液氮、裂解緩沖液（Tris-HCl、NaCl、EDTA、SDS）、氯仿∶異戊醇=24∶1（Tris-HCl、EDTA）、PBS緩沖液、苯酚∶氯仿∶異戊醇=25∶24∶1、Tris飽和酚、TE溶液、瓊脂糖（Biowest Spain）、D2000 Marker（北京Solarbio科技有限公司）、瓊脂糖凝膠回收試劑盒（AxygenBiosciences）。

1.3 實驗儀器

無菌解剖刀、無菌剪刀、研缽、梯度PCR儀、離心機、（Eppendorf AG 22331 Hamburg）、電泳槽及電泳儀（北京六一儀器公司）、凝膠成像系統(tǒng)（GelDoc-It 310 Imaging system）。

2 方法

2.1 臨床診斷

2.1.1 視檢觀察病魚體表對其癥狀進行初步判定。

2.1.2 剖檢將病魚解剖，觀察其內(nèi)臟等器官病變情況。

2.2 實驗室診斷

2.2.1 腎臟組織病毒基因組提取將患病鯉魚解剖取腎組織，用適量PBS緩沖液沖洗干凈，無菌剪刀剪碎，放入研缽加液氮研磨成粉末。參照文獻[10]改進方法：①取粉末于2 mL Eppendof管中。②加蛋白酶K和裂解緩沖液在56℃水浴中4 h。③加入等體積的Tris飽和酚，混合均勻后10 000 r/min離心10 min，取上層液。④加入等體積苯酚∶氯仿∶異戊醇=25∶24∶1溶液，混合均勻后離心取上清液。⑤在上清液中加入等體積的氯仿：異戊醇=24∶1溶液，輕輕搖勻，10 000 r/min，5 min，離心棄去上清液。⑥加入2.5倍體積的無水乙醇靜置后再加入70%乙醇，離心棄去乙醇。⑦加TE溶液溶解過夜。

2.2.2 PCR擴增及鑒定根據(jù)GenBank公布的KHV全基因序列中ORF81設計的引物為P1：5'-GGATCCATGGCAGTCACCAAAG-3'；P2：5'-GTCGACTCACCACATCTTGCCG-3'；ORF25設計的引物為P1：5'-GATATCATGACGGGTTGTGGGGTT-3'；P2：5'-GAATTCTTAGGGCCTCCGGGA-3'。PCR擴增產(chǎn)物預期分別為771 bp，144 bp。

參照朱霞等[11]病毒DNA提取方法提取病毒DNA并進行PCR擴增。ORF81PCR反應條件：預變性95℃5 min；變性94℃40 s；退火64.5℃30 s；延伸72℃1 min；共30個循環(huán)。ORF25PCR反應條件：預變性95℃5 min;變性94℃40 s；退火60℃30 s；延伸72℃1 min；共30個循環(huán)。產(chǎn)物于4℃下保存。

2.2.3 目的基因的回收配置1%瓊脂糖凝膠進行電泳，電泳后切下目的片段，用瓊脂糖凝膠回收試劑盒（AxygenBiosciences）[12]回收目的片段。

2.2.4 目的片段測序取ORF81回收產(chǎn)物20 μL送到上海生工生物技術(shù)有限公司測序。

3 結(jié)果與分析

3.1 患病魚主要癥狀

通過視檢觀察，體表通常會出血，局部會潰瘍，鱗片松動甚至脫落；鰓蓋鰓絲出血，鰓絲末端糜爛壞死；鰭條部分充血、出血，尾鰭通常有白色黏液覆蓋；病魚肛門發(fā)紅腫脹。剖檢可見：病魚血液在幾秒時間內(nèi)迅速凝固；腸道發(fā)硬充血，膽囊萎縮，膽汁顏色加深；肝臟、腎臟腫大伴有出血點，肝臟易碎。見圖1。

3.2 PCR擴增結(jié)果

以患病鯉魚的腎臟DNA為模板，根據(jù)設計的引物來進行PCR擴增并通過瓊脂凝膠系統(tǒng)檢測。在電泳圖上顯示擴增出大約771 bp（圖2）與144 bp的目的片段（圖3）。初步判定該養(yǎng)殖場鯉魚患上的是錦鯉皰疹病毒病。

3.3 ORF81目的片段測序結(jié)果

將ORF81回收產(chǎn)物送至上海生工生物技術(shù)有限公司測序，結(jié)果如圖4，經(jīng)過BLAST比對，如圖5。測序結(jié)果和KHV-cj開放閱讀框ORF81相應序列同源性達到96%?？梢源_定該養(yǎng)殖場鯉魚患上的是錦鯉皰疹病毒病。

4 討論

通過臨床診斷和實驗室診斷，可以確定該養(yǎng)殖場鯉魚感染的是錦鯉皰疹病毒病。據(jù)報道[13]錦鯉皰疹病毒病在我國東北三省的發(fā)病水溫在18～30℃之間，鮮少有在冰下發(fā)病的報道，在3月份吉林省的水體還處于冰凍狀態(tài)，因此實驗結(jié)果表明了錦鯉皰疹病毒病可以在低溫下爆發(fā)。打破了常規(guī)認為的溫度范圍，在目前對于該病的感染機制尚未明確的情況下，為該病爆發(fā)的溫度條件提供了一定的參考，為生產(chǎn)上預防治療提供了方向，對于其感染機制的研究具有一定的參考價值。

目前我國對錦鯉皰疹病毒病的研究尚處于發(fā)展階段，對其感染機制等生物學信息還需深入研究，并且仍然沒有一個有效的治療方法，因此對于該病仍以預防為主，建議采取綜合防治方法：①開展流行病學調(diào)查，調(diào)查該病易發(fā)條件，及時預警，發(fā)現(xiàn)立即上報；②加強檢測檢疫，堅決不從疫區(qū)引進苗種；③在飼養(yǎng)管理上注意消毒，改善養(yǎng)殖水體，控制病原，馴化加強魚類體質(zhì)；④發(fā)現(xiàn)病魚及時隔離。對該養(yǎng)殖場建議在發(fā)病季節(jié)前適當投喂免疫增強劑，加強鯉魚體質(zhì)；注意消毒養(yǎng)殖環(huán)境和養(yǎng)殖工具，養(yǎng)殖工具不混用；減少魚類應激；發(fā)現(xiàn)死魚及時清除，加漂白粉或生石灰作深埋處理；封冰季節(jié)及時清除冰上積雪，保證充足溶氧。

圖1 患病魚圖片

圖2 PCR擴增目的片段電泳圖

圖3 PCR擴增目的片段電泳圖

圖4 目的基因序列

圖5 BLAST比對結(jié)果

[1]Gilad O，Yuns，Andree B.Initial characterristics of Kio herpersvirus and development of a polymerase chain reaction assay to detect the virus in Kio，Cyprinus carpio Kio[J].Dis Aqua Org，2002，48（2）：101-108.

[2]劉葒，史秀杰，高隆英，等.進口錦鯉爆發(fā)病病原的nested-PCR鑒定[J].華中農(nóng)業(yè)大學學報，2002，21（5）：414-418.

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[7]朱霞，王好，周井祥，等.錦鯉皰疹病毒病的研究進展[J].中國獸醫(yī)科學，2011，41（1）：106-110.

[8]孟慶峰，錢愛東，王偉利.檢測錦鯉皰疹病毒方法的研究進展[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2012（17）：27-29.

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[10]叢娟，張清元，李建民，等.PCR檢測技術(shù)中石蠟包埋組織DNA提取方法比較[J].腫瘤研究與臨床，1999，11（2）：86.

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[12]邢程，王好，周井祥，等.一例冰下低溫爆發(fā)的錦鯉皰疹病毒病的鑒定[J].水產(chǎn)學雜志，2014（01）：46-49.

[13]劉敏，唐紹林，張恒.鯉魚患錦鯉皰疹病毒病的診斷和防控[J].科學養(yǎng)魚.2012（12）：61-62.

Identification of Koi herpesvirus disease outbreak under ice in carp cage cultured in baishan，the Yalu River

Gao Lirong1，Yu Hui2，Zhou Jingxiang2
（1.Changchun city aquatic products quality and safety testing center，Changchun 130118，China；2.College of Animal Science and Technology，Jilin Agricultural University，Changchun 130118，China）

Koi herpesvirus disease（Kio herpesvirus diseases，KHVD）is a koi herpesvirus（Kio herpesvirus，KHV）of carp（Cyprinus），brocade carp，frame mirror carp a high infection rate and fatality rate of disease，pathogenesis season is age season more，often send water temperature for 18 to 28℃.In early March 2015，under the conditions of low temperature，a large amount of carp died in a cage farm in Yalu River，Baishan City，Jilin Province and the reason was unknown.In this study，the polymerase chain reaction（PCR）was used to identify the membrane glycoprotein gene ORF25 and envelope protein ORF81 gene，the purpose of the sequencing results showed that the virus gene fragment and KHV-cj homology of 96%.In summary，it could be determine the outbreak of the farm carp disease for Koi herpes virus disease.At present，the disease has been reported at low temperature，so this experiment provides a reference for the temperature condition of Kio herpesvirus outbreak，and also puts forward some measures and suggestions for the prevention and cure of the disease.

Kio herpesvirus；cage culture;under-ice

S943

A

1004-2091（2017）04-0007-05

10.3969/j.issn.1004-2091.2017.04.002

2016-06-14）

吉林省科技發(fā)展計劃疫苗研制與示范（20120228）

高立容（1965-），女，高工，研究方向為水產(chǎn)養(yǎng)殖.E-mail：412733526@qq.com

周井祥（1965-），男，正高.E-mail：zhjxnd@126.com